CD40LG基因rs3092923多态性在检测中国人男性肺结核中的应用

摘要

本发明公开了CD40LG基因rs3092923多态性在检测中国人男性肺结核中的应用。本发明所保护的技术方案是检测人基因组中rs3092923的多态性或基因型的物质在制备筛查中国人男性肺结核中的应用和检测人基因组中rs3092923的多态性或基因型的物质在制备预测中国人男性肺结核患者病情的产品中的应用。可将检测rs3092923的多态性或基因型的物质与其它物质(如检测其它的与中国人男性肺结核相关的单核苷酸多态性或基因型的物质)联合在一起制备筛查中国人男性肺结核患者或预测中国人男性肺结核患者病情的产品。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域中CD40LG基因rs3092923多态性在检测中国人男性肺结 核中的应用。

背景技术

结核病是由结核分支杆菌感染引起的危害全球的传染性疾病，主要通过呼吸道传 播。结核病仍然是由单一病原菌导致死亡人数最多的疾病，并且近年来呈现死灰复燃 之势。据世界卫生组织统计，我国是全球22个结核病高负担国家之一，结核病患者数 量居世界第2位，仅次于印度。已有研究显示，暴露于结核杆菌，三分之一的人群会 被感染，在感染人群中，不到10％的感染者发展为结核病，提示个体的遗传因素在该 病的发生起重要作用。鉴定肺结核的易感基因有助于预测肺结核发生的个体风险和群 体风险，且有助于阐明与此疾病相关的发病机制。

CD40LG即CDl54，是肿瘤坏死因子配体家族中的一员。D40LG作为体内特异性免 疫反应系统重要的共刺激分子，在机体的细胞免疫和体液免疫反应中起着关键性的作 用。CD40LG主要表达于活化的T细胞上，它与B细胞上CD40相互作用，在B细胞的 活化与增殖分化、生发中心形成、抗体产生及同种类型转换中起关键作用，在T细胞 活化以及效应性细胞因子的分泌过程中也起重要调节作用。目前仅有一篇关于CD40LG 基因rs3092923多态性位点与非洲冈比亚人群肺结核相关性研究的报道，但该研究显 示在非洲冈比亚人群中rs3092923多态性位点与肺结核发生风险不相关。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何筛查中国人男性肺结核患者。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了下述A1)-A6)中的任一种用途：

A1)检测人基因组中rs3092923的多态性或基因型的物质在制备筛查中国人男性 肺结核患者产品中的应用；

A2)检测人基因组中rs3092923的多态性或基因型的物质在制备检测中国人男性 肺结核易感性产品中的应用；

A3)检测人基因组中rs3092923的多态性或基因型的物质在制备检测与中国人男 性肺结核相关的单核苷酸多态性的产品中的应用；

A4)检测人基因组中rs3092923的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定 与中国人男性肺结核相关的单核苷酸多态性的产品中的应用；

A5)人基因组中rs3092923的多态性或基因型在制备筛查中国人男性肺结核患者 的产品中的应用；

A6)人基因组中rs3092923的多态性或基因型在制备检测中国人男性肺结核易感 性产品中的应用。

rs3092923是人X染色体上的一个二等位多态性的SNP位点，该变异是转换(C/T， 在其互补链上则为G/A)。在女性人群中，所述rs3092923基因型是CC、CT和TT,所述 CC是rs3092923位点为C的纯合型，所述TT是rs3092923位点为T的纯合型，所述 CT是rs3092923位点为C和T的杂合型。在男性人群中，rs3092923基因型是T/(-) 和C/(-)，T/(-)是男性X染色体rs3092923位点为T的基因型，C/(-)是男性X染色 体rs3092923位点为C的基因型。所述检测人基因组中rs3092923的多态性或基因型 具体可通过检测rs3092923的核苷酸种类确定。

上述用途中，所述检测人基因组中rs3092923的多态性或基因型的物质可包括扩 增包括rs3092923在内的基因组DNA片段的PCR引物对和/或单碱基延伸引物。

上述用途中，所述T/(-)基因型(或T等位)的个体在中国人男性肺结核患者群 体中的比例分别高于其在对照中的比例。

为解决上述技术问题，本发明还提供了含有检测人基因组中rs3092923的多态性 或基因型的物质的产品。

本发明所提供的含有检测人基因组中rs3092923的多态性或基因型的物质的产 品，为a)-d)中的任一种：

a)检测与中国人男性肺结核相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；

b)鉴定或辅助鉴定与中国人男性肺结核相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；

c)筛查中国人男性肺结核患者产品；

d)检测中国人男性肺结核易感性产品。

上述产品中，所述检测人基因组中rs3092923的多态性或基因型的物质可包括扩 增包括rs3092923在内的基因组DNA片段的PCR引物对和/或单碱基延伸引物。

上述产品中，所述T/(-)基因型(或T等位)的个体在中国人男性肺结核患者群 体中的比例分别高于其在对照中的比例。

本发明中，所述扩增包括rs3092923在内的基因组DNA片段的PCR引物对可由序 列表中SEQ ID No.1所示的单链DNA和序列表中SEQ ID No.2所示的单链DNA组成； 所述单碱基延伸引物的核苷酸序列可如序列表中SEQ ID No.3所示。

实验证明，在中国人男性群体中，rs3092923的T等位在病例组中的比例高于其 在对照组中的比例，具有统计学差异，说明rs3092923的T等位为中国人男性肺结 核的风险等位。在中国人男性群体中，rs3092923位点的两个基因型中，T/(-)基因 型的个体在病例组中的比例高于其在对照组中的比例，C/(-)基因型的个体在病例 组中的比例低于其在对照组中的比例。在中国人男性群体中，与携带C/(-)基因型 的个体相比，携带T/(-)基因型的个体肺结核发病风险增加，比值比(Odds ratio， OR)为1.95，P＝0.0033，说明r rs3092923多态性位点与中国人男性肺结核的发 生显著关联。

在实际应用中，可将检测rs3092923的多态性或基因型的物质与其它物质(如检 测其它的与中国人男性肺结核相关的单核苷酸多态性或基因型的物质)联合在一起制 备筛查中国人男性肺结核患者的产品。

其中，检测人基因组中rs3092923的多态性或基因型的物质可为通过下述至少一 种方法确定rs3092923的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器：DNA测序、限制性酶 切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱、SNP芯片、TaqMan探针技 术和Sequenom MassArray技术。其中，利用Sequenom MassArray技术确定rs3092923 的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器包括PCR引物对、基于单碱基延伸反应的延伸 引物、磷酸酶(如虾碱性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase，SAP))、树脂、 芯片、MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization–time of fligh， 基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱)以及Sequenom MassArray技术所需要的其他 试剂和仪器；利用TaqMan探针技术确定rs3092923的多态性或基因型所需的试剂和/ 或仪器包括TaqMan探针、PCR引物对、定量PCR仪和进行基因分型的软件(如7500 System SDS software)以及TaqMan探针技术所需要的其他试剂；SNP芯片包括基于 核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反 应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切 酶反应的芯片、基于蛋白DNA结合反应的芯片，及基于荧光分子DNA结合反应的芯片。

所述产品可为试剂或试剂盒，还可为由试剂或试剂盒与仪器组成的系统，如由引 物和DNA测序仪组成的系统，由PCR试剂和DNA测序试剂和DNA测序仪组成的系统， 由TaqMan探针、PCR引物对、定量PCR仪和进行基因分型的软件以及TaqMan探针技 术所需要的其他试剂组成的系统，由PCR引物对、单碱基延伸引物、芯片、PCR仪和 进行基因分型的软件以及Sequenom MassArray技术所需要的其他试剂和仪器组成的系 统。

本发明的一个实施例中，采用Sequenom MassArray技术确定rs3092923的多态性 和基因型。所述PCR引物对在序列上没有特殊要求，只要能扩增出包括rs3092923在 内的基因组DNA片段即可，具体可为序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的单 链DNA。所述单碱基延伸引物具体可为序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA。Sequenom  MassArray技术所需要的其他仪器为MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪 (SEQUENOM公司)。Sequenom MassArray技术所需要的芯片为SpectroCHIP(Sequenom) 芯片。所述进行基因分型的软件具体为MALDI-TOF和TYPER 4.0软件(sequenom)。

本发明在一个来自中国人群的样本(923例肺结核病例和1033例对照)中发现 rs3092923是与中国人男性肺结核相关的单核苷酸多态性。可将检测rs3092923的多 态性或基因型的物质与其它物质(如检测其它的与发热伴血小板减少综合征相关的单 核苷酸多态性或基因型的物质)联合在一起制备筛查中国人群中发热伴血小板减少综 合征患者的产品。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了 阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1检测CD40LG基因的rs3092923位点基因型方法的建立

rs3092923是人X染色体上的一个二等位多态性的SNP位点，该变异是转换(C/T， 在其互补链上则为G/A)。在女性人群中，所述rs3092923基因型是CC、CT和TT，CC 是rs3092923位点为C的纯合型，TT是rs3092923位点为T的纯合型，CT是rs3092923 位点为C和T的杂合型。在男性人群中，rs3092923基因型是T/(-)和C/(-)，T/(-) 是男性X染色体rs3092923位点为T的基因型，C/(-)是男性X染色体rs3092923位点 为C的基因型。

1、基因组DNA的提取

提取待测样品基因组DNA，以其为模板进行基因型检测。

2、引物的设计与合成

使用Sequenom公司Genotyping Tools及MassARRAY Assay Design软件设计待 测SNP位点的PCR扩增引物及单碱基延伸引物，并交由生物公司合成。检测PDGF-B 基因rs3092923位点基因型的特异性引物对的序列为：正向引物 5’-ACGTTGGATGTGCTTCACCTCACCACAAAC-3’(序列表中的SEQ ID No.1)；反向引 物5’-ACGTTGGATGCCAAGTTGTTGCTCATGGTG-3’(序列表中的SEQ ID No.2)。用于 单碱基扩增反应的延伸引物序列为5’-CACCACAAACTTTCCCT-3’(序列表中的SEQ ID  No.3)。

3、检测CD40LG基因的rs3092923位点基因型方法的建立

3.1PCR扩增：PCR扩增在384孔板中进行，每个反应体系总体积为5μL，按 表1配制PCR反应体系。

表1 每个PCR反应体系的组分

试剂 体积(μL) 10×PCR缓冲液 0.5 MgCl₂(25mM) 0.4 dNTP mix(25mM) 0.1 HotStar Taq酶(5U/μL) 0.1 超纯水 1.9 SEQ ID No.1所示的DNA 1 SEQ ID No.2所示的DNA 1 总体积 4

PCR反应程序为：94℃4分钟；94℃20秒，56℃30秒，72℃1分钟，45个 循环；72℃3分钟；4℃保持。

3.2PCR产物碱性磷酸酶处理：在PCR反应结束后，将PCR产物用SAP(shrimp  alkal ine phosphatase，虾碱性磷酸酶)处理，以去除体系中游离的dNTPs，按表 2配制SAP反应体系。

表2 SAP反应体系

试剂 体积(μL) 超纯水 1.53 10×SAP缓冲液 0.17 SAP酶(1.7U/ul) 0.3 总体积 2

反应条件为：37℃40分钟；85℃5分钟；4℃维持。

3.3单碱基延伸：在碱性磷酸酶处理结束后利用10×单碱基延伸反应缓冲液、 单碱基延伸反应酶(1.7U/μl)和SEQ ID No.3所示的单碱基扩增反应的延伸引物进 行单碱基延伸反应。

反应条件为：

I.94℃30秒

II.94℃5秒

III.52℃5秒

IV.80℃5秒

V.回到III，4次循环

VI.回到II，39次循环

VII.72℃3分钟

VII.4℃

3.4树脂纯化：将Clean Resin树脂平铺到6mg的树脂板中；加16μl水到延 伸产物的对应孔内；将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30 分钟,使树脂与反应物充分接触；离心使树脂沉入孔底部。

3.5芯片点样：启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪(SEQUENOM公 司)，将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片(SEQUENOM 公司)上。

3.6质谱检测：将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF分析，检测结果 使用TYPER 4.0软件(sequenom)分型并输出结果。

实施例2CD40LG基因的rs3092923位点与中国人男性肺结核易感性的分析

用实施例1建立起来的方法，对中国人群(923例肺结核病例和1033例对照)的 CD40LG基因的rs3092923位点基因型进行了分析。

1、研究对象

病例组：923例肺结核患者，且均符合中华人民共和国卫生行业标准肺结核诊 断标准(WS 288-2008)。

对照组：1033例对照，以中华人民共和国卫生行业标准肺结核诊断标准(WS 288-2008)进行体检后确认不患肺结核。

研究对象的人口学特征见表3，所有研究对象均为无血缘关系的中国汉族人。所 有研究对象均签署了知情同意书，通过结构化的问卷来收集个人的人口统计学资料和 病史。本研究得到河北省胸科医院、石家庄市第五医院和北京电力医院伦理委员会 的批准。

2、CD40LG基因的rs3092923位点基因型的确定

人群中CD40LG基因的rs3092923位点的基因型和等位的频率分布如表3所示。

结果显示，在所有的研究对象中，病例组中T等位的频率为92.5％，C等位的 频率为7.5％；对照组中T等位的频率为88.6％，C等位的频率为11.4％。T等位在病 例组中的频率比在对照组中的频率高，具有统计学差异，表明rs3092923位点的T 等位为肺结核的风险等位。

在所有的研究对象rs3092923位点的三个基因型中，TT和T/(-)基因型的个体 在病例组中的比例高于其在对照组中的比例，CC和C/(-)基因型和CT基因型的个 体在病例组中的比例分别低于相应基因型的个体在对照组中的比例。在所有的研究 对象中，与携带CC和C/(-)基因型的个体相比，携带TT和T/(-)基因型的个体肺结 核发病风险增加，OR值为1.8[95％置信区间(95％CI)＝1.24-2.62；P＝0.0060]。

在男性群体中，病例组中T等位的频率为93.6％，C等位的频率为6.4％；对照 组中T等位的频率为88.3％，C等位的频率为11.7％。T等位在病例组的男性群体中 的频率比该等位在对照组的男性群体中的频率高，具有统计学差异，表明rs3092923 位点的T等位为中国人男性肺结核的风险等位。

在男性群体rs3092923位点的两个基因型中，T/(-)基因型的个体在病例组中的 比例高于其在对照组中的比例，C/(-)基因型的个体在病例组中的比例低于其在对照 组中的比例。在男性群体中，与携带C/(-)基因型的个体相比，携带T/(-)基因型的 个体肺结核发病风险增加，OR值为1.95[95％置信区间(95％CI)＝1.3-2.91；P＝ 0.0033]。

而在女性群体中，病例组中T等位的频率为90.3％，C等位的频率为9.7％；对 照组中T等位的频率为89.3％，C等位的频率为10.7％。T等位在病例组的女性群体 中的频率比该等位在对照组的女性群体中的频率高1.0％，没有统计学差异。在女性 中，与携带CC基因型的个体相比，携带TT基因型的个体肺结核发病风险没有显著 增加，OR值为0.93[95％置信区间(95％CI)＝0.32-2.76；P＝0.9015]，无统计学差 异；与携带CC基因型的个体相比，携带CT基因型的个体肺结核发病风险没有显著 增加，OR值为0.73[95％置信区间(95％CI)＝0.23-2.3；P＝0.5941]，无统计学差 异。

结果表明，可以利用rs3092923位点筛查中国人男性肺结核患者。

表3 研究对象的人口学特征

注：资料显示为个数(百分比)或均数(标准差)。

*卡介苗接种状态有和无两组间比较得到的P值。

表4 CD40LG基因的rs3092923与中国人群肺结核的关联分析

注：OR，比值比(odds ratio)；CI，置信区间(confidence interval)；

CC和C/(-)^*表示女性的CC基因型和男性的C/(-)基因型；TT和T/(-)^*表示女性的 TT基因型和男性的T/(-)基因型。

^a表示数据经过logistic回归分析，并进行了年龄、吸烟和卡介苗接种状态的校正。