一种检测曼氏裂头蚴的特异性PCR方法及其试剂盒

摘要

本发明属于水产病害检测技术领域，具体公开了一种检测曼氏裂头蚴的特异性PCR方法及其试剂盒。本发明根据曼氏裂头蚴的COX1保守序列设计了多组引物，然后从这多组引物中筛选到一组特异性特别强的引物，该组引物序列在现有技术中从未报道过，而且这组引物的特异性比其他组引物的特异性强，因此采用这组引物制备的检测试剂具有特异性强、灵敏度高的特点，这样能准确鉴别曼氏裂头蚴。

说明书

技术领域

 本发明涉及水产病害检测技术领域，更具体地，涉及一种检测曼氏裂头蚴的特异性PCR方法及其试剂盒。

背景技术

 曼氏裂头蚴病是由曼氏迭宫绦虫的中绦期的幼虫寄生于人体组织器官引起的人畜共患寄生虫病。曼氏裂头蚴主要寄生在蛇和青蛙的皮下组织、肌肉、胸腹腔等处。该病在世界各地均有发生，主要分布于东亚和东南亚各国，在欧洲、美洲和非洲也有病例报道。在我国各省均有报道。近年来，由于某些人的饮食习惯改变，人体感染曼氏裂头蚴的病例数均有显著增多趋势。

    曼氏裂头蚴虫体小，绦虫典型特征不明显，形态特征与其他裂头蚴相似，肉眼和显微镜检测存在主观性强，对操作者的技术和经验的要求高的特点。相比较而言，PCR方法简单、客观、灵敏度高，精确性强。线粒体DNA作为一种核外遗传物质，与核DNA相比，具有分子量小，结构简单、进化速度快等特点，是研究寄生虫分子分类、分子鉴定、系统进化的一种很好的分子标记。利用线粒体DNA的细胞色素C氧化酶第一亚基的序列设计特异性引物是可行。

发明内容

 本发明为了克服现有技术中检测曼氏裂头蚴存在方法费时、主观性强的技术缺陷，提供一对检测曼氏裂头蚴的引物。

本发明的另一个目的是提供一种检测曼氏裂头蚴的非疾病诊断的PCR方法。

本发明的再一个目的是提供一种检测曼氏裂头蚴的PCR试剂盒。

    为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一组检测曼氏裂头蚴的引物，引物的序列如SEQ ID NO：1~2所示。SEQ ID NO：1所示序列为上游引物SEF3、SEQ ID NO：2所示序列为下游引物SER1。

本发明根据曼氏裂头蚴的COX1保守序列设计了多组引物，然后从这多组引物中筛选到一组特异性强的引物，比其他组引物的检测特异性都好，这种结果证明，虽然根据COX1基因的保守序列可以设计很多组的检测引物，但是不是所有的引物都能真正用于实际的特异性检测。

SEQ ID NO：1~2所示引物在检测曼氏裂头蚴中的应用。

SEQ ID NO：1~2所示引物在制备检测曼氏裂头蚴试剂中的应用。

一种检测曼氏裂头蚴的非疾病诊断的PCR方法，包括以下步骤：提取待测样品DNA，以SEQ ID NO：1~2所示引物进行PCR反应，根据PCR反应结果判断待测样品中是否含有曼氏裂头蚴。

优选地，一种检测曼氏裂头蚴的非疾病诊断的PCR方法，包括以下步骤：

S1.提取待测样品DNA；

S2.三个管中分别加入待测样品DNA、阳性质控、阳性质控，然后每个管中分别加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶和DEPC-H₂O，分别配制检测物、阳性对照物和阴性对照物；

S3.PCR扩增：94℃预变性5min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃后延伸10min；

S4.结果判定：取扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，如检测物的琼脂糖电泳产生一条特异谱带，片段大小约475 bp，阳性对照物在相同大小产生一条特异谱带，阴性对照物不产生特异谱带；则证明该检测物为曼氏裂头蚴；如检测物的琼脂糖电泳未产生一条475 bp大小的谱带，阳性对照物在此位置产生一条特异谱带，阴性对照物不产生特异谱带；则证明该检测物不是曼氏裂头蚴。

一种检测曼氏裂头蚴的PCR试剂盒，所述试剂盒包括SEQ ID NO：1~2所示引物。

优选地，所述试剂盒包括PCR混合液、Taq DNA聚合酶、DEPC-H₂O、阳性质控、阴性质控，其中PCR反应混合液包括权利要求1所述的引物、含Mg²⁺的10×Taq缓冲液、dNTP Mixture。

更优选地，所述PCR检测试剂盒由以下含量的成分组成：PCR混合液400μL（包括上游引物SEF3、下游引物SER1、含有Mg²⁺的10× Taq DNA Buffer 、dNTP Mixture）；Taq DNA聚合酶（5U/μL）：20μL；DEPC-H₂O：1mL；阳性质控：1mL；阴性质控：1mL。

与现有的技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明根据曼氏裂头蚴的COX1保守序列设计了多组引物，然后从这多组引物中筛选到一组特异性特别好的引物，该组引物序列在现有技术中从未报道过，而且这组引物的特异性比其他组引物的特异性都明显好很多。因此采用这组引物制备的检测试剂具有特异性、灵敏度高的特点，这样能准确鉴别曼氏裂头蚴。

操作性强：本发明所设计的PCR检测试剂盒将进行PCR检测的各种试剂置放在一个试剂盒中，操作简便、快速、便捷。该PCR试剂盒是一种检测曼氏裂头蚴的敏感和可靠地试剂盒。

实用性好：本发明设计出的PCR检测方法，可以用于曼氏裂头蚴的高灵敏度、特异性分子检测，对于曼氏裂头蚴病的早期诊断、监控和防治具有重要意义。

附图说明

图1是采用SEF3和SER1引物曼氏裂头蚴的特异性检验结果图；泳道M为DL2000 DNA，Marker，泳道1为 曼氏裂头蚴（宿主：青蛙），泳道2为曼氏裂头蚴（宿主：蛇），泳道3~泳道8分别为复孔绦虫，赖利绦虫，泡状带绦虫，九江头槽绦虫，大型多沟槽绦虫，胃瘤线虫，泳道9 为阴性对照。

图2是采用SEF1和SER1引物曼氏裂头蚴的特异性检验结果图；泳道M为DL2000 DNA Marker，泳道1为 曼氏裂头蚴（宿主：青蛙），泳道2为曼氏裂头蚴（宿主：蛇），泳道3~泳道8分别为复孔绦虫，赖利绦虫，泡状带绦虫，九江头槽绦虫，大型多沟槽绦虫，胃瘤线虫，泳道9 为阴性对照。

图3是采用SEF2和SER1引物曼氏裂头蚴的特异性检验结果图；泳道M为DL2000 DNA Marker，泳道1为 曼氏裂头蚴（宿主：青蛙），泳道2为曼氏裂头蚴（宿主：蛇），泳道3~泳道8分别为复孔绦虫，赖利绦虫，泡状带绦虫，九江头槽绦虫，大型多沟槽绦虫，胃瘤线虫，泳道9 为阴性对照。

图4是采用SEF4和SER2引物曼氏裂头蚴的特异性检验结果图；泳道M为DL2000 DNA Marker，泳道1为 曼氏裂头蚴（宿主：青蛙），泳道2为曼氏裂头蚴（宿主：蛇），泳道3~泳道8分别为复孔绦虫，赖利绦虫，泡状带绦虫，九江头槽绦虫，大型多沟槽绦虫，胃瘤线虫，泳道9 为阴性对照。

图5是采用SEF3和SER1引物曼氏裂头蚴的灵敏性检验结果图；其中：泳道M为DL2000 DNA Marker，泳道1为曼氏裂头蚴的DNA（1.225mg/μL），泳道2~11为按照5倍梯度稀释的曼氏裂头蚴的DNA，依次为5^-1、5^-2、5^-3、5^-4、5^-5、5^-6 5^-7、5^-8、5^-9、5^-10，泳道12为阴性对照。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 特异性PCR引物的设计及筛选

一、引物的设计：

因为曼氏裂头蚴的COX1序列还未公开，因此通过曼氏迭宫绦虫、阔节裂头蚴、日本海裂头条虫、犬复孔绦虫的COX1序列，利用Oliga 6 程序软件设计出4组引物。

第1组：

上游引物SEF3 5'-AATTCTTTCTGCTTGTGTGT- 3'

下游引物SER1 5'-ATCAACAAATAATCCACGCAC-3'

第2组：

上游引物：SEF1 5'-TGGGCATCCAGAAGTTTATG-3'

下游引物： SER1 5'-ATCAACAAATAATCCACGCAC-3'

第3组：

上游引物：SEF2 5'-CTGCTGTTTTCTTTAGTTCTG- 3'

下游引物：SER1 5'-ATCAACAAATAATCCACGCAC-3'

第4组

上游引物：SEF4 5'- GATCCTTTGGGTGGTGGTGATC-3'

下游引物： SER2 5'- TCATACACACAAACACGCCGAG-3'。

引物的筛选：以宿主来源不同的曼氏裂头蚴（宿主分别为青蛙和蛇）和共计5种在不同宿主来源的其他寄生绦虫和线虫的DNA分别为模版，利用上述4组引物分别进行PCR扩增，通过比较4组引物的扩增结果来判断引物的特异性和灵敏性。

其中，PCR反应体系为25 μL，包括1μL的基因组DNA，5.5μL PCR混合液，0.125 μL Taq DNA 聚合酶（5U/μL），补足 DEPC-H₂O至25 μL；其中PCR混合液包括相对应引物、含Mg²⁺的10×Taq缓冲液、dNTP Mixture。

    PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30s，30个循环；72℃后延伸10min后得到扩增序列。同时设立阳性对照和阴性对照。

最后的扩增结果如图1~4。由图1可见，只有曼氏裂头蚴DNA为模板的PCR反应有目的条带，其余寄生虫和阴性对照均未见扩增条带，第一组引物对曼氏裂头蚴具有很强特异性。由图2可见，SEF1和SEFR1扩增序列长度为832bp，通过特异性试验分析，宿主来源为蛇的曼氏裂头蚴扩增条带不明显，而赖利绦虫也能够扩增出特异条带。其余寄生虫和阴性对照均未见扩增条带，说明SEF1和SER1为引物的PCR反应特异性不强。由图3可见，SEF2和和SEFR1扩增序列长度为644bp，除了曼氏裂头蚴扩增出目的条带，胃瘤线虫扩展出特异条带，九江头槽绦虫能扩增出非特异条带。其余寄生虫和阴性对照均未见扩增条带，说明SEF2和SER1为引物的PCR反应特异性不强。由图4可见，SEF4和和SEFR2扩增序列长度为674bp，只有曼氏裂头蚴（宿主：青蛙）扩增出目的条带，曼氏裂头蚴（宿主：蛇）未扩增出特异条带。大型多沟槽绦虫扩增出特异条带，九江头槽绦虫能扩增出非特异条带。其余寄生虫和阴性对照均未见扩增条带，说明SEF4和SER2为引物的PCR反应特异性不强。因此，第1组引物的特异性要比其他3组明显好很多。

实施例2试剂盒的制备

一、试剂盒的组成：所述时间盒由以下含量的成分组成：PCR混合液400μL（包括上游引物SEF3、下游引物SER1、含有Mg²⁺的10× Taq DNA Buffer 、dNTP Mixture）；Taq DNA聚合酶（5U/μL）：20μL；DEPC-H₂O：1mL；阳性质控：1mL；阴性质控：1mL。阳性对照为曼氏裂头蚴的DNA溶液，阴性对照为DEPC-H₂O。

二、试剂盒的检测方法

    1、样品采集：将青蛙逐个洗净、分类、编号，然后去皮，剖开青蛙腿部及

背部肌肉观察，如发现肌肉中有白色可疑物，即将其刮出，放入盛有生理盐水的平皿中分离，观察活动度，显微镜观察形态。形态鉴定：虫体白色，长数厘米到数十厘米，体表不分节，有横纹，伸缩能力很强。

    2、虫体基因组DNA提取：采用Promega公司Wizard?基因组 DNA 纯化

试剂盒提取DNA，具体提取步骤参照试剂盒说明书。

3、PCR反应体系为25 μL，包括1μL的基因组DNA，5.5μL PCR混合液，0.125 μL Taq DNA 聚合酶（5U/μL），补足 DEPC-H₂O至25 μL；其中PCR混合液包括实施例1中的第1组引物、含Mg²⁺的10×Taq缓冲液、dNTP Mixture。

PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30s，30个循环；72℃后延伸10min后得到扩增序列。

同时设立阳性对照和阴性对照。

    4、结果判定：取5μL扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。检测物的琼脂糖电泳产生一条特异谱带，片段大小约475 bp，阳性对照物在相同大小产生一条特异谱带，阴性对照物不产生特异谱带。则证明该检测物为曼氏裂头蚴。检测物的琼脂糖电泳未产生一条475 bp大小的谱带，阳性对照物在此位置产生一条特异谱带，阴性对照物不产生特异谱带。则证明该检测物不是曼氏裂头蚴。

实施例3所述试剂盒对曼氏裂头蚴的灵敏性检验

1、实施例2所述试剂盒对曼氏裂头蚴的灵敏度检验

用BIO-RAD的核酸蛋白测定仪测定了曼氏裂头蚴未经稀释前的DNA浓度为1.225mg/μL，以未稀释的曼氏裂头蚴的DNA为模板进行5倍浓度稀释，依次为5^-1、5^-2、5^-3、5^-4、5^-5、5^-6 5^-7、5^-8、5^-9、5^-10。

PCR反应体系为25 μL，包括约1μL的模板基因组DNA，5.5μL PCR混合液，0.125 μL Taq DNA 聚合酶（5U/ μL），补足 DEPC-H₂O至25 μL。

反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃后延伸10min后得到扩增序列。

同时设立阴性对照，阴性对照为DEPC-H₂O。

取5μL扩增产物用1.5%琼脂糖电泳检测。

2、检验结果如图5所示。从图5可以看出，泳道1条带最亮，依次逐渐变暗，第6泳道（5^-5稀释倍数的模板DNA）仍能看出微弱条带，泳道7~泳道12未见条带，说明本发明对曼氏裂头蚴的检测灵敏度可以达到0.392μg/μL。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  中华人民共和国广州机场出入境检验检疫局

 

<120>  一种检测曼氏裂头蚴的特异性PCR方法及其试剂盒

 

<130> 

 

<160>  6    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  上游引物SEF3

 

<400>  1

aattctttct gcttgtgtgt                                                 20

 

 

<210>  2

<211>  21

<212>  DNA

<213>  下游引物SER1

 

<400>  2

atcaacaaat aatccacgca c                                               21

 

 

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  上游引物SEF1

 

<400>  3

tgggcatcca gaagtttatg                                                 20

 

 

<210>  4

<211>  21

<212>  DNA

<213>  上游引物SEF2

 

<400>  4

ctgctgtttt ctttagttct g                                               21

 

 

<210>  5

<211>  22

<212>  DNA

<213>  上游引物SEF4

 

<400>  5

gatcctttgg gtggtggtga tc                                              22

 

 

<210>  6

<211>  22

<212>  DNA

<213>  下游引物SER2

 

<400>  6

tcatacacac aaacacgccg ag                                              22