一种采用高效液相色谱法测定样品中卡西酮和4-甲基甲卡西酮含量的方法

摘要

本发明公开一种采用液相色谱法定量分析样品中卡西酮和4-甲基甲卡西酮含量的方法，包括如下步骤：(1)工作液的配制；(2)样品溶液的配制；(3)检测条件的设置；(4)样品中卡西酮和4-甲基甲卡西酮含量的测定。本发明采用反相色谱等度洗脱，在10分钟内即可完成卡西酮和4-甲基甲卡西酮分离；其具有高效、准确的检测效果，可用于样品中卡西酮和4-甲基甲卡西酮含量的同时测定，为司法部门定罪量刑提供技术支持。

说明书

技术领域

本发明涉及刑侦领域毒品检测领域，特别涉及采用高效液相色谱 法测定样品中卡西酮和4-甲基甲卡西酮含量的方法。

背景技术

4-甲基甲卡西酮(Mephedrone)是一种精神物质，属于合成卡 西酮类衍生物,其化学结构式如式(1)所示：

卡西酮(Cathinone)，又名benzoylethanamine(在以色列市 场上又叫hagigat)，是一种在阿拉伯茶(khat)中发现的一元胺生 物碱(monoaine alkaloid)，化学上与之相似的有：麻黄碱 (ephedrine)，阿拉伯茶碱(cathine)和其他安他非命，其化学 结构式如式(2)所示：

卡西酮能引起多巴胺释放，可能是使阿拉伯茶产生刺激性影响 的原因。人工合成的卡西酮也经常被作为消遣性毒品的重要组成部 分，在美国通常被叫做浴盐。

卡西酮和4-甲基甲卡西酮对人体有相当危害。这种危害不仅影响 人体的生理状况，还会影响人的心理活动，过量还会导致死亡。卡西 酮和4-甲基甲卡西酮的滥用不仅对人体有危害，而且对社会的发展也 会造成不利影响。

现有技术有采用气相色谱/质谱联用法、红外光谱分析法、高效 液相色谱法以及液质联用技术等测定样品中卡西酮和4-甲基甲卡西 酮含量。其中，在利用液相色谱法检测的过程中，由于两者物质结构 近似，为了将两物质有效分离，现有技术通常采用降低流速的方式， 而这就导致检测时间长，检测效率低下的技术问题，使得刑侦工作效 率降低。故急需一种高精度的，并能够在更短时间内实现样品中卡西 酮和4-甲基甲卡西酮同时检测的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明在于提供一种精密度高、检测时间短的高效液 相色谱法同时测定样品中卡西酮和4-甲基甲卡西酮含量的方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：一种采用高效液相色谱法测 定样品中卡西酮和4-甲基甲卡西酮含量的方法，其包括如下步骤：

(1)工作液的配制；

(2)样品溶液的配制；

(3)检测条件的设置；

(4)样品中卡西酮和4-甲基甲卡西酮含量的测定；

(5)实验结果计算，

其中，步骤(3)中，色谱柱采用反相苯基色谱柱，流动相为A-1～ 5mM乙酸铵缓冲液：B-乙腈，A:B＝(20～40):(60-80),流速为 1.0-1.5mL/min。

上述方法的步骤(3)中，步骤(3)中，A-pH＝5.0的4mM乙酸铵 缓冲液：B-乙腈，A:B＝20:80,流速为1.2mL/min。

上述方法采用内标法定量，选择2-苯乙胺作为内标物质。

上述方法的步骤(1)中，分别取卡西酮和4-甲基甲卡西酮标准 储备溶液，分别用质量浓度为0.1mg/mL的内标物质的溶液依次稀释成 卡西酮和4-甲基甲卡西酮质量浓度分别为0.5、0.1、0.05、0.01、 0.005、0.001、0.0005mg/mL的两个系列标准溶液，并保持内标溶液 的浓度均为0.01mg/mL。

上述方法的步骤(2)中：称取样品，加入流动相溶解，振荡， 离心，离心后取上清液，加入内标物质，并加入流动相，振荡均匀后 即得到样品溶液；流动相与步骤(3)中的流动相相同。

上述方法采用外标法定量，其中，步骤(1)中，分别取卡西酮、 4-甲基甲卡西酮标准储备溶液，分别依次稀释成质量浓度分别为0.5、 0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005mg/mL的两系列标准溶液。

上述方法的步骤(2)中：称取样品，加入流动相溶解，振荡， 离心，离心后取上清液，加入流动相，振荡均匀后即得到样品溶液； 流动相与步骤(3)中的流动相相同。

上述方法的步骤(3)中色谱柱规格为250mm×4.6mm,5μm，柱 温为35℃，检测波长254nm。

上述方法中，流动相使用前经0.45μm微孔过滤膜过滤后放入超 声波清洗器中超声10～15min，充分脱出流动相中的气体。

上述方法，在向样品中加入流动相之前，使用甲苯、苯甲醚、二 氯甲烷和乙醚的混合溶液萃取样品中的卡西酮或4-甲基甲卡西酮，甲 苯、苯甲醚、二氯甲烷和乙醚的体积比为6：3:2:1.5，向分离出的有 机相中加入HCl质量分数为20％的盐酸,除去有机相后将剩余物置于35 ℃快速浓缩仪上浓缩至干。

本发明的有益效果是：

1)现有技术中，由于卡西酮和4-甲基甲卡西酮结构相近，故在 色谱检测中难于分离，为了确保获得良好的分离度，往往只能采取降 低流速的方式，提高分离度、改善峰形，导致完成卡西酮和4-甲基甲 卡西酮全部物质的检测时间通常在30分钟以上；而发明人通过大量试 验发现，导致现有技术中检测时间长的主要因素在于流动相中酸性改 性剂选择的不当，有机相比例不能过高，通过筛选大量改性剂，发明 人发现当使用酸性乙酸铵缓冲液时，可以通过增加有机相比例，大大 缩短检测时间，同时还能确保待测物质卡西酮和4-甲基甲卡西酮的有 效分离、高理论塔板数等技术效果，通过试验证明，本发明可以将卡 西酮和4-甲基甲卡西酮的分离时间缩短至10分钟左右，将近现有技 术用时的三分之一，大大提高检测效率，为实际中刑侦工作的有效开 展提供了有力保障。

2)本发明采用了内标法定量，相比于现有技术中的外标法定量， 由于内标法避免了由于进样的一致性及样品歧视效应导致的偶然误 差，因而，它的分析精密度比较高，是一种比较理想的定量分析方法； 其中，内标物质种类的确定是建立内标分析方法中的难点之一，内标 物种类将直接影响检测结果的精确度、准确性，内标选择不当将直接 导致检测无法实现，发明人通过大量试验，确定2-苯乙胺作为内标物 质，其与卡西酮和4-甲基甲卡西酮均具有良好的分离度，实现了卡西 酮和4-甲基甲卡西酮的精确定量。

附图说明

图1是卡西酮和4-甲基甲卡西酮的液相色谱图(横坐标-min，纵 坐标-mAU)，1：卡西酮，2：4-甲基甲卡西酮，3：内标。

具体实施方式

实施例1

本发明采用高效液相色谱法测定样品中卡西酮和4-甲基甲卡西 酮含量的方法，包括如下步骤：

(1)工作液的配制；分别取卡西酮和4-甲基甲卡西酮标准储备 溶液，分别用质量浓度为0.1mg/mL的内标物质的溶液依次稀释成卡西 酮和4-甲基甲卡西酮质量浓度分别为0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、 0.001、0.0005mg/mL的两个系列标准溶液，并保持内标溶液的浓度均 为0.01mg/mL。

(2)样品溶液的配制：分别称取含卡西酮和4-甲基甲卡西酮的 样品检材约45mg(本实施例的样品检材是分别使用卡西酮标准品及4- 甲基甲卡西酮与其它物质混合后制备的，样品一中卡西酮含量为 49.86wt％，样品二中4-甲基甲卡西酮含量为50.42wt％)，分别用瓶口 移液器加入20mL流动相提取，振荡10分钟，离心5分钟，离心后分 别用1mL移液器吸取上清液1mL，分别加入约0.1mg内标物质2-苯乙 胺，并用瓶口移液器分别加入10mL流动相，振荡均匀后取1.5mL装自 动进样瓶，即得到样品溶液；

(3)检测条件的设置：采用AgilentSB-Phenyl色谱 柱，规格为250mm×4.6mm,5μm，色谱条件：A-pH＝5.0的4mM乙酸铵 缓冲液：B-乙腈＝20:80【本发明中，乙酸铵缓冲液是以乙酸根的浓度 计算，4mM即为4mmol/L,乙酸铵缓冲溶液与乙腈的比例为体积比】，流 速1.2mL/min，柱温35℃，检测波长254nm；

(4)样品中卡西酮和4-甲基甲卡西酮含量的测定，分别取样品 溶液5μL进样检测；

(5)实验结果计算，利用内标法定量计算，最终得到样品一中卡 西酮含量为48.75wt％，样品二中4-甲基甲卡西酮含量为49.27wt％。

其中，流动相使用前经0.45μm微孔过滤膜过滤后放入超声波清 洗器中超声10～15min，充分脱出流动相中的气体。

结果显示，卡西酮和4-甲基甲卡西酮能完全分开，且峰形较好， 液相色谱图如图1所示。

实施例2

本发明采用高效液相色谱法测定样品中卡西酮和4-甲基甲卡西 酮含量的方法，包括如下步骤：

(1)工作液的配制；分别取卡西酮、4-甲基甲卡西酮标准储备 溶液，分别依次稀释成质量浓度分别为0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、 0.001、0.0005mg/mL的两系列标准溶液。

(2)样品溶液的配制：分别称取含卡西酮和4-甲基甲卡西酮的 样品检材约45mg(本实施例的样品检材是分别使用卡西酮标准品及4- 甲基甲卡西酮与其它物质混合后制备的，样品一中卡西酮含量为 49.86wt％，样品二中4-甲基甲卡西酮含量为50.42wt％)，分别用瓶口 移液器加入20mL流动相提取，振荡10分钟，离心5分钟，离心后分 别用1mL移液器吸取上清液1mL，用瓶口移液器分别加入10mL流动相， 振荡均匀后取1.5mL装自动进样瓶，即得到样品溶液；

(3)检测条件的设置：采用AgilentSB-Phenyl色谱 柱，规格为250mm×4.6mm,5μm，色谱条件：A-pH＝5.0的4mM乙酸铵 缓冲液：B-乙腈＝20:80，流速1.2mL/min，柱温35℃，检测波长254nm；

(4)样品中卡西酮和4-甲基甲卡西酮含量的测定，分别取样品 溶液5μL进样检测；

(5)实验结果计算，利用外标法定量计算，最终得到样品一中卡 西酮含量为48.39wt％，样品二中4-甲基甲卡西酮含量为49.07wt％。

其中，流动相使用前经0.45μm微孔过滤膜过滤后放入超声波清 洗器中超声10～15min，充分脱出流动相中的气体。

结果显示，卡西酮和4-甲基甲卡西酮能完全分开，且峰形较好。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于：所用样品一为卡西酮含量为 49.86wt％的血液，即取空白血液，添加卡西酮标准品；所用样品二为 4-甲基甲卡西酮含量为50.42wt％的血液，即取空白血液，添加4-甲基 甲卡西酮标准品。分别向样品一和样品二中加入甲苯、苯甲醚、二氯 甲烷和乙醚的混合溶液25mL，萃取样品中的卡西酮和4-甲基甲卡西 酮，甲苯、苯甲醚、二氯甲烷和乙醚的体积比为6：3:2:1.5，向分离 出的有机相中加入HCl质量分数为20％的盐酸20mL,除去有机相后将剩 余物置于35℃快速浓缩仪上浓缩至干，分别用瓶口移液器加入20mL 流动相提取，振荡10分钟，离心5分钟，离心后分别用1mL移液器吸 取上清液1mL，分别加入约0.1mg内标物质2-苯乙胺，并用瓶口移液 器分别加入10mL流动相，振荡均匀后取1.5mL装自动进样瓶，即得到 样品溶液。本实施例最终得到样品一中卡西酮含量为48.25wt％，样品 二中4-甲基甲卡西酮的含量为48.85wt％。

实施例4

本实施例与实施例2的区别在于：所用样品一为卡西酮含量为 49.86wt％的血液，即取空白血液，添加卡西酮标准品；所用样品二为 4-甲基甲卡西酮含量为50.42wt％的血液，即取空白血液，添加4-甲基 甲卡西酮标准品。分别向样品一和样品二中加入甲苯、苯甲醚、二氯 甲烷和乙醚的混合溶液25mL，分别萃取样品中的卡西酮和4-甲基甲卡 西酮，甲苯、苯甲醚、二氯甲烷和乙醚的体积比为6：3:2:1.5，向分 离出的有机相中加入HCl质量分数为20％的盐酸20mL,除去有机相后将 剩余物置于35℃快速浓缩仪上浓缩至干，分别用瓶口移液器加入20mL 流动相提取，振荡10分钟，离心5分钟，离心后分别用1mL移液器吸 取上清液1mL，用瓶口移液器分别加入10mL流动相，振荡均匀后取 1.5mL装自动进样瓶，即得到样品溶液。本实施例最终得到样品一中 卡西酮含量为47.89wt％，样品二中4-甲基甲卡西酮的含量为 48.12wt％。

验证例1

(1)选择2-苯乙胺作为内标物质的过程。

配制浓度分别为0.1mg/mL的卡西酮和0.1mg/·mL的内标2-苯乙 胺溶液，卡西酮与内标有较好的分离度；

配制浓度分别为0.1mg/mL的4-甲基甲卡西酮和0.1mg/mL的内标 2-苯乙胺溶液，4-甲基甲卡西酮与内标有较好的分离度。

(2)内标工作曲线的建立

实验方法：取卡西酮标准储备溶液，用质量浓度为0.1mg/mL的 内标溶液依次稀释成质量浓度分别为0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、 0.001、0.0005mg/mL的系列标准溶液，并保持内标溶液的浓度均为 0.01mg/mL。分别取不同浓度的标准液5μL进样，记录响应的峰面积。 每个浓度进样3次，并对3次峰面积比值的平均值A及质量浓度比值 c(mg/mL)进行线性回归。

取4-甲基甲卡西酮标准储备溶液，用质量浓度为0.1mg/mL的内 标溶液依次稀释成质量浓度分别为0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、 0.001、0.0005mg/mL的系列标准溶液，并保持内标溶液的浓度均为 0.01mg/mL。分别取不同浓度的标准液5μL进样，记录响应的峰面积。 每个浓度进样3次，并对3次峰面积比值的平均值A及质量浓度比值 c(mg/mL)进行线性回归。

实验结果表明，卡西酮的线性范围为0.005-0.5mg/mL，线性方程 为A＝0.8253c-0.3681，R²＝0.9997；4-甲基甲卡西酮的线性范围为 0.005-0.5mg/mL，线性方程为A＝1.1121c-0.2635，R²＝0.9997。

验证例2

外标工作曲线的建立

实验方法：取卡西酮标准储备溶液，依次稀释成质量浓度分别为 0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005mg/mL的系列标准溶液。 分别取不同浓度的标准液5μL进样，记录响应的峰面积。每个浓度进 样3次，并对3次峰面积的平均值A及质量浓度c(mg/mL)进行线性回 归。

取4-甲基甲卡西酮标准储备溶液，依次稀释成质量浓度分别为 0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005mg/mL的系列标准溶液。 分别取不同浓度的标准液5μL进样，记录响应的峰面积。每个浓度进 样3次，并对3次峰面积的平均值A及质量浓度c(mg/mL)进行线性回 归。

实验结果表明，卡西酮的线性范围为0.005-0.5mg/mL，线性方程为 A＝6×10⁶c-13368，R²＝0.9999，检出限为0.2μg/mL(S/N≥3)；4-甲 基甲卡西酮的线性范围为0.005-0.5mg/mL，线性方程为A＝1× 10⁷c+24487，R²＝0.9999，检出限为0.2μg/mL(S/N≥3)。

验证例3

精密度考察

取低、中、高3个浓度的卡西酮、4-甲基甲卡西酮样品，用所建 立的外标方法进行分析。1天内提取分析10次，计算样本的日内相对 标准偏差(RSD)；连续5天，计算样本的日间相对标准偏差，结果见 表1、2。

表1.不同浓度卡西酮样品的精密度试验结果

表2.不同浓度4-甲基甲卡西酮样品的精密度试验结果

比较例

考察现有技术中酸性改性剂对实验结果的影响

(1)考察磷酸对实验结果的影响

流动相：A-0.5％磷酸水溶液；B-乙腈。

结论：用磷酸做流动相，随着有机相比例降低，拖尾严重，和麻 黄碱分得不好。

(2)考察三氟乙酸对实验结果的影响

流动相：A-三氟乙酸(pH＝3.5)的水溶液；B-乙腈。

结论：用三氟乙酸(pH＝3.5)的水溶液做流动相，低流速时得到 较好的峰形，但理论塔板数较低；高流速时变成双峰，且无法实现卡 西酮和4-甲基甲卡西酮的分离。

可见，现有的酸性改性剂无法满足高流速、高理论塔板数、峰形 好的检测要求。

上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明创造所作的举例，而并非 对本发明创造具体实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来 说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这 里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则 之内所引伸出的任何显而易见的变化或变动仍处于本发明创造权利要 求的保护范围之中。