葡萄干发酵液制备方法及该制备工艺参数的优化方法

摘要

本发明公开了一种葡萄干发酵液制备方法及该制备工艺参数的优化方法，该制备方法以阳光少女和秀爱品种葡萄干为主要原料，选择适当的品种配比，然后按照料液比为0.8-1.2:4与水混合，同时添加葡萄干发酵液总质量5-6％的取葡萄糖进行密封发酵，其中发酵温度为16-22℃，密封发酵6-8天后得到葡萄干发酵液，将该葡萄干发酵液作为风味增添剂和酵母补充剂应用在水果风味面包中，制备所得的面包口感独特、风味香醇稳定，应用于工业化生产时发酵过程易控且口味稳定，此外采用单因素多梯度分析方法和面响应分析结合顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用技术，对葡萄干发酵液的培养工艺参数进行了最优化涉及，为可规模化生产提供了技术支持。

说明书

技术领域

本发明涉及一种葡萄干发酵液制备方法及该制备方法中 所涉及工艺参数的优化方法，属于葡萄干发酵液制备工艺领 域。

背景技术

目前工业化上普遍利用即发性干酵母生产面包，干酵母类 的面包产品酵母味重，麦香味不足，且风味比较单调、柔软度 低、易老化、保鲜期短。复配型面包添加剂虽可一定程度上弥 补上述不足，但对人体健康无益。另外纯天然酵种虽可延长面 包产品保质期、提高产品风味、保持产品新鲜度、增加产品营 养价值、减少添加剂的使用，但由于天然酵种的培养时间较长、 培养过程复杂，菌种受植物种类及产地等多重因素影响，发酵 过程不易控制，终产品风味不稳定，从而使天然酵种难以用于 大规模生产。

针对上述缺陷，近年来出现一些以各种水果制备发酵液替 代烘焙常用的酶制剂、改良剂等，来改善面包的风味、延缓面 包的老化、提高面包的储藏性能。国内对这方面的研究报道主 要针对天然发酵母制备,天然酵母种对面包的影响进行研究， 很少涉及提升面包香味的水果发酵液培养工艺研究。传统天然 发酵母则仅单因素分析，多梯度试验确定天然发酵母培养工艺 参数，以及对天然发酵母的评测是通过面包感官评价进行的， 感官评价方法容易受到感官评价的环境，感官评价员的工作状 态，食品样品的制备与呈送，感官评价员的选择，代表性，感 官能力和感官评价时间的影响，很容易导致测评的准确性和稳 定性受到影响，所以仅从单因素分析，多梯度试验以及感官评 价角度分析葡萄发酵液培养方法，是不够全面，甚至有失偏颇。

发明内容

为了克服上述现有技术中出现的问题，本发明提供了一种 葡萄干发酵液制备方法及其该制备工艺参数的优化方法，该方 法通过SPME-GC/MS对发酵液风味物质进行分析，以此为依 据用响应面法(Box-Behnken法)对水果发酵液的培养工艺参数 设置进行了研究，形成了一套行之有效的水果发酵液培养工艺 分析方法，从而为可规模化生产的，风味自然的天然水果发酵 液生产工艺的改进提供技术支持。

本发明所采用的具体技术方案是：

一种葡萄干发酵液的制备方法，主要包括下述步骤：

(1)将阳光少女品种葡萄干和秀爱品种葡萄干经拣选去 杂后，按阳光少女品种葡萄干:秀爱品种葡萄干为1:1-2的质量 比进行混合得到混合葡萄干；

(2)按混合葡萄干与水的料液质量比为0.8-1.2:4分别称取 混合葡萄干和水备用；按占所述葡萄干发酵液总质量5-6％的 量称取葡萄糖备用；

(3)将发酵罐用清水洗净，待晾干后采用72-77％的食用酒 精消毒并再次晾干后，将(2)中称取的水注入发酵罐中，并将 所述葡萄糖边搅拌边加入水中，待葡萄糖充分溶解后，加入所 述混合葡萄干并搅拌均匀，然后将该发酵罐密封；

(4)保持(3)中所述发酵罐内发酵温度为16-22℃，密封发 酵6-8天后得到葡萄干发酵液。

其进一步的技术方案是：

所述阳光少女品种葡萄干与秀爱品种葡萄干的质量比为 1:1，所述混合葡萄干与水的料液质量比为1:4，所述葡萄糖的 用量为占所述葡萄干发酵液总质量的6％。

步骤(4)中所述发酵罐内发酵温度为20℃，所述密封发酵 时间为7天。

本发明还公开了一种葡萄干发酵液制备方法的工艺优化 分析方法，主要包括下述步骤：

(1)采用单因素多梯度的方法设计葡萄干发酵液制备实 验，其中选择的单因素为阳光少女品种葡萄干和秀爱品种葡萄 干质量比、混合葡萄干与水的料液质量比、葡萄糖占葡萄干发 酵液总质量的百分比、发酵时间和发酵温度；

(2)根据步骤(1)中所设计实验制备葡萄干发酵液；

(3)采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用技术测定步 骤(2)中所制得的各葡萄干发酵液中风味物质的峰值，将检测 所得峰值同时与NIST Library及Wiley Library相匹配检索定 性，当匹配度和纯度大于900时作为定性鉴定结果；然后将定 性鉴定结果中的峰面积按归一化法计算得风味物质的相对百 分含量，通过比较各葡萄干发酵液中风味物质的相对含量，初 步确定葡萄干发酵液的制备工艺参数，其中葡萄干发酵液中风 味物质为C₆醛类化合物和C₆醇类化合物；

(4)在步骤(3)中所得初步确定的葡萄干发酵液制备工艺 参数基础上，利用响应面法设计葡萄干发酵液制备实验，其中 选择的因素为混合葡萄干与水的料液质量比、葡萄糖占葡萄干 发酵液总质量的百分比、发酵时间和发酵温度；

(5)根据步骤(4)中所设计实验制备葡萄干发酵液；

(6)采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用技术测定步 骤(5)中所制得的各葡萄干发酵液中风味物质的相对含量，以 该风味物质含量为响应值做响应面分析，分析混合葡萄干与水 的料液质量比、葡萄糖占葡萄干发酵液总质量的百分比、发酵 时间、发酵温度和风味物质含量的交互关系，并最终确定葡萄 干发酵液培养的最佳工艺参数。

其进一步的技术方案是：

步骤(1)中所述各单因素的选择范围为，阳光少女品种葡 萄干和秀爱品种葡萄干质量配比为1:1，1:2，1:4，1:6，1:8， 混合葡萄干与水的料液质量比1:2、1:3、1:4，葡萄糖占葡萄 干发酵液总质量的百分比为2％、4％、6％、8％、10％，发酵 时间为1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d、10d，发酵温 度为16℃、18℃、20℃、22℃。

步骤(2)中所述C₆醛类化合物包括己醛和反-2-己烯醛，所 述C₆醇类化合物包括己醇、顺-3-己烯醇和反-2-己烯醇。

步骤(4)中所述各因素的选择范围为，混合葡萄干与水的 料液质量比为1:2、1:3、1:4，葡萄糖占葡萄干发酵液总质量 的百分比为5％、6％、7％，发酵时间为6d、7d、8d，发酵温 度为16℃、18℃、20℃。

结合步骤(3)和步骤(6)所确定的葡萄干发酵液培养的最佳 工艺参数是，阳光少女品种葡萄干与秀爱品种葡萄干的质量比 为1:1，所述混合葡萄干与水的料液质量比为1:4，所述葡萄糖 的用量为占所述葡萄干发酵液总质量的6％。

此外本发明还公开一种根据前述制备方法制备所得的葡 萄干发酵液。

此外本发明还公开了一种根据前述制备方法制备所得的 葡萄干发酵液作为风味增添剂和酵母补充剂在水果风味面包 中的应用，所述葡萄干发酵液与水的质量比为1:2。

本发明的有益技术效果是：本发明所述葡萄干发酵液制备 方法及其该制备工艺参数的优化方法，通过SPME-GC/MS对 发酵液风味物质进行分析，以此为依据用响应面法 (Box-Behnken法)对水果发酵液的培养工艺参数设置进行了研 究，形成了一套行之有效的水果发酵液培养工艺分析方法，从 而为可规模化生产的，风味自然的天然水果发酵液生产工艺的 改进提供技术支持。

附图说明

图1为葡萄糖添加量对C₆化合物总量的影响；

图2为葡萄糖添加量对各C₆醇化合物及C₆醛化合物的影 响；

图3为葡萄糖发酵液与水添加比例对面包中所述C₆醛化 合物和C₆醇化合物含量的影响；

图4为葡萄糖发酵液与水添加比例对面包中C₆化合物总 量的影响；

图5为葡萄糖发酵液发酵时间对发酵液总酸(以酒石酸 计)、pH的影响；

图6为葡萄糖发酵液发酵时间对C₆化合物总含量的影响；

图7为葡萄糖发酵液发酵时间对各C₆醛类及C₆醇类化合 物含量的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例及图1至图7对本发明做详细说明， 但本发明并不限于这些实施例，下述实施例主要说明本发明所 述葡萄干发酵液制备方法及对该制备方法中所涉及工艺参数 进行最优化分析，具体包括下述步骤：

一、利用SPME-GC/MS联用技术并结合单因素多梯度试 验初步优化葡萄干发酵液的制备工艺参数：

(1)采用单因素多梯度的方法设计葡萄干发酵液制备实 验，其中选择的单因素为阳光少女品种葡萄干和秀爱品种葡萄 干质量比、混合葡萄干与水的料液质量比、葡萄糖占葡萄干发 酵液总质量的百分比、发酵时间和发酵温度；上述各单因素的 选择范围为，阳光少女品种葡萄干和秀爱品种葡萄干质量配比 为1:1，1:2，1:4，1:6，1:8，混合葡萄干与水的料液质量比1:2、 1:3、1:4，葡萄糖占葡萄干发酵液总质量的百分比为2％、4％、 6％、8％、10％，发酵时间为1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、 8d、9d、10d，发酵温度为16℃、18℃、20℃、22℃。

(2)根据步骤(1)中所设计实验制备葡萄干发酵液；制备步 骤如下：将阳光少女品种葡萄干和秀爱品种葡萄干经拣选去杂 后，按阳光少女品种葡萄干与秀爱品种葡萄干按(1)中所述各 质量比进行混合得到混合葡萄干；按(1)中所述各混合葡萄干 与水的料液质量比分别称取混合葡萄干和水备用；按(1)中所 述各葡萄糖用量称取葡萄糖备用；将发酵罐用清水洗净，待晾 干后采用72-77％的食用酒精消毒并再次晾干后，将水注入发 酵罐中，并将所述葡萄糖边搅拌边加入水中，待葡萄糖充分溶 解后，加入混合葡萄干并搅拌均匀，然后将该发酵罐密封；按 (1)中所述保持发酵罐内发酵温度并密封发酵相应时候后得到 葡萄干发酵液。

(3)采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱(SPME-GC/MS) 联用技术测定步骤(2)中所制得的各葡萄干发酵液中风味物质 的峰值，将检测所得峰值同时与NIST Library及Wiley Library 相匹配检索定性，当匹配度和纯度大于900时作为定性鉴定结 果；然后将定性鉴定结果中的峰面积按归一化法计算得风味物 质的相对百分含量，通过比较各葡萄干发酵液中风味物质的相 对含量，初步优化葡萄干发酵液的制备工艺参数，其中葡萄干 发酵液中风味物质为C₆醛类化合物和C₆醇类化合物；该C₆醛类化合物包括己醛和反-2-己烯醛，C₆醇类化合物包括己醇、 顺-3-己烯醇和反-2-己烯醇。

由于葡萄干发酵液是在合适的温度内利用微生物发酵的 产品，故选择对葡萄干发酵液培养影响较大的因素做单因素多 梯度的发酵试验。另外葡萄香气成分复杂，而挥发性风味成分 C₆醛化合物和C₆醇化合物在葡萄香气成分中约占总峰面积的 80％以上，对其香气构成具有重要影响。因此从发酵用葡萄干 的确定，到水果发酵液制备，再到水果发酵液面包的评定，都 以C₆醛化合物和C₆醇化合物作为本研究风味分析指标。

(4)在步骤(3)中所得初步确定的葡萄干发酵液制备工艺 参数基础上，利用响应面法设计葡萄干发酵液制备实验，其中 选择的因素为混合葡萄干与水的料液质量比、葡萄糖占葡萄干 发酵液总质量的百分比、发酵时间和发酵温度；

(5)根据步骤(4)中所设计实验制备葡萄干发酵液；

(6)采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用技术测定步 骤(5)中所制得的各葡萄干发酵液中风味物质的相对含量，以 该风味物质含量为响应值做响应面分析，分析混合葡萄干与水 的料液质量比、葡萄糖占葡萄干发酵液总质量的百分比、发酵 时间、发酵温度和风味物质含量的交互关系，并最终确定葡萄 干发酵液培养的最佳工艺参数。

实例一：

一、以葡萄干发酵液培养工艺中葡萄糖添加量对葡萄干发 酵液风味的影响为例对SPME-GC/MS联用技术分析方法进 行说明。

1.HS-SPME萃取条件：吸取葡萄干发酵液8ml与20ml 含2.4克NaCl的顶空瓶，加盖密封。将固相萃取头插入样品 瓶顶空部分，45℃萃取60min。吸取饱和后的萃取头插入气相 色谱进样口，250℃解吸3min，进行GC-MS检测分析。

2.GC-MS实验条件：色谱柱为Agilent CP-Wa×(60m× 0.25mm，0.25μm)；进样口温度250℃；载气He；流速2ml/min； 检测器温度250℃，升温程序为初始温度50℃保持1min，4℃ /min的速度升温至230℃，保持15min。

MS条件：EI电力源；电子能量70Ev；离子源温度230℃； 扫描范围33.00～500.00u。

样品测试重复三次并取平均值。

3.风味成分SPME-GC/MS分析。

挥发性成分的定量分析：SPME-GC/MS图谱经计算机和 人工检索把每个峰同时与NIST Library和Wiley Library相匹 配检索定性，匹配度和纯度大于900作为鉴定结果。化合物定 量：按峰面积归一化法计算相对百分含量，将挥发性风味物质 中同种类物质的相对含量相加，比较不同发酵液的挥发性风味 物质中各类物质相对含量的不同。

采用SPME-GC/MS联用技术对葡萄干发酵液培养工艺 的单因素分析，初步确定葡萄干发酵液培养工艺参数：其中葡 萄干配比1:1，料液比为1:4，20℃培养7天，SPME-GC/MS 考察发酵液中挥发性风味物质的量。采用SPME-GC/MS分析 葡萄糖用量对风味物质产生情况的影响，分析结果表明：加糖 量在2％-6％范围内，C₆挥发性化合物的含量随葡萄糖浓度增 加而增加(参见图1)，当加糖量大于6％时，不利于风味物质 的生成，特别是对香气贡献大的醛类化合物己醛、反-2-己烯 醛的生成量急剧下降(参见图2)。显然，该实验条件下葡萄 糖的添加量为6％时最合适。

以上述相同方法确定葡萄干发酵液培养工艺的影响因素， 如阳光少女品种葡萄干和秀爱品种葡萄干质量比、混合葡萄干 与水的料液质量比、葡萄糖占葡萄干发酵液总质量的百分比、 发酵时间和发酵温度。

例如，以阳光少女品种葡萄干和秀爱品种葡萄干质量比为 例，通过单因素多梯度实验对葡萄干发酵液培养工艺参数设 置。可将料液比(混合葡萄干:水，g/mL)初步确定为1:4，阳 光少女和秀爱葡萄干配比分别为1:1，1:2，1:4，1:6，1:8时， 26℃培养3天，通过上述GC-MS方法考察发酵液挥发性风味 物质的相对含量，确定阳光少女葡萄干和秀爱葡萄干的添加比 例为1:1。

二、在上述单因素多梯度实验基础上，利用SPME-GC/MS 联用技术和响应面分析法(Box-Behnken法)对葡萄干发酵 液制备工艺参数进行了更加优化的分析。

根据单因素试验结果，选取对发酵过程中挥发性风味物质 产生影响较大的四个因素(发酵温度、发酵时间、混合葡萄干 与水的料液质量比料液比、葡萄糖用量)，利用Box-Behnken 方法，选取5个中心点进行29个试验，试验设计见表1。对 所得结果做响应面分析，该响应面以发酵液中C₆挥发性化合 物为响应值，研究发酵温度、时间、料液比和葡萄糖用量四因 素之间及与发酵液中C₆挥发性化合物含量的交互关系，并由 此得出葡萄干发酵的最佳工艺参数。葡萄干发酵响应面分析结 果见表2，方差分析结果见表3。

表1.因素水平表

水平 A(温度/℃) B(时间/d) C(料液比) D(加糖量/％) -1 16 6 1:2 5 0 18 7 1:3 6 1 20 8 1:4 7

表2.葡萄干发酵响应面分析结果

表3.回归模型方差分析(Y₁：C₆化合物总含量)

剔除不显著因子，得到简化回归方程如下：

Y1＝4649.6+575.67*A–163.67*B+310.33*C+204*AB+ 945*AC-170.5*BC-60*BD–201*CD–326.38*A2–264.88*B2 –429.13*C2

该方程的最优解为Y1＝5177.98μg/L，各因素分别为：温 度20℃，时间6.96d，液料比4:1，加糖量6％。为方便操作时 间定为7天，则优化的葡萄干发酵工艺为：阳光少女、秀爱葡 萄干配比为1:1，料液比1:4，葡萄糖添加量6％，在20℃下培 养7天。

三、根据上述一和二中优化所得的最优葡萄干发酵液培养 工艺参数进行葡萄干发酵液的制备。

(1)将阳光少女品种葡萄干和秀爱品种葡萄干经拣选去 杂后，按阳光少女品种葡萄干:秀爱品种葡萄干为1:1的质量比 进行混合得到混合葡萄干；

(2)按混合葡萄干与水的料液质量比为1:4分别称取混合 葡萄干和水备用；按占所述葡萄干发酵液总质量6％的量称取 葡萄糖备用；

(3)将发酵罐用清水洗净，待晾干后采用75％的食用酒精 消毒并再次晾干后，将(2)中称取的水注入发酵罐中，并将所 述葡萄糖边搅拌边加入水中，待葡萄糖充分溶解后，加入所述 混合葡萄干并搅拌均匀，然后将该发酵罐密封；

(4)保持(3)中所述发酵罐内发酵温度为20℃，密封发酵7 天后得到葡萄干发酵液。

四、将三中制备所得的葡萄干发酵液作为风味增添剂和酵 母补充剂应用于制作水果风味面包。

由于葡萄干发酵液的用途是提升面包香气，所以培养的发 酵液要耐高温烘烤，经高温烘烤后仍然能为面包提供优良的香 味，所以我们利用烘焙试验对水果发酵液进行分析,多角度验 证发酵工艺最优参数。

该风味面包的制备方法如下所述：称取面包粉、酵母、白 砂糖、食盐和水；将一部分水溶解酵母，剩余水溶解糖和食盐； 将面粉倒入搅拌缸，加入面粉，溶解酵母的水，溶解白砂糖和 食盐的水；搅拌；将搅拌好的面团室温下静置15min；将静置 好的面团进行分割并搓圆，50g/个；松弛，成形；于温度38℃ 及湿度85％下发酵；在上火/下火190/200℃的条件下烘烤 14min；然后冷却并包装。该风味面包的配料为(重量/g)，面 包粉100，酵母4，白砂糖2，食盐2，水果发酵液和水可按照 1:0，1:1，1:2，1:3，1:4比例添加。

本实施例中采用SPME-GC/MS联用技术对采用葡萄干发 酵液制备面包时，葡萄干发酵液用量对面包风味影响进行分 析，其中面包风味物质仍然采用前述C₆醇类和C₆醛类化合物。

1.GC/MS面包风味物质面包预处理方法：将面包芯分割 成约5mm×5mm×3mm的碎片，放入15mlSPME样品瓶中， 样品约占瓶子体积的3/5，盖好瓶盖，把样品瓶放入60℃恒温 水浴中，将老化好的萃取头插入样品瓶上空，顶空萃取40min, 用手柄使纤维头退回到针头内，拔出针头进样。

2.用GC/MS分析面包风味物质的方法可参照前述采用 SPME-GC/MS分析发酵液风味方法。发酵液与水添加比例为 1:0，1:1，1:2，1:3，1:4时，发酵面团，焙烤，通过用GC/MS 分析成品面包风味物质含量，从图3和图4可以看出，虽然发 酵液与水添加比例为1:1时面包中C6化合物含量最高，但是 发酵液中的酸性成分，如酒石酸、乙酸等酸类物质的含量过高 则对面包风味有不利影响。

面包感官评价参照中华人民共和国面包烘焙质量评分标 准(GB/T 14611-2008)对面包进行评价，评价结果见表4。

表4

从表4的结果可以看出，发酵液和水以1:2添加，与以其 他比例添加在面包中相比，在面包制作中添加葡萄干发酵液可 明显改善面包的风味，其中发酵液和水以1:2比例添加时效果 尤为明显。因此综合考虑，将发酵液与水添加比例确定为1:2。

实例二：

传统方法通常是采用单因素，多梯度试验确定风味水果发 酵液的工艺参数，选择影响较大的因素包括温度、时间、料液 比、加糖量对风味水果发酵液进行分析，本实施例也仅从一个 工艺参数的确定为例，说明单因素，多梯度试验确定风味水果 发酵液的分析方法，具体步骤：

在其他条件(温度、料液比、加糖量)不变的情况下，采 用料液比1:4，葡萄干配比1:1，在18℃下分别培养1，2，3， 4，5，6，7，8，9，10d。检测发酵过程中总酸、pH的变化， GC-MS考察发酵液挥发性风味物质的量。

发酵过程中产生的适量酸性成分，如酒石酸、乙酸等对面 包风味具有改善作用，过度则相反，因此有必要对发酵液的总 酸、pH加以控制。由图5中可以看出，随着发酵的进行，发 酵液的pH降低，总酸度增加，至第9天时发酵液pH趋于平 稳，而总酸度的增加亦开始减缓。

图6表明，发酵培养至第7天C6挥发性化合物含量达到 最大，随后基本保持不变。然而，由图7可知，发酵至8-10 天，尽管C6挥发性化合物总量并没有明显变化，但风味阈值 较低，对香气贡献大的己醛、反-2-己烯醛的含量急剧下降， 而香气值较小的除己醇保持不变外，顺-3-己烯醇、反-2-己烯 醇含量均明显提高。由上可见，发酵超过6天后，发酵液酸度 增加明显，挥发性风味成分损失较大，因此发酵培养6天较为 合适。

以相同方法确定影响风味水果发酵液的因素，如：风味水 果发酵液的发酵温度，料液比，葡萄糖添加量等指标。

在其他条件(温度、料液比、加糖量)不变的情况下，采 用料液比1:4，葡萄干配比1:1，分别以在18℃下培养1，3，6， 9d制作发酵液面包，分别标记为A,B,C,D,并进行感官评价。 根据单因素分析方法得到的评价结果，确定在18℃下培养6 天，发酵液风味最好。

面包制作步骤同实例一种所述，面包感官评价参照中华人 民共和国面包烘焙质量评分标准(GB/T 14611-2008)对面包 进行评价，评价结果见表5。

表5