一株粗糙型羊种布鲁氏菌弱毒株及其疫苗

摘要

本发明涉及一株粗糙型羊种布鲁氏菌弱毒株及其疫苗。该疫苗株通过抗菌素与M因子血清相结合的驯化和筛选技术，筛选出一株粗糙型羊种布鲁氏菌弱毒株RM57。该粗糙型弱毒株的安全性显著提高，但仍保留了对布鲁氏菌良好的免疫效果。利用该弱毒株制备成布鲁氏菌病疫苗，将改变布鲁氏菌疫苗免疫动物与野毒株感染动物难以区分的现状，并有效提高现有疫苗的安全性。

说明书

所属技术领域

本发明涉及一株粗糙型羊种布鲁氏菌弱毒株及其疫苗，属兽用生物制品领域。

技术背景

布鲁氏菌病(布病)是由布鲁氏菌或称布鲁氏菌(Brucella)引起的以流产和发热为特征的人兽共患病，严重地威胁着人和多种动物的生命健康。本病不但对动物的繁殖和生产性能具有严重危害，更重要的是，人感染布鲁氏菌后，往往难以治愈，从而造成严重的公共卫生问题。因此在布鲁氏菌流行的国家，消除布病一直是公共卫生计划中最重要的目标之一。目前全世界范围内消除该病的主要方法是扑杀与免疫相结合，对布病发生相对比较严重的中国，由于扑杀的成本高，疫苗预防成为本病主要控制手段。

布鲁氏菌疫苗免疫带来的主要问题是无法区分疫苗免疫和自然感染的动物，这在很大程度上限制了布鲁氏菌疫苗的使用和推广，也给布病的有效防治和清除带来了一定的难度。

布鲁氏菌存在光滑型(S)和粗糙型(R)两类不同表型的菌株，在凝集类抗体水平上无交叉反应，因此用粗糙型布鲁氏菌疫苗免疫的动物，其血清只与粗糙型抗原发生凝集反应，而与光滑型血清不反应，以此可以区分疫苗株和野毒株。最早使用过的粗糙型布鲁氏菌疫苗是用45/20菌株制备的，但该菌株极不稳定，经常会出现从R型到S型的变异，造成毒力返强，因而该疫苗已基本不再使用。90年代美国科学家通过利福平诱变获得了粗糙型布鲁氏菌RB51菌株，该菌株具有良好的免疫力，已在欧美多个国家使用，但其安全性和效力仍有争议，目前主要使用于野生动物。

已有的研究证实布鲁氏菌细胞壁脂多糖(LPS)中的O链组成决定了其光滑型或粗糙型的表型，O链的某些成分缺失，会导致菌株由光滑型变成粗糙型。现已发现多个与布鲁氏菌光滑型表型相关的基因，包括gmd、per、pgm、wbkA、lpx、wa、wbkC、wz和wbkC。但到目前为止，国内外尚无转基因获得的重组布鲁氏菌弱毒株及其疫苗被批准和应用。

2007—2012年间，本实验室陆续从我国不同省份和地区牛、羊、犬和鹿等动物体内分离到羊种布鲁氏菌74株。研究过程中，我们对分离的74株羊种布鲁氏菌进行了毒力测定，发现了3 株布鲁氏菌毒力较弱，本发明对这3株布鲁氏菌进行了诱导和驯化，筛选获得了一株粗糙型羊种布鲁氏菌，命名为RM57。对RM57的遗传稳定性、粗糙型特性、毒力、安全性、免疫原性等方面进行了全面研究，证明该粗糙型羊种布鲁氏菌适合作为布鲁氏菌疫苗株，并研究了该疫苗的生产方法。

发明内容

本发明采用低浓度氯霉素(1μg/ml)与羊种布鲁氏菌抗血清(M因子血清)相结合的诱导方法，筛选获得了一株遗传稳定的粗糙型布鲁氏菌RM57株。RA57株安全性高，免疫效果好，用该菌制备的疫苗免疫动物后，其血清可用常规的凝集试验与自然感染相区分。

本发明的技术方案为：

1.一株粗糙型羊种布鲁氏菌弱毒株，其特征在于采用氯霉素与M因子血清相结合的筛选方法，筛选获得了一株不干扰布病临床诊断的粗糙型羊种布鲁氏菌，用该菌制备的疫苗免疫动物后，其血清可用常规的凝集试验与自然感染相区分，命名为羊种布鲁氏菌(Brucella melitansis)RM57株，该菌株已于2015年05月22日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号为：CGMCC No.10836。

2.如权利要求1所述的一株粗糙型羊种布鲁氏菌弱毒株，其特征在于该菌株制备的疫苗免疫动物后，其血清可用常规的凝集试验与自然感染相区分。

3.一种布鲁氏菌活疫苗的生产方法，其特征在于用胰大豆肉汤作为RM57的培养基，灭菌后按培养基量的按1％～2％接入RM57株种子菌液，37℃，按常规方法发酵培养28～38h，加入兽用生物制品常用的蔗糖明胶稳定剂，充分混匀、分装疫苗瓶中后经冷冻真空干燥，即成为粗糙型羊种布鲁氏菌病疫苗(RM57株)。

本发明是通过以下步骤实现的：

1候选株的筛选从74株羊种布鲁氏菌田间分离株中，通过有限稀释法和菌落结晶紫染色获得7株形态稳定的候选株。再参照《兽医生物制品规程》中布鲁氏菌疫苗种毒毒力测定方法，采用豚鼠脾脏含菌量测定7株候选菌株的毒力，筛选毒力最低的3株布鲁氏菌，标记为1^#、2^#和3^#。

2.候选株的诱导和驯化首先将3株候选疫苗株在含低浓度氯霉素(1μg/ml)的TSA培养基上连续40代。根据第40代菌落结晶紫染色情况，筛选1株进行驯化。结果：1^#菌落结晶紫染 色的阳性率约9％，2^#和3^#菌落结晶紫染色的阳性率分别为1.4％和2.2％。挑取1^#菌中的粗糙型菌落作为种子，用布鲁氏菌M因子血清(本实验室保存)进一步驯化，将不与M因子血清发生凝集的细菌反复传代，待该细菌的粗糙型菌落比例达90％左右时，改用双倍效价的M因子血清继续诱导。最终将获得的遗传稳定的粗糙型布鲁氏菌，通过M因子驯化共进行57代，将该粗糙型菌命名为RM57株。

3.RM57株的全面检定对粗糙型布鲁氏菌RM57进行详细的菌种检定包括形态和生化特性，血清学和PCR反应特异性，以及对豚鼠的毒力等。

4.制备疫苗参照《兽医生物制品规程》，按布病疫苗的经典方法制备粗糙型羊种布鲁氏菌病活疫苗(RM57株)，用于预防动物布鲁氏菌病。

发明的详细描述

1.羊种布鲁氏菌分离株的筛选

(1)根据形态和稳定性初步筛选将本实验室自2007年-2012年从田间分离的羊种布鲁氏菌74株，通过有限稀释法培养单个菌落，挑选菌落大小均匀，结晶紫染色菌落阳性率低于1％的候选布鲁氏菌7株，用于豚鼠测毒。

(2)通过豚鼠筛选第毒力候选菌参照《兽医生物制品规程》中布鲁氏菌疫苗种毒毒力测定方法，采用豚鼠脾脏含菌量测定7株候选菌株的毒力，将7株布鲁氏菌分别在TSA平板上增殖培养后，收集菌体，用无菌生理盐水将各细菌浓度调节到1×10⁹CFU/ml。取350-400g雌性豚鼠35只，分为7组，5只/组，对应7株候选菌组。将候选菌株分别以1ml/只腹股沟皮下注射各试验组豚鼠，14日后观察脏器病变情况，同时取脾脏，混合称重，制成乳剂，接种TSA平板，根据细菌生长数量计算每1克脾脏含菌量。结果有3株分离株毒力较低，分别为1.9×10⁶CFU/g，1.7×10⁶CFU/g，2.0×10⁶CFU/g，其余4株均在5×10⁶CFU/g以上。将毒力较低的3株菌，分别标记为1^#、2^#和3^#。

2.候选株的诱导和驯化

(1)氯霉素的诱导将筛选出的3株低毒力布鲁氏菌在含氯霉素(1μg/ml)的TSA培养基上传代，在往下一代传代时，采用有限稀释法进行，并同时对平板上的菌落进行结晶紫染色。选取结晶紫染色着色程度最明显的菌落继续传代，如果未出现结晶紫染色阳性的菌落，则随机挑取，以此方法共传了40代。结果到第40代时，1^#菌落结晶紫染色的阳性率约9％，2^#和3^#菌落结晶紫染色的阳性率分别为1.4％和2.2％，选取1^#菌继续进行M因子血清的驯化。

(2)光滑型羊种布鲁氏菌抗血清(M因子血清)的驯化挑取1^#菌单个菌落接种到TSB液体培养基中培养48h，用无菌生理盐水调节菌液浓度约20-30亿/ml(此时OD600＝0.1)。取0.5ml菌液加入0.5ml M因子血清(无菌过滤，含2个凝集单位/ml)，充分混匀后，37℃静置孵育2h，再转移到4℃冰箱静置12h。轻吸上层未凝集的菌液20μl，转移接种到新鲜TSB培养基中，继续培养，如此反复诱导筛选35代。每5代通过有限稀释法获得单个菌落，并进行菌落结晶紫染色，挑取结晶紫35着色的单菌落继续传代。到第40代时结晶紫染色能着色的菌落比例达85％。将M因子血清效价调整为4个凝集单位/ml，按上述方法继续诱导10代，此时几乎所有菌落全能着色。将诱导获得的细菌以1×10⁹CFU/只剂量接种雌性成年豚鼠(体重为350～400g)，14天后剖杀，取脾脏进行细菌分离，并进行粗糙型特性鉴定。共在豚鼠体内传代12次，获得了表型稳定的粗糙型羊种布鲁氏，该菌经M因子血清驯化筛选了45代，在豚鼠体内传代了12代，命名为羊种布鲁氏菌(Brucella melitansis)RM57株，该菌株已于2015年05月22日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号为：CGMCC No.10836。

3.粗糙型羊种布鲁氏菌RM57株的菌种鉴定 

(1)形态和生化特性菌落边缘整齐、圆润，露滴状，斜光照射，逆光观察微带蓝色乳光。染色形态为球杆菌，单个散在，不形成芽孢和荚膜。大小在0.3-0.6μm之间。革兰氏染色为阴性。该菌的生长不依赖于CO₂，能在含硫瑾和碱性复红的培养基上生长，H₂S试验强阳性。

(2)特异性

1)血清学特异性以培养物制成抗原，与光滑型布鲁氏菌阳性血清应不出现凝集，与粗糙型血清应出现凝集。

2)PCR

特异性合成如下4条引物，将其配成引物混合储存液，各引物浓度均为25μM。

Feri：5’-GCGCCGCGAA GAACTTATCA A-3’(序列1)

Reri:5’-CGCCATGTTA GCGGCGGTGA-3’(序列2)

F_abortus:5’-GACGAACGGA ATTTTTCCAA TCCC-3’(序列3)

R_IS711:5’-TGCCGATCAC TTAAGGGCCT TCAT-3’(序列4)

模板：以RM57培养菌落或试剂盒提取的RM57基因组DNA。

PCR反应体系：50μL的反应体系中，含5μL 10×Buffer，8μL2.5mMdNTPs，混合引物储 存液2μL，Taq酶2U，模板DNA 1μL(或挑取菌落少许)。

PCR反应程序：95℃5min后，按94℃1min、60℃1.5min、72℃1.5min进行28个循环，最后72℃10min。

结果：扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳鉴定，应出现2条特异性PCR条带，大小分别为178bp和733bp。[注：根据《Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2011》Chapter 2.4.3Bovine brucellosis推荐的对布鲁氏菌种属鉴定的AMOS-PCR方法：牛种、猪种、羊种布氏杆菌均应能扩增出大小为178bp的属特异性条带；牛种布氏杆菌应能扩增出大小为498bp的条带；猪种布氏杆菌应能扩增出大小为285bp的条带；羊种布氏杆菌应能扩增出大小为733bp的条带。]

(3)毒力用生理盐水将在固体培养基上培养48-72h的培养物洗下，稀释成每毫升含活菌10亿的悬液，腹股沟皮下注射体重350-400g的豚鼠(Hartley品系)5只，1ml/只。经14-15日后剖杀，取脾脏，混合称重，制成乳剂，接种TSA平板，根据其生长的菌落数，计算吞噬脾脏的含菌量，每1g脾脏含菌量应不超过20万个。

(4)粗糙型特性热凝集试验、吖啶黄凝集试验、菌落结晶紫染色试验结果符合粗糙型布鲁氏菌的特点，即热凝集试验阳性，吖啶黄凝集试验阳性，能被结晶紫染色。

(5)安全检验将RM57活菌用生理盐水稀释成1ml含活菌10亿，皮下注射体重18～20g的小白鼠5只，每只0.1ml，6日应全部健活。

(6)免疫原性用生理盐水将RM57稀释成每毫升含50亿CFU菌的悬液，皮下注射体重350～400g的豚鼠10只，每只0.1ml。30日后，用3个最小感染量的强毒布鲁氏菌M28菌株(约30个CFU)接种攻毒，攻毒后30天剖杀，取脾脏捣碎作布鲁氏菌分离培养，75％以上的豚鼠应无强毒出现。

(7)遗传稳定性RM57在TSA培养基上传30代，其形态和生化特性、培养特性、血清学和PCR特异性、毒力、粗糙型特性、安全性及免疫原性未发生改变。

4.疫苗制备与质量标准

(1)按布鲁氏菌S2株作为生产菌株生产布鲁氏菌活疫苗的常规方法，将羊种布鲁氏菌(Brucella melitansis)RM57株菌种接种于适宜培养基，收获培养物，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成活疫苗(中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程二○○○年版.化学工业出版社，2001，本发明简称《规程》)。用于预防动物布鲁氏菌病。用胰大豆肉汤(TSB，美国BD公司)或用于布鲁氏菌S2菌株疫苗生产用培养基(如马丁汤、胰眎肉汤、肝汤等)均 可作为本发明的疫苗生产用培养基。培养基灭菌后按培养基量的1％～2％接入RM57种子菌液，37℃培养48～72h，加入兽用生物制品常用的蔗糖明胶稳定剂，充分混匀、分装于疫苗瓶中后立即进行冷冻真空干燥，即成为RM57活疫苗，命名为羊种布鲁氏菌病活疫苗(RM57株)。冷冻真空干燥后的疫苗按质量标准立即进行成品检验。

(2)质量标准本标准涉及到的相关检验方法按中华人民共和国兽药典(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二○一〇年版(三部).中国农业出版社，2011，本发明称《中国兽药典》)的方法进行。

1)疫苗应为疏松团快，加入稀释液后能迅速(1min内)溶解；

2)疫苗应纯粹无其他细菌；

3)将疫苗稀释成每1ml含1×10⁹CFU活菌，腹股沟皮下接种18～20g的昆明系小白鼠5只，各0.25ml/只，观察6日，应全部健活；

4)对疫苗进行活菌计数，应不低于核定的头份数。猪200亿/头份，羊200亿/头份，牛800亿/头份。

(3)成品检验

本发明涉及到的相关检验方法按《中国兽药典》的方法进行

(1)物理性状疫苗应为疏松团快，加入稀释液后能迅速(1min内)溶解；

(2)纯粹检验疫苗应纯粹无其他细菌；

(3)安全检验将疫苗稀释成每1ml含1×10⁹CFU活菌，腹股沟皮下接种18～20g的昆明系小白鼠5只，各0.25ml/只，观察6日，应全部健活；

(4)活菌计数用TSA进行活菌计数对疫苗进行活菌计数，每头份活菌数应不低于核定的头份数。

(5)免疫原性用生理盐水将RM57株活疫苗稀释成每毫升含50亿CFU菌的悬液，皮下注射体重350～400g的豚鼠10只，每只0.1ml。30日后，用3个最小感染量的强毒布鲁氏菌M28菌株(约30个CFU)接种攻毒，攻毒后30天剖杀，取脾脏捣碎作布鲁氏菌分离培养，75％以上的豚鼠应无强毒出现。

微生物资源信息

本发明中涉及的微生物资源为羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis)RM57株，该株菌是 2010年本实验室从内蒙某羊场流产羊体内分离到一株羊种布鲁氏菌(Brucellamelitensis)分离株，经抗菌素诱导及M因子血清驯化而获得一株粗糙型弱毒菌株，命名为羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis)RM57株，该株均已于2015年05月22日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号为：CGMCC No.10836；羊种布鲁氏菌BM28菌(即为CVCC 920株，由中国兽医微生物菌种保藏管理中心保藏和供应，见中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著.中国兽医菌种目录第二版，中国农业科技出版社，2002，p29.)

本发明的优点 

本发明涉及一株粗糙型羊种布鲁氏菌弱毒株及其疫苗。该疫苗株通过抗菌素与M因子血清相结合的驯化和筛选技术，筛选出一株粗糙型羊种布鲁氏菌弱毒株RM57。该粗糙型弱毒株的安全性显著提高，但仍保留了对布鲁氏菌良好的免疫效果。利用该弱毒株制备成布鲁氏菌病疫苗，将改变布鲁氏菌疫苗免疫动物与野毒株感染动物难以区分的现状，并有效提高现有疫苗的安全性。

附图说明

附图1羊种粗糙型布鲁氏菌RM57的PCR鉴定图谱，图中1:大肠杆菌阴性对照；2:DNAMarker；3:RM57菌株的PCR扩增结果。

实施例

以下实施例为进一步说明本发明，不对本发明构成限制。

实施例1

胰大豆肉汤(TSB，美国BD公司)或其它适宜培养基作为粗糙型布鲁氏菌疫苗株(RA343)的培养基，按培养基量加入适量的常用消泡剂，灭菌后按培养基量的1％～2％接入羊种布鲁氏菌(Brucella melitansis)RM57株种子菌液，在36～37℃逐渐加大通气量，按常规方法发酵培养36h，，培养过程中可根据需要加入50％的葡萄糖溶液，每次加入量为培养基总量的1％～2％。

培养完成，取样用胰大豆琼脂培养基按《中国兽药典》规定的方法作纯粹检验，为纯粹。 同时取样用TSA进行活菌计数，供浓缩时参考。

将纯粹检验合格的菌液，按总量0.1％～0.2％加入羧甲基纤维素钠，使菌体沉淀，吸去上清液，置2～8℃暂存，待分装。

取浓缩的菌液按《中国兽药典》规定的方法进行纯粹检验，为纯粹。

取浓缩的菌液按《中国兽药典》规定的方法用TSA进行活菌计数，作为配苗时的参考。

经检验合格的菌液，按其菌数加入兽用生物制品常用的pH 7.0蔗糖明胶稳定剂(《规程》)，使其最终含量为5％～10％蔗糖和1％～1.5％明胶，加入最终含量为1％～3％的硫脲，也可使用其它合适的冻干保护剂。充分混匀后按800亿～1000亿CFU/ml的剂量定量分装。分装后疫苗瓶迅速冷冻真空干燥后即成为粗糙型羊种布鲁氏菌病活疫苗(RM57株)。

实施例2

成品检验

本发明涉及到的相关检验方法按《中国兽药典》的方法进行

(1)物理性状疫苗应为疏松团快，加入稀释液后均于1min内能迅速溶解；

(2)纯粹检验疫苗均纯粹无其他细菌；

(3)安全检验将疫苗稀释成每1ml含1×10⁹CFU活菌，腹股沟皮下接种18～20g的昆明系小白鼠5只，各0.25ml/只，观察6日，均全部健活(结果见表1)；

表1 布鲁氏菌病活疫苗(RM57株)安全检验结果

-：健康存活，注射部位无异常；+：死亡或发病。

(4)活菌计数用TSA培养基进行活菌计数对疫苗进行活菌计数，每头份活菌数均不低于核 定的头份数。

(5)免疫原性用生理盐水将RM57株活疫苗稀释成每毫升含50亿CFU菌的悬液，皮下注射体重350～400g的豚鼠10只，每只0.1ml。30日后，用3个最小感染量的强毒羊种布鲁氏菌M28株(约30个CFU)接种攻毒，攻毒后30天剖杀，取脾脏捣碎作布鲁氏菌分离培养，80％以上的豚鼠均无强毒出现，结果见表2。

表2 布鲁氏菌病活疫苗(RM57株)免疫原性检验结果

注：+：分离到菌，判为不保护；-：未分离到菌，判为保护。*：小鼠编号 。