一种猪伪狂犬病病毒PRV-YF株及其应用

摘要

本发明涉及猪伪狂犬病病毒技术领域，具体涉及一种猪伪狂犬病病毒PRV-YF株，其保藏号为：CCTCC No：V201502。本发明还提供了猪伪狂犬病病毒PRV-YF株在制备猪伪狂犬病毒灭活疫苗中的应用、猪伪狂犬病病毒灭活疫苗及其制备方法。经免疫效力评价试验、安全性试验证明，该猪伪狂犬病病毒灭活疫苗具有良好的免疫效力，并对断奶仔猪、后备母猪、怀孕母猪等均安全。

说明书

技术领域

本发明涉及猪伪狂犬病病毒技术领域，具体涉及一种猪伪狂犬病病毒PRV-YF株，还涉及猪伪狂犬病病毒PRV-YF株的应用。

背景技术

伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)，属于疱疹病毒(Hepersviridae)α疱疹病毒亚科(Alpha-hepersririnae)水痘病毒属(Varicella virus)的疱疹病毒I型(Porcine herpesvirus TypeI)，能引发猪的严重疾病。伪狂犬病常呈爆发性流行，对妊娠母猪的危害尤其严重，常引起死胎、流产、木乃伊胎；后备母猪和空怀母猪感染病毒后可引起不育症，不发情、返情和屡配不孕。公猪感染后表现为睾丸肿胀、萎缩，失去种用能力。新生仔猪感染PRV后大量死亡，15日龄以内死亡率可达100％，3～4周龄仔猪的死亡率可达30％～40％。育肥猪感染伪狂犬病病毒后，则表现为发热，呼吸道症状以及生长迟缓，影响增重，降低饲料报酬。同时，猪既是伪狂犬病毒的贮存者，也是伪狂犬病毒的传染源，控制猪伪狂犬病不仅对养猪业本身，而且对其它动物养殖的顺利发展也有着十分重要的意义。疫苗免疫接种是预防控制与消灭伪狂犬病的根本措施。目前市售的PRV疫苗绝大多数为具有鉴别诊断能力的活疫苗，有匈牙利的天然弱毒Bartha-K/61株疫苗产品，及四川农大郭万柱教授主持研发的猪伪狂犬病活疫苗(SA215株)和华中农业大学陈焕春教授主持研发的的猪伪狂犬病活疫苗(HB98株)。该类疫苗已投放市场使用多年，对猪伪狂犬病的预防与控制发挥了重要作用。虽然偶尔有病毒分离的报道，但总体而言该病得到了有效的控制。

但2011年以来，许多使用基因缺失活疫苗免疫的规模化猪场出现了疑似PR 流行，主要表现为猪群gE抗体阳性率显著升高，母猪产弱仔、死胎，仔猪出现神经症状及死亡等。尤其2-3日龄仔猪发病严重，从发病至死亡仅5小时。目前，该病已波及国内多个省市及地区，已造成大量仔猪死亡及巨大经济损失。

因此，本发明从临床分离流行毒株，经基因序列分析及免疫保护试验，确定为猪伪狂犬病病毒PRV-YF株，扩繁后经BEI灭活，制备灭活疫苗，并评价其免疫效力。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种猪伪狂犬病病毒PRV-YF株。

本发明目的之二在于提供所述猪伪狂犬病病毒PRV-YF株在制备猪伪狂犬病毒灭活疫苗中的应用。

本发明目的之三在于提供含有所述猪伪狂犬病病毒PRV-YF株的猪伪狂犬病病毒灭活疫苗。

本发明目的之四在于提供所述猪伪狂犬病毒灭活疫苗的制备方法，通过优化各工艺参数以提高灭活疫苗的免疫保护效力或安全性。

为解决上述问题，本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明从发病仔猪的脑、扁桃体等组织中分离并经过传代适应得到猪伪狂犬病病毒PRV-YF株；本发明将猪伪狂犬病病毒PRV-YF株提交至专利认可的机构保藏，其保藏名称为：伪狂犬病病毒野生毒株PRV-YF Pseudorabies virus strain PRV-YF，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2015年01月21号，保藏号为CCTCC NO:V201502，保藏地址是：中国武汉武汉大学。

将本发明分离的猪伪狂犬病病毒PRV-YF株进行TK、gE、gG基因的序列分析及抗原变异性分析，其中，扁桃体与脑组织样品均分别扩增出754bp的TK 基因片段与578bp的gE基因片段，表明扁桃体与脑组织均为PRV阳性；将PRV-YF株接种8～10周龄Balb/C小鼠，表现注射部位瘙痒、毛发糙乱，精神沉郁；小鼠几乎全部死亡，注射部位瘙痒、毛发糙乱，精神沉郁等症状表现更加明显，注射部位被抓至溃烂，84h后陆续有小鼠死亡，症状表现明显。因此，确定PRV-YF株为猪伪狂犬病病毒临床变异株，现有猪伪狂犬病活疫苗不能使免疫动物对该毒株获得完全保护。

所述的猪伪狂犬病病毒PRV-YF株在制备猪伪狂犬病毒灭活疫苗中的应用。

一种猪伪狂犬病病毒灭活疫苗，其包括佐剂和含有灭活后的权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒PRV-YF株的病毒液。

上述的猪伪狂犬病病毒灭活疫苗的制备方法，其包括以下步骤：

1)培养如上述的猪伪狂犬病病毒PRV-YF株，获得病毒液；

2)在病毒液中加入灭活剂将病毒灭活，然后加入终止剂终止灭活，获得PRV-YF株灭活病毒液；

3)制备水相和油相，乳化，即得猪伪狂犬灭活疫苗。

具体地，作为本发明的一种实施方式，在步骤1)中所制得的病毒液的病毒含量不低于10^7.0TCID₅₀/ml。

具体地，作为本发明的一种实施方式，步骤2)中所述的灭活剂为二乙烯亚胺；按w/v计，向病毒液中加入的二乙烯亚胺占病毒液总量的0.1％～1％。

具体地，作为本发明的一种实施方式，灭活时间为12～60h；灭活温度为37℃。

具体地，作为本发明的一种实施方式，步骤2)中所述的终止剂为硫代硫酸钠；按w/v计，向病毒液中加入的硫代硫酸钠占病毒液总量的0.1％～5％。

具体地，作为本发明的一种实施方式，按w/v计，向病毒液中加入的硫代 硫酸钠占病毒液总量的0.5％～5％。

具体地，作为本发明的一种实施方式，步骤3)包括以下步骤：

A.水相制备：取步骤2)制得的PRV-YF株灭活病毒液加入终浓度为0.75％的吐温-80，边加边搅拌，直到吐温-80彻底溶解，制得水相；

B.油相制备：取白油141.75份，加入7.5份司本80，充分混匀，121℃下灭菌30min，冷却至室温备用，制得油相；

C.将上述的油相和水相按1.5∶1的比例乳化：将水相缓慢加入油相，均质1～3min后剪切，制成均匀乳剂，即为猪伪狂犬病灭活疫苗。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明从发病仔猪的脑、扁桃体等组织中分离并鉴定得到的猪伪狂犬病病毒PRV-YF株具有良好的免疫原性，现有猪伪狂犬病活疫苗不能使免疫动物对该毒株获得完全保护，可作为猪伪狂犬病灭活疫苗生产毒株及检验用毒株；采用PRV-YF株病毒液制成油包水型灭活疫苗进行免疫效力评价、安全性评价，实验表明，本发明制备的猪伪狂犬病病毒PRV-YF株具有良好的免疫效力，对断奶仔猪、后备母猪、怀孕母猪均安全，可用于预防由猪伪狂犬病毒引起的母猪繁殖障碍、不育症及其他猪的伪狂犬病。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1为本发明的实施例的流程图；

图2为Vero细胞病变观察，其中A为正常对照细胞，B为病毒接种后病变细胞，箭头所示为病变的Vero细胞；

图3为攻毒后小鼠主要表现为瘙痒，其中A为小鼠抓咬注射部位，B为注射部位被撕咬至破裂；

图4为本发明所述的PRV-YF株gE全基因的进化分析图；

图5为本发明所述的PRV-YF株gG全基因的进化分析图。

具体实施方式

除另有说明外，本申请中所有的科技术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。下列实施例旨在进一步举例说明实现本发明的具体方式，而不应理解为对本发明的限制。在不违背本发明的精神和原则的前提下，对发明进行改动得到的技术方案都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例一猪伪狂犬病病毒临床变异株的分离与鉴定

1材料

1.1细胞、病毒与疫苗

Vero细胞、PK15细胞及猪伪狂犬病病毒经典强毒株Ra株(《伪狂犬病病毒Ra株对不同细胞增殖特性及致病性研究》，余文兰等，中国畜牧兽医，2013年11期)由肇庆大华农生物药品有限公司农业部动物疫病防控生物技术与制品创制重点实验室保存；猪伪狂犬病活疫苗(K-61株)为广东大华农动物保健品股份有限公司产品。

1.2病料

云浮市新兴县某猪场发病仔猪扁桃体与脑组织。

1.3培养基及其它试剂

胎牛血清、DMEM培养基购自Gibco公司，病毒DNA/RNA提取试剂盒为Biomiga公司产品，LA Taq酶试剂盒均为TaKaRa公司产品。 

1.4实验动物

8-10周龄Balb/C小鼠购自广东省医学实验动物中心。

1.5引物

参考猪伪狂犬病病毒全基因组序列(NC_006151)，设计合成引物，用于扩增PRV gE、gG全基因。引物序列及预期PCR产物的大小见表1。TKF/TKR、gEF/gER分别为PRV TK与gE基因检测引物(参考已申请专利：201210128876.5)。

表1 检测PRV及扩增PRV gE、gG全基因的PCR引物

2病料处理与PRV检测

将发病仔猪扁桃体与脑组织按1∶3比例加入灭菌PBS研磨混匀制成的悬液，反复冻融3次，5000r/min离心15min；取上清液，一部分分别经0.45μL、0.22μL微孔滤膜过滤，置-70℃保存备用，另一部分按病毒DNA提取试剂盒提取病毒DNA，然后利用表1中引物TKF/TKR、gEF/gER分别检测PRV TK与gE基因，检测为阳性的病料用于病毒分离，PCR反应体系与反应条件如下：

结果显示，扁桃体与脑组织样品均分别扩增出754bp的TK基因片段与578bp的gE基因片段，表明扁桃体与脑组织均为PRV阳性。

3病毒分离

按常规方法培养Vero细胞，在接种前一天将致密单层的Vero细胞消化，接种于6孔细胞培养板中，每孔2mL，置于37℃、5％CO₂培养至次日，细胞交汇为80％以上。取各组织无菌病毒悬液200μL接种6孔板中Vero单层细胞，孵育1h后更换含2％胎牛血清的DMEM培养液，逐日观察细胞病变(CPE)，见图2。待约90％细胞出现CPE时冻融收毒。

4病毒纯化

常规方法进行重组病毒噬斑纯化。消化生长良好的单层细胞接种6孔培养板，37℃、5％CO₂培养至长成单层。10倍系列稀释病毒液至10^-7，取后4个稀释度病毒接种6孔板中单层细胞，每个稀释度接种一孔，37℃、5％CO₂孵育1h～2h后，吸弃病毒液，DMEM洗涤3次，覆盖含2～5％血清、2％低熔点琼脂的无酚红DMEM 1.5ml，37℃、5％CO₂培养至能观察到明显病变。覆盖第二层琼脂，即含2％低熔点琼脂、0.01％中性红的无酚红DMEM，37℃、5％CO₂孵育肉眼可见明显噬斑，根据需要挑取噬斑。经2轮纯化获得猪伪狂犬病病毒变异株，命名为PRV-YF株。

5PRV-YF株与Ra株的扩繁与TCID₅₀测定

按常规方法扩繁PRV-YF株与Ra株，即将PRV-YF株与Ra株病毒悬液接种T175培养瓶中长满单层的Vero细胞，37℃、5％CO₂培养至90％以上病变时，冻融收获病毒液。将收获的病毒液10倍系列稀释至10^-8，每个稀释度重复8孔与Vero细胞同步接种96孔板，37℃、5％CO₂培养至病变孔数不发生变化为止，读取每个稀释度的病变孔数，按Reed-Muench法计算TCID₅₀。结果见表2，PRV-YF株的TCID₅₀为10^7.43/mL，Ra株的TCID₅₀为10^7.33/mL。

表2 PRV-YF株与Ra株的TCID₅₀测定

6小鼠毒力及抗原变异测定

6.1小鼠毒力测定 

将78只8～10周龄Balb/C小鼠随机分成13组，每组6只。分别将PRV-YF株与Ra株病毒悬液分别稀释至10^6.0、10^5.0、10^4.0、10^3.0、10^2.0与10^1.0TCID₅₀/0.5mL，每个剂量1组Balb/C小鼠，共12组，另一组为空白对照组。接种后每天观察小鼠状况及死亡数量，并按Reed-Muench法计算LD₅₀。

表3 猪伪狂犬病病毒PRV-YF株与Ra株对小鼠毒力试验

注：0/6表示6只小鼠无死亡，2/6表示6只小鼠中2只死亡，其余类推。

接种后连续观察120h，对照组未表现任何异常。接种后36h内，所有攻毒小鼠未表现异常，36-48h，PRV-YF株的10^6.0TCID₅₀组有5只小鼠死亡，10^5.0、10^4.0、10^3.0TCID₅₀组小鼠表现注射部位瘙痒、毛发糙乱，精神沉郁，Ra株攻毒组未见死亡，但高剂量组也表现注射部位瘙痒、毛发糙乱，精神沉郁等症状，48-72h，小鼠反应最激烈，10^3.0TCID₅₀及以上剂量组小鼠几乎全部死亡，注射 部位瘙痒、毛发糙乱，精神沉郁等症状表现更加明显，注射部位被抓至溃烂，见图3，84h后陆续有小鼠死亡，症状表现明显。小鼠死亡按时间累计见表3，PRV-YF株LD50为10^2.25TCID₅₀，Ra株LD₅₀为10^2.12TCID₅₀，虽然2个毒株的LD₅₀无明显差异，但结合小鼠症状表现的时间及死亡时间，可以看出，PRV-YF株的毒力较Ra株稍有增强。

6.2抗原变异分析 

将30只8～10周龄Balb/C小鼠随机分成5组，每组6只。其中2组免疫猪伪狂犬病活疫苗(K-61株)，其余组不免疫，一免3周后2免。二免后2周采血，按常规方法用PK15细胞检测PRV中和抗体，免疫鼠中和抗体均大于等于1∶20，对照组小鼠均小于1∶4，结果见表4。采血后，两组免疫鼠分别用PRV-YF株与Ra株强毒攻击，剂量为100LD₅₀/只，同时各设攻毒对照组，另设一组空白对照组。结果如表4所示，攻毒后120h，非免非攻对照组小鼠未表现异常，攻毒对照组小鼠全部死亡，疫苗免疫小鼠攻击PRV Ra株后，仅个别小鼠轻微瘙痒，全部健活，而疫苗免疫小鼠攻击PRV-YF株后，3只死亡，其余表现轻微瘙痒。

表4 猪伪狂犬病活疫苗(K-61株)免疫后中和抗体检测及攻毒后小鼠死亡数量

7gE、gG全基因序列扩增与分析

将纯化的PRV-YF株病毒悬液用病毒基因提取试剂盒提取PRV基因组，然后利用表1中引物gECDSF/gECDSR、gGCDSF/gGCDSR分别扩增PRV gE与gG全基因，检测为阳性的病料用于病毒分离，PCR反应体系与反应条件如下：

gE与gG全基因的分子进化分析采用DNA star MegAlign软件。

gE全基因序列见SEQ ID No.1，进化分析见图4，gG全基因序列见SEQ ID No.2，进化分析见图5。

分子进化分析结果表明PRV-YF株gE基因、gG基因虽然与国内毒株的同源性较高，但处于独立的小分支，且与疫苗毒株Bartha K-61株及HB98株的母本毒株Ea株不处于同一分支，表明临床分离的PRV-YF株确实不同于经典毒株。

8结论

本发明从临床病料扁桃体与脑组织中分离到一株猪伪狂犬病病毒，命名为猪伪狂犬病病毒PRV-YF株，经gE、gG基因的序列分析及病毒的抗原变异性分析，确定PRV-YF株为猪伪狂犬病病毒临床变异株，现有猪伪狂犬病活疫苗不能使免疫动物对该毒株获得完全保护。

实施例二猪伪狂犬病灭活疫苗(PRV-YF株)的制备

1材料

1.1病毒和细胞 

由实施例一制得的猪伪狂犬病病毒PRV-YF株，Vero细胞由肇庆大华农生物药品有限公司农业部动物疫病防控生物技术与制品创制重点实验室保存。

1.2培养基及其它试剂

胎牛血清、DMEM培养基购自Gibco公司；白油购自美孚公司，吐温-80和司本-80购自广东肇庆超能实业有限公司；2-溴乙基胺氢溴酸盐购自梯希爱(上 海)化成工业发展有限公司；硫代硫酸钠为国产分析纯。

2猪伪狂犬病病毒PRV-YF株的增殖

按伪狂犬病病毒增殖常规方法将PRV-YF株病毒悬液接种80％融合Vero细胞，培养至100％病变时按常规方法测定其TCID₅₀，结果见表5，PRV-YF株的TCID₅₀为10^7.57/mL，表明PRV-YF株增殖良好。

表5 PRV-YF株TCID₅₀测定

3猪伪狂犬病病毒PRV-YF株的灭活条件确定

3.1灭活剂制备： 

将2-溴乙基胺氢溴酸盐(BEA)粉加入新鲜配置的0.2mol/L的氢氧化钠溶液中，置37℃下水浴，每隔10分钟振摇1次，30～60分钟后，待pH值降为8.0时终止环化，制备成终浓度为0.2mol/L的二乙烯亚胺(BEI)，无菌过滤后，置2～8℃保存备用。

3.2BEI灭活条件的确定

按以下方案进行试验，见表6：

表6 灭活剂BEI灭活条件探索试验方案

按上述方案将PRV-YF株病毒液进行试验后，将灭活样品接种Vero细胞，观察细胞病变情况，未病变细胞盲传3代继续观察，结果见表7。为了确保疫苗质量，保证疫苗中病毒抗原被充分灭活，确定PRV-YF株的灭活条件为终浓度为0.002M BEI、37℃灭活24h。

表7 灭活剂BEI灭活条件试验结果

注：+表示有细胞病变，-表示无细胞病变。

3.3终止剂硫代硫酸钠(Na₂S₂O₃)浓度的确定

将PRV-YF株病毒液用0.002M BEI、37℃灭活24h后，用终浓度(W/V)为0.01％～5％Na₂S₂O₃终止BEI活性。由于BEI主要通过作用于病毒核酸而灭活病毒，灭活检验时残余BEI能作用于细胞，导致细胞死亡或生长不良，因此，灭活检验前需终止BEI活性。结果显示，Na₂S₂O₃终浓度<0.5％时不能完全中和BEI活性，灭活终止后抗原液接种Vero细胞后，细胞生长缓慢，不能连续传代，≥0.5％时，可以完全中和BEI活性，灭活终止抗原液接种Vero细胞后，细胞生长正常，连续传代后未见异常。因此，确定终止剂Na₂S₂O₃终浓度为≥0.5％。

4半成品检验 

4.1病毒含量检验 

PRV-YF株病毒增殖后，按常规方法测定其TCID₅₀，每毫升病毒含量应不低于10^7.0TCID₅₀。

4.2灭活检验

将灭活后病毒液以10％同步接种Vero细胞连续传代3次，不出现细胞病变。

4.3无菌检验

按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验，无细菌生长。

5猪伪狂犬病灭活疫苗(PRV-YF株)的制备

5.1水相制备

取检验合格的PRV-YF株灭活抗原加入终浓度为0.75％(以毫升为单位)吐温-80，边加边搅拌，直到吐温-80彻底溶解，制备水相。

5.2油相制备

取白油141.75份(以毫升为单位)，加入7.5份司本80(以毫升为单位)，充分混匀，121℃灭菌30min，冷却至室温备用。

5.3按油相和水相1.5∶1的比例乳化

将水相缓慢加入油相，均质1～3min后剪切，制成均匀乳剂，即为伪狂犬病基因工程灭活疫苗。

6疫苗成品检验 

6.1性状检验

外观为油包水型乳白色乳状液，滴于冷水表面不分散，将疫苗以3000r/min离心15min，管底无水相析出，黏度为27.5cP。

6.2无菌检验

按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验，无细菌生长。

实施例三猪伪狂犬病灭活疫苗(PRV-YF株)免疫效力与安全性检测：

一、小鼠评价猪伪狂犬病灭活疫苗(PRV-YF株)免疫效力

由于伪狂犬病病毒可引起小鼠明显的临床症状与死亡，便于清楚地判断猪伪狂犬病灭活疫苗(PRV-YF株)的免疫效力。

1材料

1.1病毒和细胞 

猪伪狂犬病病毒YF株、Vero细胞由肇庆大华农生物药品有限公司农业部动物疫病防控生物技术与制品创制重点实验室保存。

1.2实验动物

4～6周龄Balb/C雌性小鼠购自广东省医学实验动物中心，用于猪伪狂犬病灭活疫苗(PRV-YF株)免疫效力评价。

1.3试剂

胎牛血清、DMEM培养基购自Gibco公司。

2猪伪狂犬病灭活疫苗(PRV-YF株)免疫效力测定

2.1试验方案

将36只4～6周龄Balb/C雌性小鼠共分6组，每组6只。具体方案如表8：

表8 免疫效力实验方案

一次免疫后4周，进行二次免疫。二次免疫后2周，用100LD₅₀(约10^4.25TCID₅₀)猪伪狂犬病病毒PRV-YF株攻击，攻毒后，连续观察14天。

2.2试验结果

如表9所示，免疫后，所有免疫鼠未见异常，攻毒48h后，非免疫攻毒对照组鼠明显表现瘙痒、神经症状、厌食、毛发糙乱，60h后开始出现死亡，至96h整组6只小鼠全部死亡；攻毒后整个观察期，所有免疫鼠未表现任何异常，表明本发明的猪伪狂犬病灭活疫苗(PRV-YF株)具有良好的免疫保护效力。

表9 免疫效力实验结果

注：-/6表示无死亡；1/6表示6只小鼠中有1只死亡，其余类推。

二、猪伪狂犬病灭活疫苗(PRV-YF株)安全性评价

1试验动物

猪伪狂犬病病毒抗体阴性断奶仔猪、后备母猪、怀孕母猪各30头购自温氏集团种猪场。

2试验方案:按以上方案颈部肌肉免疫后，仔细观察猪的反应情况，连续观察21天.

表10 安全性评价试验方案

2安全性评价试验结果

如表11所示，结果表明，本发明疫苗单倍剂量一次接种、超倍剂量一次接种、单倍剂量重复接种25日龄断奶仔猪。免疫仔猪接种部位无肿胀，全身未见 异常，全部健活。所有实验猪在饲养过程生长正常，没有出现意外死亡和发生疾病。同时，本发明疫苗单倍剂量一次接种、超倍剂量一次接种、单倍剂量重复接种6月龄青年后备母猪，免疫猪接种部位无肿胀，全身未见异常，全部健活。所有实验猪在饲养过程生长正常，没有出现意外死亡和发生疾病。结果显示，无论单倍剂量一次接种、超倍剂量一次接种、单倍剂量重复接种，本发明疫苗对6月龄青年后备母猪均安全。

表12结果显示，怀孕母猪单倍剂量一次接种试验组出现1头母猪接种15天后流产；超倍剂量一次接种、单倍剂量重复接种及单倍剂量重复注射生理盐水的对照组均无异常反应。对流产胎儿进行检测，皆未分离到PRV，分析流产原因，应是注射疫苗抓猪过程中机械刺激造成或是其它原因，并非疫苗本身导致流产。可见，疫苗对怀孕母猪亦是安全的。所有实验猪在饲养过程生长正常，没有出现意外死亡和发生疾病。结果显示，本发明的疫苗对怀孕母猪均安全。

表11 断奶仔猪和后备母猪安全性试验结果

表12 怀孕母猪安全性试验结果