原代肝细胞的分离制备方法

摘要

本发明公开了一种原代肝细胞的分离制备方法，它包括如下步骤：a、肝脏的体外灌流：取离体的动物肝脏，先用灌流液Ⅰ灌流，灌流速度为300-1000mL/min，灌流时间为10-12分钟；再用灌流液Ⅱ灌流，灌流速度为300-1000mL/min，灌流时间为2-3分钟；最后用灌流液Ⅲ灌流，灌流速度为400-1200mL/min，灌流时间为25-40分钟；b、分离肝细胞：洗涤步骤a处理后的肝脏，收集肝细胞悬液，过滤、离心，收集沉淀即可。本发明原代肝细胞的分离制备方法，可以分离得到的肝细胞数量、活率与纯度均较高的肝细胞，应用前景良好。

说明书

技术领域

本发明属于医学生物技术领域，涉及原代肝细胞的分离制备方法。

背景技术

肝脏作为机体重要的代谢器官，在多种生理病理过程中发挥重要作用。 肝细胞行使了肝脏主要的功能，如清除毒素、参与生物合成和生物转化、代 谢多种营养物质、储存葡萄糖、分泌具有促进肝细胞生长的活性物质等。机 体内分离得到的原代肝细胞被应用于药理毒理学、免疫学、细胞生物学等体 外研究，随着生物人工肝在治疗肝衰竭领域的应用，也需要大量、高活性的 原代肝细胞作为生物材料。因此，如何分离制备得到高产量、高纯度、高存 活率的原代肝细胞受到研究者的广泛关注。

自1976年Seglen首次采用两步原位灌流法成功分离大鼠肝细胞以来， 两步原位灌流法被证明对分离多种动物肝细胞均有效，成为目前原代肝细胞 分离制备的经典方法。众多研究者在该法的基础上，对肝细胞分离方法进行 了改良，在一定程度上提高了肝细胞的总量和活率，但还是不能满足实际应 用的需要。

例如：公开号为CN1632107A，发明名称为“生物人工肝用猪和人肝细胞 的制备方法”的专利，报道了两种分离肝细胞的方法，一种是四步灌流，一 种是两步灌流，采用四步灌流时，获得的肝细胞活率和肝细胞总数较高，分 别为90-99％和6.25×10⁷个/克肝组织，但纯度较低，仅为90-95％，且灌流步 骤太多，成本高；而两步灌流虽然步骤少，但是肝细胞活率、肝细胞总数和 纯度均不理想，分别仅为80-90％、1.25×10⁷个/克肝组织和80-90％。

Zhang ZG etal.,An updated method for the isolation and culture of primary  calf hepatocytes,Vet J,2012,191:323-326公开了三步灌流分离肝细胞的方法， 但是获得的肝细胞的总数、活率均较低，分别为1.12×10⁷个/克肝组织、85.7％。

因此，急需对原代肝细胞的制备方法进一步改进，以制备高产量、高纯 度、高存活率的原代肝细胞。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效分离原代肝细胞的分离制备方法。

本发明提供了一种原代肝细胞的分离制备方法，它包括如下步骤：

a、肝脏的体外灌流：取离体的动物肝脏，先用灌流液Ⅰ灌流，灌流速度 为300-1000mL/min，灌流时间为10-12分钟；再用灌流液Ⅱ灌流，灌流速 度为300-1000mL/min，灌流时间为2-3分钟；最后用灌流液Ⅲ灌流，灌流 速度为300-1200mL/min，灌流时间为25-40分钟；

其中，所述灌流液I每升含有如下成分：8.1-8.5克氯化钠，0.5克氯化钾， 2.2-2.6克HEPES，3.5-4.5克NAC,0.9-1.1克EGTA,其余为去离子水；

所述灌流液II每升含有如下成分：8.1-8.5克氯化钠，0.5克氯化钾，2.2-2.6 克HEPES，其余为去离子水；

所述灌流液III每升含有如下成分：3.8-4克氯化钠，0.5克氯化钾，23-25 克HEPES，0.07克二水氯化钙，3.5-4.5克白蛋白，162-260Wünsch单位胶原 酶，其余为去离子水；

b、分离肝细胞：洗涤步骤a处理后的肝脏，收集肝细胞悬液，过滤、离 心，收集沉淀即可。

HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸。

NAC：N-acetylcysteine,N-乙酰基-L-半胱氨酸。

EGTA：乙二醇二乙醚二胺四乙酸。

Wünsch单位：是胶原酶专用的活性单位。

进一步地，步骤a中，所述灌流液I每升含有如下成分：8.3克氯化钠， 0.5克氯化钾，2.4克HEPES，3.5-4.5克NAC,0.9-1.1克EGTA,其余为去离 子水；

灌流液II每升含有如下成分：8.3克氯化钠，0.5克氯化钾，2.4克HEPES， 其余为去离子水；

灌流液III每升含有如下成分：3.9克氯化钠，0.5克氯化钾，24克HEPES， 0.07克二水氯化钙，4克白蛋白，162-260Wünsch单位胶原酶，其余为去离 子水。

更进一步地，所述灌流液I每升含有如下成分：8.3克氯化钠，0.5克氯 化钾，2.4克HEPES，4克NAC,0.95克EGTA,其余为去离子水；

灌流液II每升含有如下成分：8.3克氯化钠，0.5克氯化钾，2.4克HEPES， 其余为去离子水；

灌流液III每升含有如下成分：3.9克氯化钠，0.5克氯化钾，24克HEPES， 0.07克二水氯化钙，4克白蛋白，216Wünsch单位胶原酶，其余为去离子水。

其中，所述灌流液III中，胶原酶为胶原酶SERVA NB8或者胶原酶Roche  Liberase^TM。

其中，所述灌流液I的灌流速度为400mL/min，灌流时间为10分钟；

灌流液II的灌流速度为400mL/min，灌流时间为2分钟；

灌流液III的灌流速度为500mL/min，灌流时间为30分钟。

其中，步骤a中，灌流液I、灌流液II、灌流液III的灌流温度均为 37゜C。

其中，步骤a中，灌流液III的灌流为循环灌流方式。

其中，步骤a中，灌流液I、灌流液II和/或灌流液III的溶解氧分压 为180-260mmHg。

其中，步骤b中，所述过滤是用四层脱脂纱布过滤。

其中，步骤b中，所述离心是多次离心，具体步骤是：

(1)离心，弃去上清液。

(2)重悬沉淀，离心；

(3)将过程(2)重复一次。

其中，离心的条件为：离心温度为4℃，离心力为50-55×g，离心的时 间为10分钟。

其中，步骤(2)中，重悬沉淀采用肝细胞洗涤液。

其中，步骤(2)中，洗涤采用肝细胞洗涤液洗涤。

其中，所述肝细胞洗涤液每升中含有如下成分：9.3-10.8克Williams' Medium E粉末，2.2克碳酸氢钠，2.4-2.8克HEPES，0.1克链霉素，100000 单位青霉素，其余为去离子水。

进一步地，所述肝细胞洗涤液每升中含有如下成分：9.3-10.8克Williams' Medium E粉末，2.2克碳酸氢钠，2.6克HEPES，0.1克链霉素，100000单 位青霉素，其余为去离子水。

更进一步地，所述肝细胞洗涤液每升中含有如下成分：9.5克Williams' Medium E粉末，2.2克碳酸氢钠，2.6克HEPES，0.1克链霉素，100000单 位青霉素，其余为去离子水。

本发明方法不仅可以用于猪肝脏，而且可以适用于各种与大型动物的肝 脏，如人、猪、狗、牛的肝脏，具有应用的广泛性。

本发明提供的原代肝细胞的分离制备方法，可以有效分离原代肝细胞， 分离得到的肝细胞的数量多、活率与纯度高，为肝细胞移植、生物人工肝支 持系统治疗急慢性肝病以及肝细胞体外应用模型提供潜在的肝细胞资源，临 床应用前景优良。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段， 在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、 替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步 的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。 凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式

下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。

本发明所用的实验仪器与试剂如下：

外科手术器械一套，自制灌注设备一套，低温离心机(Thermo Scientific, 美国)，纯水机(Millipore,德国)；电子分析天平(Sartorius，德国)；蠕 动泵(MasterRex L/S，美国)；奥林巴斯生物显微镜(BHS型，日本)；二氧 化碳细胞培养箱(SANYO MCO-17AI，日本)；超净工作台(NUAIRE-600E，美 国)；颗粒计数仪(Multisizer 3Beckman Coulter counter，德国)。

氯胺酮，甲苯噻嗪，肝素钠注射液购自成都科伦制药；EGTA；Williams' Medium E培养基粉末(简称Williams'Medium E粉末)，Pen-Strep100× (Penicillin 10,000U/ml，Streptomycin 10,000ug/ml)，NAC，台盼蓝细胞 活性染色试剂，白蛋白购自美国Sigma-Aldrich公司；胶原酶NB8购自德国 SERVA公司。

实施例1本发明的原代肝细胞的分离制备方法

一、试验试剂

灌流液I、灌流液II、灌流液III、肝细胞洗涤液；

各自的制备方法如下：

1.灌流液Ⅰ：以配制1升试剂为例：

(1)取如下成分：氯化钠8.3克、氯化钾0.5克、HEPES 2.4克、NAC  4克、EGTA 0.95克；

(2)将上述成分混合，溶于去离子水，室温下搅拌10分钟，使其充分 溶解，定容至1L，调节pH至7.4，用0.2微米滤膜过滤除菌，常温保存即 可。使用时，预热至37℃。

2.灌流液Ⅱ：以配制1升试剂为例：

(1)取如下成分：氯化钠8.3克、氯化钾0.5克、HEPES 2.4克；

(2)将上述成分混合，溶于去离子水，室温下搅拌10分钟，使其充分 溶解，定容至1L，调节pH至7.4，用0.2微米滤膜过滤除菌，常温保存即 可。使用时，预热至37℃。

3.灌流液Ⅲ：以配制1升试剂为例：

(1)取如下成分：氯化钠3.9克、氯化钾0.5克、HEPES 24克、二水 氯化钙(CaCl₂·2H₂O)0.07克、白蛋白4克、胶原酶SERVA NB8(1mg酶 里面是1.08个Wünsch单位)200毫克(即216Wünsch单位)；

(2)将上述成分混合，溶于去离子水，室温下搅拌10分钟，使其充分 溶解，定容至1L，调节pH至7.6，用0.2微米滤膜过滤除菌，使用前15分 钟配置，使用时，预热至37℃。

4.肝细胞洗涤液：以配制1升试剂为例：

(1)取如下成分：Williams'Medium E粉末9.5克、碳酸氢钠2.2克、 HEPES 2.6克、链霉素0.1克、青霉素100000单位；

(2)将上述成分混合，溶于去离子水，室温下搅拌10分钟，使其充分 溶解，定容至1L，调节pH至7.3，用0.2微米滤膜过滤除菌，4℃保存和使 用。

二、试验方法

获取正常巴马猪完整肝脏，以全肝脏重300克为例分离制备原代猪肝细 胞。

a、肝脏的体外灌流

将摘取的完整肝脏，置于无菌容器中，采用内径6mm软管经门静脉插管， 将过滤灭菌、预热至37℃4000mL灌流液Ⅰ，经蠕动泵以400mL/min速度 灌流10分钟，弃去灌流液；接着用过滤灭菌、预热至37℃800mL灌流液Ⅱ， 以400mL/min速度灌流2分钟，弃去灌流液；之后将过滤灭菌、预热至37℃ 的2000mL灌流液Ⅲ，以500mL/min速度循环灌流30分钟。以上灌流过程 中，所有灌流液都经过加氧过程，保证灌流液中溶解氧分压为200mmHg。

b、分离肝细胞

弃去灌流液，将肝脏转移至新的无菌盆中，倒入600mL预冷至4℃的肝 细胞洗涤液，划开肝包膜，去掉未消化的肝组织和结缔组织，收集肝细胞悬 液。上述肝细胞悬液经四层脱脂纱布过滤后，平均分装于两个容积为750mL 的无菌离心瓶中，4℃条件下，离心力50×g离心10分钟。弃去离心上清液， 再重复向每个离心瓶中加入4℃的肝细胞洗涤液500mL重悬沉淀的肝细胞， 4℃条件下，离心力50×g离心10分钟。弃去离心上清液，再重复向每个离 心瓶中加入4℃的肝细胞洗涤液500mL重悬沉淀的肝细胞，4℃条件下，离 心力50×g离心10分钟。弃去上清液，收集沉淀，即为分离得到的肝细胞。

三、检测方法

沉淀肝细胞称重后，用500mL预冷至4℃的无血清肝细胞培养液重悬， 计算第一次稀释倍数，然后取出10mL肝细胞悬液，进一步用无血清肝细胞 培养液稀释至400倍，对稀释至400倍的肝细胞在进行台盼蓝染色，用血细 胞计数板，显微镜下计数，细胞核蓝染为死细胞，计算细胞活率，根据显微 镜下细胞形态计算细胞纯度。同时通过颗粒计数仪(Multisizer 3Beckman  Coulter counter)测定细胞总数和细胞浓度。剩余肝细胞悬液置于冰浴中备 用，并最后根据所需细胞的用途调节细胞浓度进行进一步培养。

四、试验结果

本发明制备的肝细胞结果如下表所示：

新鲜分离原代猪肝细胞指标 本发明方法 肝细胞活率(％) 99-99.5 所获肝细胞总数(个/克肝组织) 6.93-8.39×10⁷肝细胞纯度(％) 95-98

实验结果说明，本发明方法分离得到的原代猪肝细胞在活率、数量及纯 度方面均很优异。

实施例2本发明的原代肝细胞的分离制备方法

一、试验试剂

1.灌流液Ⅰ：以配制1升试剂为例：

(1)取如下成分：氯化钠8.1克、氯化钾0.5克、HEPES 2.6克、NAC  4.5克、EGTA 1.1克；

(2)将上述成分混合，溶于去离子水，室温下搅拌10分钟，使其充分 溶解，定容至1L，调节pH至7.4，用0.2微米滤膜过滤除菌，常温保存即 可。使用时，预热至37℃。

2.灌流液Ⅱ：以配制1升试剂为例：

(1)取如下成分：氯化钠8.1克、氯化钾0.5克、HEPES 2.6克；

(2)将上述成分混合，溶于去离子水，室温下搅拌10分钟，使其充分 溶解，定容至1L，调节pH至7.4，用0.2微米滤膜过滤除菌，常温保存即 可。使用时，预热至37℃。

3.灌流液Ⅲ：以配制1升试剂为例：

(1)取如下成分：氯化钠3.8克、氯化钾0.5克、HEPES 25克、二水 氯化钙(CaCl₂·2H₂O)0.07克、白蛋白4.5克、胶原酶Roche Liberase^TM(1mg 酶里面是5.2个Wünsch单位)50毫克(即260Wünsch单位)；

(2)将上述成分混合，溶于去离子水，室温下搅拌10分钟，使其充分 溶解，定容至1L，调节pH至7.6，用0.2微米滤膜过滤除菌，使用前15分 钟配置，使用时，预热至37℃。

4.肝细胞洗涤液：以配制1升试剂为例：

(1)取如下成分：Williams'Medium E粉末10.8克、碳酸氢钠2.2克、 HEPES 2.8克、链霉素0.1克、青霉素100000单位；

(2)将上述成分混合，溶于去离子水，室温下搅拌10分钟，使其充分 溶解，定容至1L，调节pH至7.3，用0.2微米滤膜过滤除菌4℃保存和使用。

二、试验方法

获取正常巴马猪完整肝脏，以全肝脏重800克为例分离制备原代猪肝细 胞。

a、肝脏的体外灌流

将摘取的完整肝脏，置于无菌容器中，采用内径10mm软管经门静脉插 管，将过滤灭菌、预热至37℃的灌流液Ⅰ12000mL，经蠕动泵以1000mL/min 速度灌流12分钟，弃去灌流液；接着用过滤灭菌、预热至37℃的灌流液 Ⅱ3000mL，以1000mL/min速度灌流3分钟，弃去灌流液；之后将过滤灭菌、 预热至37℃的灌流液Ⅲ4000mL，以1200mL/min速度循环灌流40分钟。以 上灌流过程中，所有灌流液都经过加氧过程，保证灌流液中溶解氧分压为 200mmHg。

b、分离肝细胞

上述肝细胞悬液经四层脱脂纱布过滤后，平均分装于四个容积为750mL 的无菌离心瓶中，4℃条件下，离心力50×g离心10分钟。弃去离心上清液， 再向每个离心瓶中加入4℃的肝细胞洗涤液500mL重悬沉淀，4℃条件下， 离心力50×g离心10分钟。弃去离心上清液，再向每个离心瓶中加入4℃的 肝细胞洗涤液500mL重悬沉淀，4℃条件下，离心力50×g离心10分钟。弃 去上清液，收集沉淀，即为原代肝细胞。

三、检测方法

同实施例1.

四、试验结果

本发明制备的肝细胞结果如下表所示：

新鲜分离原代猪肝细胞指标 本发明方法 肝细胞活率(％) 96-99 所获肝细胞总数(个/克肝组织) 6.55-7.28×10⁷肝细胞纯度(％) 95-98

实验结果说明，本发明方法分离得到的原代猪肝细胞在活率、数量及纯 度方面均很优异。

实施例3本发明的原代肝细胞的分离制备方法

一、试验试剂

1.灌流液Ⅰ：以配制1升试剂为例：

(1)取如下成分：氯化钠8.5克、氯化钾0.5克、HEPES 2.2克、NAC  3.5克、EGTA 0.9克；

(2)将上述成分混合，溶于去离子水，室温下搅拌10分钟，使其充分 溶解，定容至1L，调节pH至7.4，用0.2微米滤膜过滤除菌，常温保存即 可。使用时，预热至37℃。

2.灌流液Ⅱ：以配制1升试剂为例：

(1)取如下成分：氯化钠8.5克、氯化钾0.5克、HEPES 2.2克；

(2)将上述成分混合，溶于去离子水，室温下搅拌10分钟，使其充分 溶解，定容至1L，调节pH至7.4，用0.2微米滤膜过滤除菌，常温保存即 可。使用时，预热至37℃。

3.灌流液Ⅲ：以配制1升试剂为例：

(1)取如下成分：氯化钠4克、氯化钾0.5克、HEPES 23克、二水氯 化钙(CaCl₂·2H₂O)0.07克、白蛋白3.5克、胶原酶SERVA NB8(1mg酶 里面是1.08个Wünsch单位)150毫克(即162Wünsch单位)；

(2)将上述成分混合，溶于去离子水，室温下搅拌10分钟，使其充分 溶解，定容至1L，调节pH至7.6，用0.2微米滤膜过滤除菌，使用前15分 钟配置，使用时，预热至37℃。

4.肝细胞洗涤液：以配制1升试剂为例：

(1)取如下成分：Williams'Medium E粉末9.3克、碳酸氢钠2.2克、 HEPES 2.4克、链霉素0.1克、青霉素100000单位；

(2)将上述成分混合，溶于去离子水，室温下搅拌10分钟，使其充分 溶解，定容至1L，调节pH至7.3，用0.2微米滤膜过滤除菌，4℃保存和使 用。

二、试验方法

获取正常巴马猪完整肝脏，以全肝脏重200克为例分离制备原代猪肝细 胞。

a、肝脏的体外灌流

将摘取的完整肝脏，置于无菌容器中，采用内径4mm软管经门静脉插 管，将过滤灭菌、预热至37℃的灌流液Ⅰ3300mL，经蠕动泵以300mL/min 速度灌流11分钟，弃去灌流液；接着用过滤灭菌、预热至37℃的灌流液 Ⅱ750mL，以300mL/min速度灌流2.5分钟，弃去灌流液；之后将过滤灭菌、 预热至37℃的灌流液Ⅲ1500mL，以300mL/min速度循环灌流25分钟。以 上灌流过程中，所有灌流液都经过加氧过程，保证灌流液中溶解氧分压为 200mmHg。

b、分离肝细胞

上述肝细胞悬液经四层脱脂纱布过滤后，平均分装于两个容积为750mL 的无菌离心瓶中，4℃条件下，离心力50×g离心10分钟。弃去离心上清液， 再向每个离心瓶中加入4℃的肝细胞洗涤液500mL重悬沉淀，4℃条件下， 离心力50×g离心10分钟。弃去离心上清液，再向每个离心瓶中加入4℃的 肝细胞洗涤液500mL重悬沉淀，4℃条件下，离心力50×g离心10分钟。弃 去上清液，收集沉淀，即为原代肝细胞。

三、检测方法

同实施例1。

四、试验结果

本发明制备的肝细胞结果如下表所示：

新鲜分离原代猪肝细胞指标 本发明方法 肝细胞活率(％) 99-99.5 所获肝细胞总数(个/克肝组织) 7.33-8.55×10⁷肝细胞纯度(％) 95-98

实验结果说明，本发明方法分离得到的原代猪肝细胞在活率、数量及纯 度方面均很优异。

以下通过试验例具体说明本发明的有益效果。

试验例1本发明的原代肝细胞的分离制备方法与其它方法比较

一、现有的方法制备肝细胞

现有1：CN1632107A公开的四步灌流法制备肝细胞，该方法所获肝细 胞总数6.25×10⁷个/克肝组织、细胞活率为90-99％、细胞纯度为90-95％。

现有2：CN1632107A公开的二步灌流法制备肝细胞，该方法所获肝细 胞总数1.25×10⁷个/克肝组织、细胞活率为80-90％、细胞纯度为80-90％。

现有3：Zhang ZG etal.,An updated method for the isolation and culture of  primary calf hepatocytes,Vet J,2012,191:323-326公开的方法制备肝细胞，该方 法所获肝细胞总数1.12×10⁷个/克肝组织、细胞活率为85.7％。

二、本发明方法制备肝细胞

本发明方法制备肝细胞：根据实施例1制备肝细胞，该方法所获肝细胞 总数6.93-8.39×10⁷个/克肝组织、细胞活率为99-99.5％、细胞纯度为95-98％。

三、对比方法制备肝细胞

分离方法除了不含有本发明实施例1所示的灌流液Ⅱ灌流的步骤，其余 同本发明实验例1，结果所获肝细胞总数2.62-4.19×10⁷个/克肝组织、细胞活 率为90-95％、细胞纯度为86-92％。

将五种联合用试剂的效果归纳如下表：

从上表可以看出：

1、与现有三步灌流法以及二步灌流法相比，本发明三步灌流法用于分离 原代肝细胞时，获得的肝细胞总数、细胞活率以及细胞纯度均有显著提高。

2、与现有四步灌流法相比，本发明三步灌流法用于分离原代肝细胞时， 在获得的肝细胞总数、细胞活率上略优，在肝细胞纯度上显著提高。

3、与对比方法，即缺少灌流液Ⅱ灌流的二步灌流法相比，本发明三步灌 流法用于分离原代肝细胞时，获得的肝细胞总数、细胞活率以及细胞纯度均 有显著更优。

比较结果说明，本发明方法通过特定的灌流液及灌流步骤的组合，可以 有效地分离原代肝细胞，分离效果均优于现有的灌流方法，且用的灌流液仅 三种，成本不高。

综上，本发明方法可以有效分离原代肝细胞，分离得到的肝细胞的数量 多、活率与纯度高，为肝细胞移植、生物人工肝支持系统治疗急慢性肝病以 及肝细胞体外应用模型提供潜在的肝细胞资源，临床应用前景优良。