一种位点突变的嗜热异常球菌IrrE蛋白及其应用

摘要

本发明用位点突变方式对嗜热异常球菌Deinococcus geothermalis中的IrrE蛋白及其同源蛋白进行了功能基序的氨基酸优化，将功能域基序154LAELAR159中第二位或第五位丙氨酸突变为丝氨酸。实验证明，功能域优化序列能够显著提高IrrE蛋白及其同源蛋白的抗逆功能，尤其是对其表达菌株的紫外胁迫抗性作用可提高10倍以上。

说明书

技术领域

本发明涉及一种位点突变的嗜热异常球菌IrrE蛋白，具体涉及功能域优化的嗜热异常 球菌Dgeo0395同源蛋白，以及该类蛋白在增强原核宿主对干燥、氧化和紫外线辐照抗性 方面的应用。

背景技术

IrrE是嗜热异常球菌(Deinococcus geothermalis)重要的调控蛋白，由Dgeo0395基因 编码。根据NCBI(美国国立生物技术信息中心)数据库的信息，目前发现的Dgeo0395同 源蛋白共有23个。已知Dgeo0395能够特异性响应胁迫信号，提高该菌株本身抗击基因的 表达。

但目前未见嗜热异常球菌中的Dgeo0395蛋白在增强其他生物干燥、氧化和紫外线辐 照抗性功能的研究报道。也未见到对此类蛋白的关键功能基序进行分析，并通过定点突变 使功能优化的报道。

发明内容

本发明的目的是对Dgeo0395基因编码蛋白的关键功能基序进行优化，获得调控能力 更好的新蛋白序列，以大大提高重组菌株的抗性。

本发明通过同源建模方式分析调控蛋白Dgeo0395的结构域。发现Dgeo0395由三个结 构域组成，其中HTH结构域是参与靶标基因启动子结合作用。其HTH结构域由3个α螺 旋(α6、α7和α8)组成。

其中α7螺旋上含有重要的功能域基序“154LAELA159”。目前NCBI数据库中23个 Dgeo0395的同源蛋白的蛋白序列中均含有此段功能域基序序列，而且，此段功能域基序仅 发现于异常球菌属(Deinococcus)菌株(图1)。

本发明利用氨基酸定点突变的方法，通过抗逆实验结果，分析比较此段基序中的不同 位点氨基酸残基对整个调控蛋白Dgeo0395抗逆作用的影响，找到了对嗜热异常球菌调控 蛋白Dgeo0395的重要功能域基序154LAELAR159进行氨基酸优化的突变方式。

具体研究工作如下：

Dgeo0395基因的功能域基序的氨基酸优化

1)对嗜热异常球菌Dgeo0395的氨基酸序列(如SEQ ID NO.2所示)进行结构域功 能分析。并对其重要的功能域基序154LAELAR159(如SEQ ID NO.3所示)，进行氨基酸 定点突变。

以下是Dgeo0395氨基酸序列，其中，下划线部分是功能域基序154LAELAR159。 MTQGQTPPEELSADPSPETGALAPAKARMRELATAYARRLPGLDTHSLMSGLDATLTFMPMGDRDGA YDPEHRVVLINSRVRPERQRFTLAHEISHALLLGDDDLLSDLHDAYEGERLEQVIETLCNVGAAAILMP ETLIDELLARFGPSGRARADVSASSALYALAERTSVPVLYAVCAVSRLEAESGEERLPEKALTV RASAGSPGVKYSLRPGTLIPDDHPVAVALETRLPITQESYVPFRSGRRMPAYVDAFPERQRVLVSFALLP KATKGGEQDESGV

所述定点突变是功能域基序154LAELAR159上第二位丙氨酸(155A)和/或第五位丙氨 酸(158A)突变为丝氨酸。

其中，功能域基序154LAELAR159中第二位的丙氨酸突变为丝氨酸，序列如SEQ ID  NO.4所示；第五位的丙氨酸突变为丝氨酸，序列如SEQ ID NO.5所示。见下表：

表1Dgeo0395基因的功能域基序的氨基酸优化

序列号 序列 备注 3 Leu Ala Glu Leu Ala Arg 154LAELAR159 4 Leu Ser Glu Leu Ala Arg 第二位丙氨酸突变为丝氨酸 5 Leu Ala Glu Leu Ser Arg 第五位丙氨酸突变为丝氨酸

2)构建突变基因的重组工程菌株，鉴定重组菌株的干燥、氧化和紫外线辐照胁迫的 抗性

此实验表明：功能域基序154LAELAR159对嗜热异常球菌Dgeo0395的功能发挥十分 重要。表达嗜热异常球菌Dgeo0395优化蛋白(Dgeo0395-A155S和Dgeo0395-A158S)的 重组菌株与优化前的重组菌株相比，紫外线辐照抗性提高达10倍以上(见实施例3及图4、 5)。

3)对嗜热异常球菌Dgeo0395同源蛋白DR-0167(如SEQ ID NO.6所示)和 DGo_CA2805(如SEQ ID NO.7所示)相同功能域基序进行氨基酸定点突变及紫外线辐照 胁迫抗性分析。

此实验表明：本发明提及的功能域基序功能及改造方案不仅适用于嗜热异常球菌 Dgeo0395蛋白，也同样适用于Dgeo0395的众多同源蛋白。表明该功能域基序改造在同源 蛋白紫外抗逆性功能中作用的通用性。

序列表信息

SEQ ID NO.1：Dgeo0395基因的DNA序列；

SEQ ID NO.2：Dgeo0395的氨基酸序列；

SEQ ID NO.3～5：见表1；

SEQ ID NO.6：DR-0167的氨基酸序列；

SEQ ID NO.7：DGo_CA2805的氨基酸序列。

附图说明：

图1Dego0395及其同源蛋白系统发育树。横线标注的是Dgeo0395蛋白，图中蛋白序 列包含为目前发现的所有Dgeo0395同源蛋白，共23条。数据来自NCBI(美国国立生物 技术信息中心)数据库。

图2是含有嗜热异常球菌Dgeo0395序列的PCR产物及载体验证电泳图谱；

Lane 1:2K plus Marker；Lane 2～3:PCR product of pJET-0395；Lane 4:pRADZ3-0395/ NdeI；Lane 5:pRADZ3-0395/NdeI+Spe I；Lane 6:pRADZ3-0395/Spe I；Lane 7: pRADZ3-0395/NdeI+Spe I

图3紫外辐照、丝裂霉素C氧化和干燥胁迫冲击前后，含有空载体菌株(JM-Z3)和 含有嗜热异常球菌Dgeo0395基因的原核表达载体的大肠杆菌(JM-0395)的生长情况对比；

图4丝裂霉素C氧化和干燥胁迫冲击前后，含有功能域基序突变载体的菌株 JM-A155S和JM-A158S与含有嗜热异常球菌Dgeo0395基因的原核表达载体的大肠杆菌 (JM-0395)的生长情况对比；

图5紫外辐照胁迫冲击前后，含有功能域基序突变载体的菌株JM-A155S和JM-A158S 与含有嗜热异常球菌Dgeo0395基因的原核表达载体的大肠杆菌(JM-0395)的生长情况对 比。

图6紫外辐照胁迫冲击前后，含有功能域基序突变载体的菌株JM-A155S和JM-A158S 与含有嗜热异常球菌Dgeo0395基因的原核表达载体的大肠杆菌(JM-0395)的生存曲线。

图7Dego0395及其同源蛋白序列比对及结构分析。框区为本发明提及功能域基序。 图中蛋白序列包含为目前发现的所有Dgeo0395同源蛋白，共15条。数据来自NCBI(美 国国立生物技术信息中心)数据库。

图8紫外辐照胁迫冲击前后，表达耐辐射异常球菌DR-0167的大肠杆菌(JM-DR0167) 与表达功能域基序突变蛋白的菌株JM-A181S和JM-A184S的生长情况对比。

图9紫外辐照胁迫冲击前后，表达戈壁射异常球菌DGO-CA2805的大肠杆菌 (JM-CA2805)与表达功能域基序突变蛋白的菌株JM-S131A的生长情况对比。

具体实施方式

以下实施例中所举的质粒、菌株只用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的 实质内容加以限制。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件， 例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例中所举的质粒、菌株来源如下：

克隆载体pJET：为ThermoFisher公司市售产品；

穿梭质粒pRADZ3：为本实验室保存；

大肠杆菌JM 109：为北京全式金公司市售产品。

实施例1嗜热异常球菌Dgeo0395基因序列在大肠杆菌中的表达

一、实验方法

1.根据已公布的嗜热异常球菌菌株DSM 11300基因组中的Dgeo0395基因序列设计1 对PCR特异性引物：

0395-F：5′ACCACTAGT ATGACGCAGGGCCAGACCCC 3′

0395-R：5′ACCCATATG TCAGACACCCGACTCATCCT 3′

2.通过PCR方法从嗜热异常球菌菌株DSM 11300基因组DNA中扩增出目的基因序 列。

反应条件：94℃10min，[94℃30sec，60℃30sec，72℃1.5min]35个循环，72℃ 10min。

3.PCR产物经胶回收后，克隆于载体pJET上，命名为pJET-0395，并测序验证；然后 通过SpeI/NdeI双酶切获得含有粘性末端的Dgeo0395基因及含有groEL启动子的pRADZ3 载体，将Dgeo0395基因连接于pRADZ3载体上，构建大肠杆菌表达载体pRADZ3-0395。

4.将该表达载体转化大肠杆菌JM109，经PCR、酶切，测序验证插入序列正确(见图 2,3)，将该菌株命名为JM-0395。含有pRADZ3空质粒的E.coli JM109命名为JM-Z3。

二、实验结果

成功构建了表达Dgeo0395的重组大肠杆菌工程菌株。

实施例2含嗜热异常球菌菌株Dgeo0395基因重组工程菌株的胁迫抗性实验

一、实验材料

重组工程菌株：实施例1得到的含有嗜热异常球菌菌株Dgeo0395的JM-0395菌株

对照菌株：实施例1所述含空质粒的JM-Z3菌株。

二、实验方法

1.将对照菌株和重组工程菌株在LB固体培养基平板上划线活化；

2.挑取单菌落接种于添加有相应抗生素的液体LB培养基中，37℃培养至指数中后期；

3.室温下6,000rpm离心5min收集菌体，然后用相同体积的磷酸缓冲液(pH 7.0)将 菌体洗涤两次，震荡均匀；

接下来进行紫外辐照抗性、丝裂霉素C抗性和干燥抗性实验

A.紫外辐照(UV)抗性分析：

1)将菌液分为等体积两份；

2)一份于室温下6,000rpm离心5min后收集菌体，作为对照；

3)取另一份菌液经紫外辐照5min后，室温下6,000rpm离心5min后收集菌体；

4)取不同时间段的菌液，10倍稀释至10^-5，取10μL点在LB固体培养基平板上， 37℃培养2d，观察，记录不同菌株的生长情况；

5)取不同时间段的菌液，10倍稀释至10^-5，取200μL涂布LB固体培养基平板，37℃ 培养2d，记录菌落数量，计算菌株生存率，实验重复3次。

B.丝裂霉素C氧化抗性分析：

1)将菌液分为等体积两份；

2)一份于室温下6,000rpm离心5min后收集菌体，作为对照；

3)将菌体重悬于终浓度为10μg/mL的丝裂霉素C的LB液体培养基中，30℃，220 rpm摇床培养5min，10min，15min；

4)取不同时间段的菌液，10倍稀释至10^-5，取10μL点在LB固体培养基平板上， 37℃培养2d，观察，记录不同菌株的生长情况；

5)取不同时间段的菌液，10倍稀释至10^-5，取200μL涂布LB固体培养基平板，37℃ 培养2d，记录菌落数量，计算菌株生存率，实验重复3次。

C.干燥抗性分析：

1)将菌液分为等体积两份；

2)一份于室温下6,000rpm离心5min后收集菌体，作为对照；

3)另一份分装于敞口的EP管中，置于无菌干燥器内(以颗粒状硅胶作为干燥剂)；

4)每隔10d取出一个批次的几种不同菌株，倍比稀释至10-5，取10μL点在LB固 体培养基平板上，37℃培养2d，观察，记录不同菌株的生长情况；

5)取不同时间点的菌液，10倍稀释至10-5，取200μL涂布LB固体培养基平板，37℃ 培养2d，记录菌落数量，计算菌株生存率，实验重复3次。

三、实验结果

如图3显示，紫外辐照、丝裂霉素C和干燥胁迫冲击前，含有嗜热异常球菌菌株 Dgeo0395的JM-0395菌株与含空质粒的JM-Z3菌株生长状态基本一致；

紫外辐照、丝裂霉素C和干燥胁迫冲击后，含有嗜热异常球菌菌株Dgeo0395基因的 JM-0395重组菌株生长状况良好，菌落显著数多于只含空质粒的JM-Z3菌株(见图5)。 其中紫外辐照抗性和干燥胁迫抗性较对照菌株提高2个数量级，约100倍；丝裂霉素C氧 化胁迫抗性提高3个数量级，约1000倍。

通过菌株胁迫后的生存率计算可以清楚的发现：

UV辐照后对照菌株存活率为0.644％±0.052％；表达菌株Dgeo0395的JM-0395菌株 存活率为45.570％±3.797％，比对照菌株提高近70倍。

干旱胁迫处理后对照菌株存活率为3.040％±0.929％，而JM-0395菌株存活率为 88.889％±7.274％，比对照菌株提高近30倍。

丝裂霉素C氧化胁迫后对照菌株几乎都已经死亡，而JM-0395菌株存活率为58.642％ ±4.660％，菌株生存能力显著高于对照菌株。

表2是紫外辐照、丝裂霉素C氧化和干燥胁迫冲击前后，含有空载体菌株(JM-Z3) 和含有嗜热异常球菌Dgeo0395基因的重组大肠杆菌菌株(JM-0395)存活率比较。

表2三种胁迫处理后菌株存活率比较

四、实验结论

嗜热异常球菌菌株Dgeo0395基因显著增强了原核生物抵抗紫外辐射、氧化和干燥胁 迫的能力。

实施例3嗜热异常球菌Dgeo0395基因的功能域基序的氨基酸优化序列构建

根据同源基因序列比对分析数据，对嗜热异常球菌Dgeo0395表达蛋白的重要功能域 基序154LAELAR159进行了氨基酸序列优化。

一、实验方法

对嗜热异常球菌调控蛋白Dgeo0395的重要功能域基序154LAELAR159进行了氨基酸 优化。通过同源建模方式分析调控蛋白Dgeo0395的结构域。Dgeo0395由三个结构域组成， 其中HTH结构域是参与靶标基因启动子结合作用。其HTH结构域由3个α螺旋(α6、α7 和α8)组成，其中α7螺旋上含有重要的功能域基序154LAELA159。目前NCBI数据库中 Dgeo0395的同源蛋白共发现23条序列，仅发现于异常球菌属(Deinococcus)菌株(图1)。 这些蛋白序列中均含有此段功能域基序。利用氨基酸定点突变的方法，分析此段基序中的 不同位点氨基酸残基对整个调控蛋白Dgeo0395抗逆作用的影响。

1.通过氨基酸定点突变的方式对将嗜热异常球菌Dgeo0395的氨基酸序列进行功能域 基序154LAELAR159进行优化分析。利用融合PCR的方法将目标位点编码氨基酸的核苷 酸序列进行突变，进而获得改位点突变的蛋白突变体。选取的突变位点是154L、155A、 157L、158A和159R。分别将154位亮氨酸突变为缬氨酸，155位丙氨酸突变为丝氨酸， 157为亮氨酸突变为缬氨酸，158位丙氨酸突变为丝氨酸，159位精氨酸突变为赖氨酸。

引物序列如下：

a-0395-F：5′accactagtatgacgcagggccagacccc 3′

d-0395-R：5′acccatatgtcagacacccgactcatcct 3′

b1-L154V-F:5′gggcgtgcgGTGgctgagctggcgcggcgggcagacgtga 3′

c1-L154V-R:5′tcacgtctgcccgccgcgccagctcagcCACcgcacgccc 3′

b2-A155S-F:5′gggcgtgcgctgAGCgagctggcgcggcgggcagacgtga 3′

c2-A155S-R:5′tcacgtctgcccgccgcgccagctcGCTcaccgcacgccc 3′

b3-L157V-F:5′gggcgtgcgctggctgagGTGgcgcggcgggcagacgtga 3′

c3-L157V-R:5′tcacgtctgcccgccgcgccagCACagccaccgcacgccc 3′

b4-A158S-F:5′gggcgtgcgctggctgagctgAGCcggcgggcagacgtga 3′

c4-A158S-R:5′tcacgtctgcccgcccGCTcagctcagccaccgcacgccc 3′

b5-R159K-F:5′gggcgtgcgctggctgagctggcgAAGcgggcagacgtga 3′

c5-R159K-R:5′tcacgtctgcccgCTTcgccagctcagccagcgcacgccc 3′

2.在待突变的核酸位点处设计两条包含定点突变序列的引物b和c，同时设计该基因 的上下游引物a和d。分别用引物a、b与c、d以基因组为模板PCR扩增得到两个片段1、 2，然后将1、2两片段按摩尔比1:1混合后作为模板，用引物a、d将这两个片段进行融合。

片段1、2反应条件：94℃10min，[94℃30sec，60℃30sec，72℃1.5min]30个 循环，72℃10min。

融合反应条件：94℃10min，[94℃30sec，60℃30sec，72℃2min]40个循环， 72℃10min。

3.将获得的重组突变片段连接载体pRADZ3并进行大肠杆菌转化(方法参考实施例 1)，获得重组工程菌株JM-L154V、JM-A155S、JM-L157V、JM-A158S-F、JM-R159K。

二、实验结果

成功构建了表达嗜热异常球菌调控蛋白Dgeo0395的重要功能域基序154LAELAR159 氨基酸位点突变的的重组工程菌株JM-L154V、JM-A155S、JM-L157V、JM-A158S-F、 JM-R159K。

实施例4表达嗜热异常球菌菌株Dgeo0395蛋白重要功能域基序154LAELAR159优化重 组工程菌株的胁迫抗性实验

一、实验目的

鉴定各重组菌株的干燥、氧化和紫外线辐照胁迫的抗性，并与空白对照及出发菌株比 较。

二、实验材料

重组工程菌株：实施例3得到的表达嗜热异常球菌调控蛋白Dgeo0395的重要功能域 基序154LAELAR159氨基酸位点突变的的重组工程菌株：JM-L154V、JM-A155S、 JM-L157V、JM-A158S、JM-R159K。

对照菌株：

实施例1所述含空质粒的JM-Z3菌株；

实施例1所述含有嗜热异常球菌菌株Dgeo0395的JM-0395菌株。

三、实验方法

各菌株对干燥、氧化和紫外线辐照三种胁迫的抗性的实验方法按照实施例2实验方法 进行。

四、实验结果

1、紫外(UV)胁迫

结果见下表

表2紫外线辐照胁迫下各菌株存活率比较

UV胁迫处理10分钟时，对照菌株JM-Z3已经全部死亡，表达嗜热异常球菌Dgeo0395 基因重组菌株JM-0395的存活率下降为0.125％，而表达Dgeo0395优化基因的重组菌株 JM-A155S的存活率为1.263％，表达Dgeo0395优化基因的重组菌株JM-A158S的存活率 最好，仍为62.5％。

UV胁迫处理15分钟时，表达嗜热异常球菌Dgeo0395基因重组菌株JM-0395的存活 率进一步降低为0.014％，而表达Dgeo0395优化基因的重组菌株JM-A155S的存活率为 0.197％，表达Dgeo0395优化基因的重组菌株JM-A158S的存活率保持在12％左右(表2)。

UV辐照生存曲线显示，功能域基序154LAELAR159中155位的丙氨酸突变为丝氨酸， 如SEQ ID NO.4所示，使重组菌株在辐照15分钟时的存活率比突变前提高约15倍；而 158位的丙氨酸突变为丝氨酸，如SEQ ID NO.5所示，使得重组菌株在辐照15分钟的存 活率比突变前提高近900倍(表2、图6)。

2、重组菌株JM-A155S和JM-A158S的干燥和氧化胁迫抗性

重组菌株JM-A155S和JM-A158S的干燥和氧化胁迫抗性与突变前重组菌株JM-0395 一致(见图4)。但重组菌株JM-A155S和JM-A158S

五、实验结论

1、功能域基序优化的重组菌株JM-A155S和JM-A158S对紫外线辐胁迫抗性显著高于 出发菌株JM-0395，提高10倍以上(图5)。因此证明，154LAELAR159中，155位和158 位丙氨酸是提高抗紫外线辐胁迫功能的活性位点。

2、重组菌株JM-L154V、JM-L157V和JM-R159K对干燥、氧化和紫外线辐照胁迫抗 性与菌株JM-0395一致，均高于空质粒菌株。证明，154LAELAR159中，L154V、L157V 和R159K位点的突变不影响出发菌的抗逆活性，即，对Dgeo0395的调控作用没有影响。

3、嗜热异常球菌Dgeo0395的功能域基序154LAELAR159具有提高蛋白Dgeo0395抗 逆功能的重要作用。

实施例5耐辐射异常球菌中IrrE同源蛋白功能域基序的氨基酸优化序列改造及紫外抗性 实验鉴定

一、实验目的

利用NCBI数据库基因信息对Dgeo0395同源蛋白序列进行比对分析(见图1、7)。 Dgeo0395在耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)中的同源蛋白是DR0167，该蛋白 在α7位置同样含有本发明发现的重要功能域基序180LAELAR185，氨基酸序列与 Dgeo0395相同(见图7)。对耐辐射异常球菌中的同源蛋白DR0167的重要功能域基序 180LAELAR185中第二位或第五位丙氨酸进行优化突变改造，鉴定该功能域基序在重组突 变蛋白紫外抗逆性功能中的作用。

二、实验方法

1.通过氨基酸定点突变的方式对耐辐射异常球菌IrrE同源蛋白DR0167的氨基酸序 列进行空间结构相同位置功能域基序180LAELAR185进行优化分析。同样利用融合PCR 的方法将目标位点编码氨基酸的核苷酸序列进行突变，进而获得改位点突变的蛋白突变 体。选取的突变位点是为功能域基序中的两个丙氨酸，181A和184A。分别将181位丙氨 酸突变为丝氨酸，184位丙氨酸突变为丝氨酸。

引物序列如下：

a-dr0167-F：5′taactagtgtgcccagtgccaacgtcag 3′

d-dr0167-R：5′tacatatgtcactgtgcagcgtcct 3′

b1-A181S-F:5′ggccccaccgggcgcgccctcAGCgaactcgccaagcgggcc 3′

c1-A181S-R:5′ggcccgcttggcgagttcGCTgagggcgcgcccggtggggcc 3′

b2-A184S-F:5′ggccccaccgggcgcgccctcgccgaactcAGCaagcgggcc 3′

c2-A184S-R:5′ggcccgcttGCTgagttcggcgagggcgcgcccggtggggcc 3′

2.获得的耐辐射异常球菌DR0167原始基因片段及重组突变片，并段连接载体 pRADZ3并进行大肠杆菌转化(方法参考实施例1，3)，获得重组工程菌株JM-DR0167、 JM-A181S和JM-A184S。

3.各菌株对紫外线辐照的抗性实验方法参照实施例2的实验方法进行。

三、实验结果

UV辐照胁迫处理显示，耐辐射异常球菌DR-0167同样能够提高原核微生物UV胁迫 抗性。同样，对其功能域基序180LAELAR185中第二位或第五位丙氨酸进行优化突变为丝 氨酸，进一步提高了重组蛋白提高细胞抗紫外辐射的能力(图8)。实验结果显示，功能域 基序180LAELAR185中第二位丙氨酸突变为丝氨酸是原DR-0167蛋白的保护作用提高仅 10倍；而功能域基序180LAELAR185中第五位丙氨酸突变为丝氨酸将原始DR-0167蛋白 的保护作用提高2个数量级，近100倍(见图8)。

四、实验结论

耐辐射异常球菌的DR-0167是Dgeo0395的同源蛋白。DR-0167中同样含有本发明发 现的重要功能域基序，为180LAELAR185。氨基酸排列顺序与Dgeo0395相同。实验结果 证实，对其功能域基序180LAELAR185中第二位或第五位丙氨酸进行优化突变为丝氨酸， 进一步提高了重组蛋白提高细胞抗紫外辐射的能力。实验结果表明，本发明提及的 Dgeo0395的重要功能域基序中第二位或第五位丙氨酸突变为丝氨酸，提高该蛋白保护原核 细胞UV胁迫抗性的发现，同样适用于对Dgeo0395同源蛋白的抗逆功能改造。

实施例6戈壁异常球菌中IrrE同源蛋白功能域基序的氨基酸序列改造及紫外抗性实验鉴 定

一、实验目的

利用NCBI数据库基因信息对Dgeo0395同源蛋白序列进行比对分析(见图1、7)。 Dgeo0395在戈壁异常球菌(Deinococcus gobiensis)中的同源蛋白是DGo_CA2805，该蛋 白在α7位置同样含有本发明发现的重要功能域基序127LAELSR132，氨基酸序列与 Dgeo0395不同，其第五位不是丙氨酸，而是丝氨酸(见图7)。对戈壁异常球菌中的同源 蛋白DGo_CA2805的重要功能域基序127LAELSR132的第五位丝氨酸进行反向突变改造 为丙氨酸，鉴定该功能域基序在重组突变蛋白紫外抗逆性功能中的作用。

二、实验方法

1.通过氨基酸定点突变的方式对戈壁异常球菌IrrE同源蛋白DGo_CA2805的氨基酸 序列进行空间结构相同位置功能域基序127LAELSR132进行分析。同样利用融合PCR的 方法将目标位点编码氨基酸的核苷酸序列进行突变，进而获得改位点突变的蛋白突变体。 选取的突变位点是为功能域基序中第五位丝氨酸。将131位丝氨酸反向突变为丙氨酸。

引物序列如下：

a-CA2805-F：5′taactagtatgcgcgagctggcggcgg 3′

d-CA2805-R：5′tacatatggtgagagggagacgcgct 3′

b1-S131A-F:5′cgcgccctggccgagttgGCCcgccgcgccgacgtgagt 3′

c1-S131A-R:5′actcacgtcggcgcggcgGGCcaactcggccagggcgcg 3′

2.获得的戈壁异常球菌DGo_CA2805原始基因片段及重组突变片，并段连接载体 pRADZ3并进行大肠杆菌转化(方法参考实施例1，3)，获得重组工程菌株JM-CA2805、 JM-S131A。

3.各菌株对紫外线辐照的抗性实验方法参照实施例2的实验方法进行。

三、实验结果

UV辐照胁迫处理显示，戈壁异常球菌DGo_CA2805同样能够提高原核微生物UV胁 迫抗性。同样，对其功能域基序127LAELSR132第五位丝氨酸突变为丙氨酸，显著降低了 重组蛋白提高细胞抗紫外辐射的能力(图9)。实验结果显示，功能域基序127LAELSR132 中第五位丝氨酸突变为丙氨酸将原始DGo_CA2805蛋白的保护作用降低2个数量级，约 100倍(见图9)。

四、实验结论

戈壁异常球菌的DGo_CA2805是Dgeo0395的同源蛋白。DGo_CA2805中同样含有本 发明发现的重要功能域基序，为127LAELSR132。氨基酸排列顺序与Dgeo0395不同，其 第五位氨基酸天然是丝氨酸。本实施例将这一位点氨基酸进行反向突变，并验证该功能域 基序在在重组突变蛋白紫外抗逆性功能中的作用。实验结果证实，对其功能域基序 127LAELSR132中第五位丝氨酸进行反向突变为丙氨酸，明显降低了重组蛋白提高细胞抗 紫外辐射的能力。实验结果从反方向证明，本发明提及的Dgeo0395的重要功能域基序中 第二位或第五位丙氨酸突变为丝氨酸，提高该蛋白保护原核细胞UV胁迫抗性的发现，同 样适用于对Dgeo0395同源蛋白的抗逆功能改造。