GRK4变异体和收缩压变化与尿钠排泄率比值的联合应用及方法

摘要

本发明公开了GRK4变异体和收缩压变化与尿钠排泄率比值的联合应用及方法，具体方法为：先测定收缩压变化与尿钠排泄率比值△SBP/UNa

说明书

技术领域

本发明属于诊断领域，具体涉及检测GRK4变异体和收缩压变化与尿钠排泄率比值的试剂联合制备诊断盐敏感性试剂中的应用及方法。

背景技术

盐是最重要的环境因素之一，但个体对盐负荷或限盐有着不同的血压反应，根据个体对高盐摄入的血压反应及潴钠程度将其分为盐敏感性、盐不敏感性两大类。敏感者在正常人群中的检出率从15％～42％不等；盐敏感性个体日后发生高血压的比例明显高于非盐敏感性个体，其发生冠心病、脑卒中的几率也大大增加。另外，在高血压病人中，盐敏感与否直接影响治疗方案的选择，如利尿剂和钙拮抗药是治疗盐敏感性高血压的首选药物；盐不敏感性高血压属于钠-容量非依赖性高血压，血浆肾素活性正常或升高，利尿剂对这类高血压患者往往无效。因此，盐敏感性人群的检出不仅对于个体的一级预防，对于发生高血压、冠心病和脑卒中的个体治疗也有一定的指导意义。

既往检测盐敏感性的方法很多，急性、慢性盐负荷法，但这些研究过于复杂，费时临床开展困难，实用性不高。另外，既往提出的盐敏感性标志物也较多，包括：血浆肾素、醛固酮、血清结合珠蛋白、内源性洋地黄物质、红细胞膜钠-锂反转运速率、尿血管舒缓素、尿多巴/多巴胺排泄比率、胰岛素抵抗等，但这些方法在盐敏感性、盐不敏感性患者中存在较大的重叠，难于成为理想的盐敏感性标志物。因此，急需寻找新的盐敏感性标志物。

肾脏是人体负责钠排泄的重要器官，肾脏的利尿、利钠作用受到肾脏自分泌多巴胺的控制。既往的研究发现盐敏感性高血压病人和动物肾脏尿钠排泄功能障碍，多巴胺受体介导的利尿作用下降。由于多巴胺受体功能受到GRK4的调节，GRK4在人体存在A142V、A486V、R65L等变异体，这些变异体存在提高了GRK4的活性，导致多巴胺受体功能下降。而GRK4是否可作为盐敏感鉴定指标未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供检测GRK4变异体和收缩压变化与尿钠排泄率比值的试剂联合制备诊断盐敏感性试剂中的应用；本发明的目的之二在于提供以收缩压变化与尿钠排泄率比值联合GRK4变异体为标志物诊断盐敏感性的方法。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

1、检测GRK4变异体和收缩压变化与尿钠排泄率比值的试剂联合制备诊断盐敏感性试剂中的应用。

2、GRK4变异体和收缩压变化与尿钠排泄率比值联合诊断盐敏感性的方法，包括如下步骤：

a.测定收缩压变化与尿钠排泄率比值△SBP/UNa⁺：让受试者30分钟内口服生理盐水1500mL，然后测定口服生理盐水前后收缩压变化，记为△SBP；同时测定受试者的尿钠排泄率，记为UNa⁺，然后用△SBP除以UNa⁺计算收缩压变化与尿钠排泄率比值△SBP/UNa⁺；

b.GRK4的变异体检测：提取受试者基因组DNA，然后以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列为引物进行PCR扩增，PCR产物进行电泳判断GRK4是否为变异体；

c.根据步骤a计算的收缩压变化与尿钠排泄率比值△SBP/UNa⁺和步骤b检测的GRK4是否为变异体判断受试者为的盐敏感性。

优选的，步骤b中，所述PCR扩增的条件如下，95℃预变性5min；95℃变性45s，65℃退火40s，72℃延伸45s，35个循环，最后72℃延伸5min。

优选的，步骤c中，判断盐敏感性的判定标准为：

ΔSBP/UNa⁺≥9.38mmHg·min/μmol，GRK4为变异体判断为盐敏感性；

ΔSBP/UNa⁺在4.41-9.38mmHg·min/μmol，GRK4为变异体判断为盐敏感性；

ΔSBP/UNa⁺≤4.41mmHg·min/μmol，GRK4为野生型判断为非盐敏感性；

ΔSBP/UNa⁺在4.41-9.38mmHg·min/μmol，GRK4为野生型判断为非盐敏感性；

ΔSBP/UNa⁺≥9.38mmHg·min/μmol，GRK4为野生型判断为中间型；

ΔSBP/UNa⁺≤4.41mmHg·min/μmol，GRK4为变异体判断为中间型。

本发明的有益效果在于：本发明公开了联合尿钠排泄和GRK4变异体做为诊断盐敏感性的新指标，通过实验证明，利用急性口服盐水负荷前后收缩压变化(△SBP)与尿钠排泄率(Urinary sodium excretion(UNa+))之比可以初步用于鉴定盐敏感性及非盐敏感性，△SBP/UNa+≥9.38mmHg·min/μmo考虑可能为盐敏感性患者，△SBP/UNa+≤4.41mmHg·min/μmol考虑可能为非盐敏感性患者，△SBP/UNa+在4.41-9.38mmHg·min/μmol为中间型。进一步结合GRK4的变异体存在与否作为指标，其诊断价值达94％，敏感性到83％，特异性100％，该发明不仅仅拓宽了诊断盐敏感性的思路及方法，同时也为更好地预防和进一步有效治疗盐敏感性相关性疾病提供了新的依据。并且利用该方法诊断盐敏感性快速、有效，患者依从性更好，较静脉盐水负荷法诊断盐敏感性更佳，具有重要的临床意义。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为GRK4基因A142V变异体电泳结果。

图2为GRK4基因A142V变异体测序结果。

图3为判断盐敏感性的标准。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法或按照制造厂商所建议的条件。

实验对象：选择门诊确诊的原发性高血压患者，排除继发性高血压、合并严重糖尿病、合并肝肾功能不全、不能耐受检查者，剩余患者作为研究对象，共856名；然后对入选的研究对象测量心率、血压、身高、体重，并计算体重指数(BMI)＝体重kg/身高m²；再抽取清晨空腹血，检测血脂(甘油三酯，胆固醇)、空腹血糖，肌酐指标；询问饮酒史、吸烟史，高血压病史及服用降压药物情况。

传统判定盐敏感方法采用Weinberger法(参考文献见Weinberger MH，Miller JZ，Luft FC，Grim CE，Fineberg NS.Definitions and characteristics of sodium sensitivity and blood pressureresistance.Hypertension.1986；8(suppl II):II-127-II-134)，具体步骤如下：

第一天：

随意饮食下，8：00测血压3次，收集尿液1次，随之静滴生理盐水2000mL(500mL/h)；12：00滴完时测血压3次，计算平均动脉压。

第二天：

全天低钠饮食(含钠量10mmol)，并于10：00，14：00，18：00分别口服速尿40mg，次日晨8：00测量血压3次，计算平均动脉压。

判断标准为：

盐敏感高血压：盐消减期平均动脉压较负荷期末降低≥10mmHg；

盐不敏感高血压：盐消减期平均动脉压较负荷期末降低≤5mmHg，或在盐消减期平均动脉压升高；

中间型：消减期平均动脉压下降＞5mmHg但＜10mmHg；

对入盐敏感分型后的对象(856名)进行急性盐水负荷试验，具体方法为：将856名研究对象在30分钟内口服生理盐水1500mL，并测定饮用盐水前后收缩压变化，取三次平均值，记为△SBP；再测定与尿钠排泄率(Urinary sodium excretion(UNa⁺))，并计算△SBP与UNa⁺的比值△SBP/UNa⁺。初步判定ΔSBP/UNa⁺≥9.38mmHg·min/μmol可能为盐敏感性患者，ΔSBP/Na⁺≤4.41mmHg·min/μmol可能为非盐敏感性患者，ΔSBP/UNa⁺在4.41-9.38mmHg·min/μmol为中间型。

然后对入选的研究对象进行GRK4基因A142V变异体检测，具体方法为：抽取研究对象外周血5mL，提取基因组DNA；设计GRK4基因A142V变异体检测引物：上游引物为5’-gatgaggaccgaagtgattgt-3’(SEQ ID NO.1)；下游引物为5’-ac acaccctgtcgcaaat-3’(SEQ IDNO.2)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。然后以基因组DNA为模板，SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2为引物，进行多聚酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)，PCR条件为95℃预变性5min；95℃变性45s，65℃退火40s，72℃延伸45s，35个循环，最后72℃延伸5min；取PCR产物8μl，用3％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果，结果如图1所示，根据电泳结果判断基因型。为减少上述基因型误判率，对各基因型随机抽样在ABI3700全自动测序仪测序核实基因型，结果如图2所示。采用SeqMan软件进行相关序列的分析，其中GG型为野生型，结果显示，A142V变异体产生了2种突变基因型：AG型(突变杂合子)，AA型(突变纯合子)。

然后根据△SBP/UNa⁺和GRK4是否为变异体判断盐敏感性，判定标准如下，具体如图3所示：

ΔSBP/UNa⁺≥9.38mmHg·min/μmol且GRK4变异体型为盐敏感性患者；

ΔSBP/UNa⁺在4.41-9.38mmHg·min/μmol且GRK4变异体型为盐敏感性患者；

ΔSBP/UNa⁺≤4.41mmHg·min/μmol且GRK4野生型为非盐敏感性患者；

ΔSBP/UNa⁺在4.41-9.38mmHg·min/μmol且GRK4野生型为非盐敏感性患者；

ΔSBP/UNa⁺≥9.38mmHg·min/μmo且GRK4野生型为中间型；

ΔSBP/UNa⁺≤4.41mmHg·min/μmol且GRK4变异体型为中间型。

将传统盐敏感法作为金标准，统计本实验方案的敏感性和特异性，结果如表1所示。

表1、将传统盐敏感法作为金标准统计结果

其中敏感性＝真阳性人数/(真阳性人数+假阴性人数)*100％＝37/(181+37)＝83％；

特异性＝真阴性人数/(真阴性人数+假阳性人数)*100％＝571/(0+571)＝100％。

结果显示，本发明的实验方案的诊断敏感性为83％，特异性为100％，是一种快速、有效的诊断方法，是一种较静脉盐水负荷法诊断盐敏感性更为快速、简便，患者依从性更好的方法。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。