一株拮抗地黄专化型尖孢镰刀菌的菌株及其应用

摘要

本发明涉及一株拮抗地黄专化型尖孢镰刀菌的菌株，该菌经鉴定为蜡状芽孢杆菌，命名为Bacillus cereus LK-8，保藏号为CGMCC 10967。本发明所述的蜡状芽孢杆菌LK-8分离至地黄连作土壤中，能够高效抑制地黄专化型尖孢镰刀菌的生长，拮抗菌的发酵液中含有能够抑制地黄专化型尖孢镰刀菌的拮抗物质。本发明公布的蜡状芽孢杆菌LK-8可以有效防治连作地黄的土传病害，可为克服药用植物的再植病害问题提供新的生防菌株，在该领域具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一株细菌菌株，特别涉及一株拮抗地黄专化型尖孢镰刀菌的菌株及其应用，属于微生物和生物防治技术领域，可用于药用植物土传病害的生物防治。

背景技术

连作障碍（consecutive monoculture problem），也称为自毒作用、重茬问题或土壤病，是指即使正常的田间管理措施下，同一地块连续多年种植相同或相似植物造成植物生长发育不良、病虫害发生严重、产量品质下降的化学生态学现象。大多数药用植物栽培过程中都存在严重的连作障碍问题。药用植物连作导致药用部位—块根无法正常膨大，造成产量、品质严重下降，甚至造成绝收，这严重制约了我国中药资源的可持续发展与利用。

地黄（Rehmannia glutinosa L.）为玄参科多年生草本植物，以块根入药，是我国最具特色的大宗道地药材之一。据统计，地黄在中药处方中的使用频率排名前10位，用量列中药之首，在中药复方领域有着极广泛应用。然而，地黄的连作障碍问题尤为严重（如图1所示），通常每茬地黄收获后须间隔8～10 年方可在同一地块上再次种植。课题组研究发现，地黄连作导致土壤微生态结构恶化，尤其发现尖孢镰刀菌的数量极显著上升。从地黄发病部分和连作土壤中也高频率分离到尖孢镰刀菌，并且分离到一株地黄专化型尖孢镰刀菌，该菌株不侵染玉米、大豆、小麦等作物，而对地黄表现出极强的致病性（如图2所示）。

随着生态农业、绿色农业的发展与提倡，微生物防治植物病害成为了一个热点，得到了广泛研究。利用拮抗菌进行植物病害的生物防治被认为是一种科学、合理、高效、环境友好型的措施。但是尖孢镰刀菌的致病菌株具有高度的寄主专化性，从其他作物或环境中分离到的拮抗菌并不一定对地黄专化型尖孢镰刀菌有良好的防治效果。所以，本发明以地黄专化型尖孢镰刀菌为靶标，大量筛选有益拮抗菌，分离到一株高效拮抗该病原真菌的拮抗细菌，鉴定为蜡状芽孢杆菌，命名为Bacillus cereus LK-8，该拮抗菌的分离可为地黄根腐病、枯萎病等的生物防治提供新的生防菌株。

发明内容

本发明的目的是提供一株拮抗地黄专化型尖孢镰刀菌的菌株及其应用，用于生物防治地黄单一化连续种植过程中常见的根腐病、枯萎病等问题。

本发明的技术方案如下：

本发明所提供的拮抗细菌为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus LK-8），该菌株已于2015年6月9日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 10967。

本发明所述的蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus LK-8）对地黄专化型尖孢镰刀菌具有很强的拮抗作用。

    本发明所述的有益拮抗菌具有以下几个优点：

（1）    本发明所述的拮抗菌—蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus LK-8）是从500株土壤细菌中筛选得到的，可有效抑制地黄专化型尖孢镰刀菌的生长。

（2）    本发明所述的拮抗菌—蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus LK-8）能够高效降解地黄根系分泌物中的酚酸类自毒物质，减轻自毒作用。

（3）    本发明所述的拮抗菌—蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus LK-8）来源于连作地黄根际土壤中，并非源自其他生境，根际定殖效果较好并且安全可靠，对地黄及后茬其他作物（如小麦、玉米、水稻、大豆、花生等常见作物）均无致病侵染能力。

（4）    本发明所述的拮抗菌—蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus LK-8）的培养温度范围优选为20°C～45°C，pH范围为5～9，适合生长的温度和pH范围较广，适应性强。

附图说明

图1为正、重茬地黄地上部和地下部生长情况比较。

图2为尖孢镰刀菌病原菌侵染地黄组培苗（A）及菌丝显微观察（B）. A：表示分别接种尖孢镰刀菌5天（左）和9天（右）后的组培苗发病情况；B：表示发病根系上菌丝的显微观察。

图3为拮抗菌蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus LK-8）的革兰氏染色及显微形态观察。

图4为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus LK-8）与地黄专化型尖孢镰刀菌（FON）的对峙培养照片。

图5为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus LK-8）的代谢产物抑制尖孢镰刀菌生长. A：添加蜡状芽孢杆菌LK-8发酵液；B：未添加LK-8发酵液。

图6为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus LK-8）防控尖孢镰刀菌侵染地黄脱毒移栽苗. A：左盆表示仅接种尖孢镰刀菌，右盆表示接种假单胞菌（距根部2 cm接种一圈）和尖孢镰刀菌（距根部4 cm接种一圈）；B：土壤及发病植株上存在尖孢镰刀菌病原菌丝。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细的描述。以下实施例仅仅用于说明和解释本发明，而不构成对本发明技术方案的限制。

实施例1 拮抗菌蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus LK-8）的筛选及其鉴定

1、地黄专化型尖孢镰刀菌拮抗菌Bacillus cereus LK-8的筛选

1.1 根际土壤细菌单菌落获得

称取过筛的新鲜土壤5 g，加入到45 mL冷却的无菌水中，30°C、150 rpm振荡30 min得10^-1稀释液，再依次稀释10倍得10^-2、10^-3、10^-4、10^-5稀释液。吸取10^-3、10^-4、10^-5三个稀释度的土壤悬液60 μL涂抹于LB平板上，每个稀释度均涂3个平板，置于37 ℃的培养箱中培养过夜，挑选单菌落清晰可辨且生长均匀的平板，挑取其中的单菌落，采用平行划线的方法进行纯化，确认为单一细菌菌落，并保存备用。

1.2 地黄专化型尖孢镰刀菌的拮抗菌筛选

配制马铃薯葡萄糖培养基（potato dextrose agar，PDA），配制如下：将马铃薯洗净去皮，切成小块，称取200 g，加适量水煮沸后计时25 min，经四层纱布过滤得滤液，往滤液中加入葡萄糖30 g和琼脂15 g，继续加热搅拌混匀，稍加冷却后再加水定容至1000 mL，分装，高压灭菌后倒板或保存备用。

    经121°C高温高压灭菌的PDA培养基，迅速倒板，冷却凝固后制得PDA平板，在平板一侧接种经活化培养的细菌，置于28°C恒温培养箱中避光培养48 h后，在对称位置接种地黄专化型尖孢镰刀菌，置于28°C恒温培养箱中避光对峙培养数天，实时观察抑菌圈的有无及大小。对峙培养5天后，通过观察抑菌圈大小筛选出一株对地黄专化型尖孢镰刀菌具有强拮抗效应的细菌菌株，对该菌株进行了保藏，保藏编号为CGMCC 10967。将筛选到的强拮抗菌株进行纯化培养，并斜面保存备用。

2、地黄专化型尖孢镰刀菌的拮抗菌鉴定

2.1本发明所述的拮抗菌（保藏编号为：CGMCC 10967）经显微观察可以看到该菌为杆菌，革兰氏阳性菌（如图3所示）。在LB固体培养基上生长时菌落大，扁平，表面粗糙，不规则，边缘有褶皱。同时，该拮抗菌的生理生化特性为：能氧化分解葡萄糖，不产气。能液化明胶。可分解葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、丙三醇、甘露醇、丙氨酸、脯氨酸、精氨酸。可分解尿素、氯化铵、硝酸铵、硝酸钾。

2.2 16s-23s rRNA基因区间PCR鉴定

将筛选出的强拮抗菌株（保藏编号为：CGMCC 10967）转接至LB液体培养基进行扩大培养，提取基因组DNA，经引物1405f（5'-TGYACACACCGCCCGT-3'）和456r（5'-CCTTT CCCTCACGGTACT G -3'）PCR扩增16s-23s rRNA基因区间，产物纯化后进行测序，用于细菌分子鉴定。

测序序列采用BLAST工具与NCBI数据库（Nucleotide collection（nr/nt））进行比对分析。分子生物学鉴定该拮抗菌为蜡状芽孢杆菌，命名为Bacillus cereus LK-8。

实施例2 拮抗菌及其拮抗物质的抑菌效果检测

（1）拮抗菌对峙培养

配制PDA培养基，经121°C高温高压灭菌后迅速倒板，冷却凝固后，在平板一侧接种经活化培养的蜡状芽孢杆菌LK-8，置于28°C恒温培养箱中避光培养48 h后，在对称位置接种地黄专化型尖孢镰刀菌，置于28°C恒温培养箱中避光对峙培养数天，实时观察抑菌圈的的形成。培养5天发现，蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus LK-8）能够显著抑制地黄专化型尖孢镰刀菌的菌丝生长（如图4所示）。

（2）拮抗物质的抑菌效果检测

采用代谢物平板添加法进行拮抗菌拮抗物质的抑菌效果评价。做法如下：将保存的拮抗菌接种于LB液体培养基中振荡培养48h，高速离心后，上清用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，将滤液加入至已灭菌的PDA培养基中（45℃左右加入，终浓度为2.5%），混匀后倒板，凝固后接入已活化的地黄专化型尖孢镰刀菌，置于28°C恒温培养箱中避光培养数天，实时观察对照组与试验组中尖孢镰刀菌的菌丝生长差异。结果显示，添加了代谢产物的试验组，病原菌尖孢镰刀菌菌丝生长受抑制，而未添加代谢产物的对照组，病原菌菌丝生长正常（如图5所示）。

实施例3 拮抗菌防控尖孢镰刀菌侵害地黄脱毒移栽苗效果评价

将已培养45天的地黄组培苗（培养基配方为：MS + 0.2 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L IBA + 30 g/L 蔗糖 + 7 g/L 琼脂）移栽至已灭菌处理的培养基质中，每盆种植1株组培苗，驯化培养两周后，挑选长势一致的移栽苗进行后续试验。在移栽苗根部周围2 cm处接种一圈培养过夜的蜡状芽孢杆菌LK-8菌液，培养2天后，在根部周围4 cm处（即蜡状芽孢杆菌LK-8外圈）接种已活化的地黄专化型尖孢镰刀菌，25°C恒温组培室中继续培养，期间每3天添加一次蜡状芽孢杆菌LK-8菌液，对照组以添加等量LB培养基代替，动态观察尖孢镰刀菌在有无添加拮抗菌情况下对地黄移栽苗生长的影响差异。结果显示：仅添加病原菌的对照组中，地黄移栽苗很快出现病变症状，挑菌再测序验证发现对照组土壤表面和死亡植株上有大量尖孢镰刀菌菌丝生长，而试验组的地黄脱毒苗生长良好，没有明显病变现象（如图6所示）。

综上可见，本发明筛选出的蜡状芽孢杆菌LK-8（保藏号为：CGMCC 10967）对地黄专化型病原菌具有很强的拮抗作用，能够有效防控尖孢镰刀菌病原菌对地黄的侵害，可为地黄根腐病、枯萎病等的生物防治提供新的生防菌株，在该领域具有广阔的应用前景。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

 

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