使用了键合有香豆素衍生物的荧光标记糖衍生物的细胞成像方法及成像剂

摘要

本发明的目的在于提供能够用于细胞或细胞内分子的成像的发出蓝色荧光色的糖衍生物和使用了该衍生物的细胞的成像方法。此外，本发明的目的在于提供通过成像精度良好地检测癌细胞的方法以及用于该方法的成像剂。本发明能够提供在分子内具有3-羧基-6，8-二氟-7-羟基香豆素或3-羧基甲基-6，8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素作为荧光分子团的荧光标记糖衍生物，以及使用该衍生物的细胞的成像剂和成像方法。本发明还能够提供使用了在分子内具有上述荧光分子团的L-葡萄糖衍生物的癌细胞成像剂和成像方法。

说明书

技术领域

本发明涉及键合有特定香豆素衍生物的新的荧光标记糖衍生物、和 使用其的细胞成像方法及成像剂。本发明此外涉及使用该荧光标记衍生 物中的L-葡萄糖衍生物(键合有特定香豆素衍生物的L-葡萄糖衍生物) 对癌细胞检测和/或成像的方法及用于其的成像剂。

背景技术

以活细胞为对象，将细胞可视化成像或者以将活体内的分子作为靶 标的可视化成像弄清分子动态、分子间相互作用、分子位置信息，与生 命科学机理的阐明、药物开发筛选相关的分子成像正活跃地进行。此外 特别是，将产生异常的细胞例如癌细胞可视化来检测癌细胞、癌部位的 研究也在活跃地进行。

以葡萄糖(Glucose)为首的许多六碳糖(Hexose)例如葡萄糖、果糖、 半乳糖、甘露糖在生物活动中发挥重要作用。其中已知葡萄糖是从哺乳类 到大肠菌·酵母对细胞的生存维持最重要的能量源。特别地，脑将葡萄糖作 为唯一的能量源。葡萄糖中存在D-葡萄糖和L-葡萄糖的镜像异构体，但 是其中作为能量源生物能够利用的仅是D-葡萄糖，活细胞具有介由葡萄糖 转运体等细胞膜中的转运蛋白质将D-葡萄糖选择性摄入并利用的机制。

自然界中D型异构体大量存在，作为其光学异构体的L型完全或者 基本不存在的六单糖(Hexose)，此外可举出D-半乳糖、D-果糖、D-甘 露糖。

D-半乳糖是作为能量源被利用的糖，乳、果实类、蔬菜类丰富含有， 除此之外，人体内每日产生2g左右。例如，已知占牛奶2-8％的二糖类 乳糖是D-半乳糖和D-葡萄糖通过糖苷键键合的糖，被小肠吸收时，二 者通过乳糖酶被分离，介由葡萄糖转运体的一种SGLT被吸收入体内。 D-半乳糖由小肠上皮细胞向血管运输时，通过葡萄糖转运体GLUT2。 摄入细胞内的半乳糖，在1位接受磷酸化后，进入糖分解系统，作为能 量被利用，或者被用于糖脂、糖蛋白的生物合成。另一方面，存在L- 半乳糖是作为灵长类不能生物合成的抗氧化物质维生素C(L-抗坏血 酸)在植物内由D-葡萄糖生物合成时的途径之一的Smirnoff-Wheeler 途径的中间代谢产物的记载，但是通常生物学出现则是非常稀少的糖。

用¹⁸F将D-半乳糖标记而得的2-脱氧-2[¹⁸F]氟-D-半乳糖，有面向 肝脏的代谢解析的应用例(非专利文献1)。报告了2-脱氧-2[¹⁸F]氟-D- 半乳糖对癌的半乳糖代谢成像的可利用性，但是没有一般化(非专利文 献2)。

D-果糖也称为果糖，浆果类、甜瓜外的果实类、某种根菜中大量含 有，除此之外，也在体内产生。摄取的D-果糖，介由存在于小肠上皮 的葡萄糖转运体GLUT5被摄入上皮细胞内之后，主要是介由GLUT2 进入血液中。其中进入肝脏细胞内的果糖，受到果糖激酶引起的磷酸化， 被用于脂肪酸合成、能量产生，此外，还向D-葡萄糖转换。由于GLUT5 在平滑肌、肾脏、脂肪细胞、脑、睾丸也有发现，所以认为在这些区域 中也分别具有重要的功能，例如，作为精子活动时的能量源而被使用。 作为食品甜味料广泛流通的玉米糖浆中，提高成本低廉、特别是低温下 甜味强的D-果糖的含量，在清凉饮料水等中被大量使用，D-果糖的过 量摄取对脑的神经活动产生不良影响，作为肥胖、癌的诱因被视为危险。 虽然报告了食用L-果糖时可一定程度作为能量利用，但也推定是由于通 过肠内细菌而转换。

报告了合成1-脱氧-1-[¹⁸F]氟-D-果糖作为放射性标记体，向肿瘤中 等程度的摄入，但是本分子在细胞内没有被代谢，没有被利用。最近报 告了接受细胞内代谢的6-脱氧-6-[¹⁸F]氟-D-果糖被合成，将介由乳癌的 GLUT5的摄入作为靶标的PET示踪剂候选(非专利文献3)。

D-甘露糖含于果实、果皮等。以甘露糖为主成分的多糖被称为甘露 聚糖，植物、酵母、细菌具有该糖。魔芋以甘露糖和葡萄糖所构成的葡 甘聚糖为主成分。人经口摄取D-甘露糖时通常基本上排泄至尿中，但 是对于在人的活体内的摄入样式不明之处有很多。进入细胞内被磷酸化 之后，转化为作为糖分解系统的中间体的果糖-6-磷酸。

D-甘露糖特异性结合的甘露糖受体，对炎症时增加的高甘露糖糖蛋 白的除去有帮助。例如，机会性感染症的一种占据艾滋病患者的死因第 一位的卡氏肺孢子虫肺炎的原因菌P.carini的膜表面，有高甘露糖糖链 部分，在肺胞的巨噬细胞表达的甘露糖受体会将其识别，并促进巨噬细 胞的移动。不仅D-甘露糖，而且L-半乳糖也具有强的巨噬细胞刺激作 用，此外，D-甘露糖、L-半乳糖这二者均作为植物的维生素C生物合成 的前体被利用。

虽然报告了[¹⁸F]-2-氟-2-脱氧-D-甘露糖能够作为癌的示踪剂利用， 但是没有一般化(非专利文献4、非专利文献5)。

可见，以葡萄糖为首的各种六碳糖，在生物中发挥重要的作用。但 是，在考察这些六碳糖与细胞的关系的研究中，均存在以下举出D-葡 萄糖作为代表例进行叙述那样的相同的课题。

以往，关于生物怎样将D-葡萄糖摄入细胞内进行利用的研究，例如 是使用用放射性同位素标记的D-葡萄糖、其衍生物(D-脱氧葡萄糖等)， 通过测定细胞内的放射性同位素量来进行的。但是，虽然该方法定量性 优异，但是存在灵敏度低的问题，此外，在测定方法上，存在不能实时 连续观察活细胞摄入D-葡萄糖的情形的缺点。因此，本发明人等的小 组，作为能够用于活细胞动态摄入D-葡萄糖过程的研究的方法，提出 了使用在D-脱氧葡萄糖的2位键合N-(7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑-4- 基)氨基作为荧光发色团的发出绿色荧光的2-[N-(7-硝基苯-2-氧杂-1， 3-二唑-4-基)氨基]-2-脱氧-D-葡萄糖(2-NBDG)的方法，使用哺乳动 物的各种细胞证实了其有用性(非专利文献6)。

该方法是利用2-NBDG在活细胞内选择性摄入的性质，通过追踪摄 入引起的荧光强度的变化，能够定量确定关于细胞摄入D-葡萄糖的动 态活动，因此在研究生物怎样将D-葡萄糖摄入细胞内并进行利用方面， 被世界范围的研究者评价为划时代的方法，现在在该研究领域中，确立 了作为不可或缺的标准方案的位置(非专利文献7)。本发明人等的小组， 为了评价D-葡萄糖的特异性摄入，进一步开发了在D-脱氧葡萄糖的镜 像异构体L-脱氧葡萄糖的2位键合N-(7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑-4- 基)氨基作为荧光发色团的发出绿色荧光的2-[N-(7-硝基苯-2-氧杂-1， 3-二唑-4-基)氨基]-2-脱氧-L-葡萄糖(2-NBDLG)，而且开发了作为 发出红色荧光色的葡萄糖衍生物的、在2位以磺胺键键合了磺基罗丹明 101的L-脱氧葡萄糖(2-TRLG)(专利文献1)。

此外，报告了将在D-果糖的1位键合NBD的分子(1-NBDF)应 用于乳癌(非专利文献8)。

这样，作为分子内具有NBD的葡萄糖衍生物、果糖衍生物在各个 细胞水平能够将活细胞成像的荧光标记糖衍生物而知晓。

另外，也已知在D-葡萄糖键合发出蓝色荧光的香豆素衍生物分子而 得的荧光葡萄糖衍生物(Esculin、Fraxin、专利文献2)。但是，使用 在分子内具有蓝色荧光分子团的糖衍生物能够在各个细胞水平将活细 胞成像的报告到目前为止还没有，长久以来期望能够用于细胞水平的成 像的蓝色荧光标记糖衍生物。

作为具有活跃的增殖能力的肿瘤细胞的特征，已知需要通常细胞以 上的成为其能量源且成为氨基酸、核酸、脂质等合成材料的葡萄糖。利 用该性质，在临床医疗领域，以往将用放射性¹⁸F标记的D-葡萄糖衍生 物¹⁸F-氟-2-脱氧-D-葡萄糖(FDG)对患者给予，使用PET(阳离子断 层法)装置检测因被肿瘤组织摄取蓄积于细胞内的FDG中的¹⁸F的崩 解而放射的伽马射线，利用该方法在体外对癌进行非侵袭图像诊断的技 术正在实用化。该利用放射性标记D-葡萄糖衍生物的PET检查，由于 不具有尽可能识别各个细胞的空间分解能力(PET检查中空间分解能力 的下限实际上是5mm左右)，因此存在不能检测具有急速成长的可能性 的微小癌的课题。此外，FDG存在半衰期短(110分钟)、设备变得大 型化的问题。而且作为D-葡萄糖衍生物的放射性标记FDG中，还存在 如何回避不仅肿瘤细胞而且正常组织·正常细胞也摄入的原理性问题这 一大的课题。特别是，全身分布的脂肪组织、肌肉、以及小肠上皮、肝 脏等由于极强地摄入D-葡萄糖，所以成为肿瘤的识别问题。

此外，对于其他六碳糖，如上文所述，尝试使用其放射性标记体， 应用于癌的检测、成像。但是，与D-葡萄糖同样，由于是D型，其利 用受到限制，除此以外，还存在不能实时精度优异地检测各个单细胞的 差异的问题。

荧光标记D-葡萄糖衍生物在肿瘤成像的应用，以提高作为放射线标 记法的弱点的空间分解能力，同时避免放射性标记的复杂性、危险，能 够使用简便的设备进行瞬时的检测为目的，现在在各国正在全力推进。 报告了作为荧光标记D-葡萄糖衍生物的2-NBDG是其代表的分子之一， 与FDG同样良好地摄入肿瘤细胞(非专利文献9、专利文献3等)，尝 试了将2-NBDG应用于癌的图像诊断(非专利文献10、非专利文献11)。

为了与使用2-NBDG的情况相比即使从组织更深的位置也能够进行 荧光的检测，正在活跃地尝试将发出组织贯通性高的红色或近红外光等 在2-NBDG的长波长侧的荧光、比2-NBDG更亮的荧光分子与D-葡萄 糖键合(非专利文献12、非专利文献13、非专利文献14等)。但是， 由于全部这些新荧光分子的分子量和尺寸远远大于NBD，因此，键合 其的荧光葡萄糖衍生物均不能通过葡萄糖转运体(GLUT)。

此外，以2-NBDG为代表、目前为止报告的全部的荧光葡萄糖衍生 物是以D-(+)-葡萄糖作为母核的荧光衍生物，与放射性标记FDG相 同，也存在被正常细胞摄入的原理性问题。

另一方面，采用利用了癌细胞的代谢活动的结果的方法来识别癌的 想法被提出且受到关注(非专利文献15)。进行活跃的代谢活动的癌细 胞通过代谢在细胞内以CO₂、质子(H⁺)的形式产生大量的酸。这些所 谓的相当于废弃物的酸，在正常细胞中，借助于血流等循环系统的帮助 被除去或者中和，以防止细胞内变为酸性。但是，对应于正常细胞的代 谢活动而构建的组织不能与持续预料之外的增殖活动的癌细胞相对应。 特别是，远离血管的癌组织中，酸的除去、中和容易变得不充分，癌细 胞使各种分子机制发达来防止细胞内变为酸性。将这样的癌细胞中特别 发达的分子作为靶的战略，例如在开发对存在于低氧环境的癌细胞(已 知其是对放射线、药剂具有抵抗性的癌细胞)运输选择性对其识别的诊 断药、抗癌剂的药物输送系统方面存在有帮助的可能性。作为这样的靶 分子之一，在癌细胞的细胞膜过量表达的碳酸脱水酶群(carbonic  anhydrase)受到关注(非专利文献15)。

通常作为因身体细胞的代谢活动而细胞内必然产生的酸性废弃物 的过量CO₂，通过各种生物体机理被排出，防止细胞内的酸性化。支持 这些过程的关键是通过血流将酸除去。但是，对于在固体癌的内部与血 管相距数10微米以上的距离的癌细胞、在面向消化道内腔的位置异常 增殖且远离血管的细胞而言，氧、葡萄糖的供给不足，同时作为代谢产 物的酸的除去容易变得不充分。最近，报告了在这样的低氧·低营养环境 下进行代谢的癌细胞中，通过使跨膜型的碳酸脱水酶(CA9、CA12) 在质膜过量表达，由此对细胞内的CO₂的除去和细胞内产生的酸的中和 有帮助(非专利文献15)。Supuran等人发现作为荧光低分子化合物的 香豆素衍生物，通过与低氧状态下存在的部分癌细胞的细胞膜中强烈表 达的碳酸脱水酶(例如，假定CA 9)结合，抑制了这些酶的碳酸脱水 作用(非专利文献16、专利文献2)。这些香豆素衍生物通过破坏低氧 状态下存在的癌细胞的pH平衡，阻碍癌细胞，因此，作为新一代的抗 癌剂候选之一受到期待(非专利文献21)。

但是，碳酸脱水酶是所有细胞的生存所必须的酶，哺乳动物中，有 多达16种的异构体不仅存在于细胞膜面，在细胞质内、线粒体也存在。 因此，需要上述荧光低分子化合物不抑制在正常细胞内存在的其他类型 的碳酸脱水酶群，不产生副作用。有效的战略之一是，香豆素衍生物等 荧光低分子化合物选择性作用于癌细胞的细胞膜外侧存在反应部位的 CA9等，不侵入细胞内。在这一目的下，提出了通过将电荷导入化合物 内，或者形成糖苷而对分子赋予亲水性，使之不通过由脂质双分子层构 成的细胞膜这样的方案(非专利文献17)。例如，Supuran等人提出了 通过将各种香豆素或者其衍生物与作为天然型糖的D-葡萄糖、D-甘露 糖、D-半乳糖、L-鼠李糖等的一位键合，从而对分子赋予水溶性，赋予 细胞膜不透过性(专利文献2)。但是，一位容易受到水解，而且如果使 用天然型，则不能避免对正常细胞的影响。

近年，作为利用肿瘤细胞中表达增加的分子的方法，正在活跃地开 发在葡萄糖以外的分子键合荧光分子的荧光分子标记物。作为例子，有 利用RGD序列的物质、利用EGF的物质等(非专利文献18)。但是， 这样的方法中，即使摄入的或多或少，荧光分子也基本上会摄入正常细 胞，与使用天然型糖(例如，D-葡萄糖)衍生物的方法存在类似的问题。 另一方面，使用特异抗体等将特定的肿瘤细胞作为靶标的分子标记物， 不能判定其他类型的肿瘤，在通用性上存在难点。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:WO2010/16587号公报

专利文献2:WO2012/070024号公报

专利文献3:美国专利第6989140号说明书

非专利文献

非专利文献1:Fukuda,H.et al.,Eur.J.Nucl.Med.11:444-448, 1986

非专利文献2:Iwashita,K.,et al.,Int.J.Rad.Appl.Instrum.B.,16: 247-254,1989

非专利文献3:Wuest,M.,et al.,Nuc..Med.Biol.38:461-475,2011

非专利文献4:Ido,T.et al.,J.Labelled Comopounds and  Radiopharmaceuticals 14:175-183,1978

非专利文献5:Fukuda,H.et al.,Eur.J.Nucl.Med.7:294-297, 1982

非专利文献6:Yamada K.et al.,J.Biol.Chem.275:22278-22283, 2000

非专利文献7:Yamada K.et al.,Nat.Protoc.2:753-762,2007

非专利文献8:Levi,J.et al.,Bioconjug.Chem.18:628-634(2007)

非专利文献9:O’Neil et al,Mol.Imaging Biol.7:388-392,2005

非专利文献10:Sheth et al,J.Biomed.Opt.14:064014-1-8,2009

非专利文献11:Nitin et al,Int.J.Cancer 124；2634-2642(2009)

非专利文献12:Cheng Z.et al.Bioconjugate Chem.17:662-669, 2006

非专利文献13:Tian Y.S.et al、Angew Chem Int Ed.48:802-8031, 2009

非专利文献14:Kovar JL,et al,Anal.Biochem.384:254-262,2009

非专利文献15:Supuran,C.T.,Nat.Rev.Drug Discov.7:168-181 (2008)

非专利文献16:Maresca,A.and Supuran,C.T.,Bioorg.Med. Chem.Lett.20:4511-4514(2010)

非专利文献17:Supuran,C.T.,World J.Clin.Oncol.3:98-103 (2012)

非专利文献18:Kovar JL et al,Anal.Biochem.367；1-12,2007

非专利文献19:Bristow,R.G.,and Hill,R.P.Nat.Rev.Cancer 8: 180-192,2008

非专利文献20:Denko N.C.Nat.Rev.Cancer 8:705-713,2008

非专利文献21:Supuran,C.T.,Nat.Rev.Drug Discov.10:767-777 (2011)

发明内容

本发明的目的在于提供能够用于细胞或细胞内分子的成像的发出 蓝色荧光色的糖衍生物和使用该糖衍生物的细胞的成像方法。本发明的 另一目的在于提供通过成像精度优异地检测癌细胞的方法、以及用于该 方法的成像剂。

本发明人等鉴于上述事项进行了深入研究，结果发现使用在分子内 具有由特定的香豆素骨架构成的荧光分子团的糖衍生物，能够将活细胞 成像，从而完成本发明。本发明人等另外发现键合有特定香豆素衍生物 的L-葡萄糖衍生物能够将癌细胞成像，从而完成本发明。

本发明如以下所示。

1.一种用于将靶细胞或靶细胞内分子(靶细胞内分子包括靶细胞 的内侧即细胞质或核内存在的分子、靶细胞的细胞膜中存在的分子、靶 细胞的细胞膜上存在的分子)成像的组合物，其含有在分子内具有3- 羧基-6，8-二氟-7-羟基香豆素或3-羧基甲基-6，8-二氟-7-羟基-4-甲基香 豆素作为荧光分子团的荧光标记糖衍生物。

2.根据上述1记载的组合物，其中，荧光标记糖衍生物是葡萄糖 衍生物、果糖衍生物、半乳糖衍生物或甘露糖衍生物。

3.根据上述2记载的组合物，其中，上述荧光分子团介由-NH-键 与葡萄糖、果糖、半乳糖或甘露糖键合。

4.根据上述1记载的组合物，其中，荧光标记糖衍生物是在葡萄 糖的1位、2位、3位、4位或6位(优选为2位、3位、4位或6位， 更优选为2位、4位或6位)介由-NH-键键合3-羧基-6，8-二氟-7-羟基 香豆素或3-羧基甲基-6，8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素作为荧光分子团的 分子。

5.根据上述4记载的组合物，其中，荧光标记糖衍生物是选自2- 脱氧-2-((6,8-二氟-7-羟基香豆素-3-基)甲酰胺)-D-葡萄糖、2-脱氧-2- (2-(6,8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素-3-基)乙酰胺)-D-葡萄糖、2-脱氧 -2-((6,8-二氟-7-羟基香豆素-3-基)甲酰胺)-L-葡萄糖、和2-脱氧-2- (2-(6,8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素-3-基)乙酰胺)-L-葡萄糖中的分 子。

6.根据上述1记载的组合物，其中，荧光标记糖衍生物是在甘露糖 的1位、2位、3位、4位或6位(优选为2位、3位、4位或6位，更 优选为2位、4位或6位)介由-NH-键键合3-羧基-6，8-二氟-7-羟基香 豆素或3-羧基甲基-6，8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素作为荧光分子团的分 子。

7.根据上述6记载的组合物，其中，荧光标记糖衍生物是选自2- 脱氧-2-((6,8-二氟-7-羟基香豆素-3-基)甲酰胺)-D-甘露糖、2-脱氧-2- ((6,8-二氟-7-羟基香豆素-3-基)甲酰胺)-L-甘露糖、2-脱氧-2-(2-(6,8- 二氟-7-羟基-4-甲基香豆素-3-基)乙酰胺)-D-甘露糖、和2-脱氧-2-(2- (6,8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素-3-基)乙酰胺)-L-甘露糖中的分子。

8.一种成像方法，是将靶细胞或靶细胞内分子(靶细胞内分子包 括靶细胞的内侧即细胞质或核内存在的分子、靶细胞的细胞膜中存在的 分子、靶细胞的细胞膜上存在的分子)成像的方法，包括以下工序，

a.使上述1～7中任一项记载的组合物与靶细胞(靶细胞包括细胞 其本身，还包括组织内存在的细胞)接触的工序，和

b.检测该靶细胞内(包括靶细胞的内侧即细胞质或核内、靶细胞 的细胞膜中和靶细胞的细胞膜上)存在的该糖衍生物的工序。

9.一种荧光标记糖衍生物，是对选自葡萄糖、果糖、半乳糖和甘 露糖中的糖介由-NH-键键合3-羧基-6，8-二氟-7-羟基香豆素或3-羧基甲 基-6，8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素作为荧光分子团而成的。

10.一种荧光标记糖衍生物，其选自2-脱氧-2-((6,8-二氟-7-羟基 香豆素-3-基)甲酰胺)-D-葡萄糖、2-脱氧-2-(2-(6,8-二氟-7-羟基-4- 甲基香豆素-3-基)乙酰胺)-D-葡萄糖、2-脱氧-2-((6,8-二氟-7-羟基香 豆素-3-基)甲酰胺)-L-葡萄糖、2-脱氧-2-(2-(6,8-二氟-7-羟基-4-甲 基香豆素-3-基)乙酰胺)-L-葡萄糖、2-脱氧-2-((6,8-二氟-7-羟基香豆 素-3-基)甲酰胺)-D-甘露糖、2-脱氧-2-(2-(6,8-二氟-7-羟基-4-甲基 香豆素-3-基)乙酰胺)-D-甘露糖、2-脱氧-2-((6,8-二氟-7-羟基香豆素 -3-基)甲酰胺)-L-甘露糖、和2-脱氧-2-(2-(6,8-二氟-7-羟基-4-甲基 香豆素-3-基)乙酰胺)-L-甘露糖。

11.一种荧光标记糖衍生物，其是2-脱氧-2-((6,8-二氟-7-羟基香 豆素-3-基)甲酰胺)-D-葡萄糖或2-脱氧-2-((6,8-二氟-7-羟基香豆素-3- 基)甲酰胺)-D-甘露糖。

12.一种检测方法，该方法是用于检测癌或癌细胞的方法，包括以 下工序，

a.使含有荧光标记L-葡萄糖衍生物的组合物与靶细胞(靶细胞包括 细胞其本身，还包括组织内存在的细胞)接触的工序，所述荧光标记 L-葡萄糖衍生物键合有3-羧基-6，8-二氟-7-羟基香豆素或3-羧基甲基-6， 8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素作为荧光分子团，和

b.检测该靶细胞内(包括靶细胞的内侧即细胞质或核内、靶细胞 的细胞膜中和靶细胞的细胞膜上)存在的该L-葡萄糖衍生物的工序。

13.根据上述12记载的检测方法，上述荧光标记L-葡萄糖衍生物是 在L-葡萄糖的1位、2位、3位、4位或6位(优选为2位、3位、4位 或6位，更优选为2位、4位或6位)介由-NH-键键合3-羧基-6，8-二 氟-7-羟基香豆素或3-羧基甲基-6，8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素作为荧 光分子团的分子。

14.根据上述12记载的检测方法，上述荧光标记L-葡萄糖衍生物 是2-脱氧-2-((6,8-二氟-7-羟基香豆素-3-基)甲酰胺)-L-葡萄糖或2- 脱氧-2-(2-(6,8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素-3-基)乙酰胺)-L-葡萄糖。

15.根据上述12～14中任一项记载的检测方法，上述工序a中的检 测通过将靶细胞成像来进行。

16.根据上述12～15中任一项记载的检测方法，上述工序a中的组 合物进一步含有在2位以磺胺键键合了磺基罗丹明(优选为磺基罗丹明 101、磺基罗丹明B)的2-氨基-2-脱氧-L-葡萄糖，且上述工序b是检测 靶细胞内存在的(任一个或两种)荧光标记L-葡萄糖衍生物的工序。

17.根据上述12～16中任一项记载的检测方法，靶细胞是肿瘤细 胞块中的细胞。

18.一种癌细胞成像剂，用于将靶癌细胞(靶细胞包括细胞其本身， 还包括组织内存在的细胞)成像(例如，通过靶癌细胞内(包括靶细胞 的内侧即细胞质或核内、靶细胞的细胞膜中和靶细胞的细胞膜上)摄入 荧光标记L-葡萄糖衍生物将癌细胞成像)，含有键合有3-羧基-6，8-二 氟-7-羟基香豆素或3-羧基甲基-6，8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素作为荧 光分子团的荧光标记L-葡萄糖衍生物。

19.根据上述18记载的成像剂，其中，上述荧光标记L-葡萄糖衍 生物是在L-葡萄糖的1位、2位、3位、4位或6位(优选为2位、3 位、4位或6位，更优选为2位、4位或6位)介由-NH-键键合3-羧基 -6，8-二氟-7-羟基香豆素或3-羧基甲基-6，8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素 作为荧光分子团的荧光标记L-葡萄糖衍生物。

20.根据上述18记载的成像剂，其中，上述荧光标记L-葡萄糖衍 生物是2-脱氧-2-((6,8-二氟-7-羟基香豆素-3-基)甲酰胺)-L-葡萄糖或 2-脱氧-2-(2-(6,8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素-3-基)乙酰胺)-L-葡萄 糖。

21.根据上述18～20中任一项记载的成像剂，其中，上述成像剂 进一步含有在2位以磺胺键键合了磺基罗丹明(优选为磺基罗丹明101 或磺基罗丹明B)的2-氨基-2-脱氧-L-葡萄糖。

22.一种荧光标记L-葡萄糖衍生物，其是2-脱氧-2-((6,8-二氟-7- 羟基香豆素-3-基)甲酰胺)-L-葡萄糖或2-脱氧-2-(2-(6,8-二氟-7-羟 基-4-甲基香豆素-3-基)乙酰胺)-L-葡萄糖。

23.一种用于检测癌细胞的试剂盒，其含有上述17～20中任一项 记载的成像剂。

24.通过使用上述11～16中任一项记载的检测方法检测癌细胞， 诊断靶细胞是癌的方法。

本发明能够提供以高的对比度识别细胞或细胞内的分子的蓝色成 像剂。本发明还能够提供以高的对比度识别癌细胞的方法及用于其的成 像剂。

附图说明

图1:表示对正常神经细胞给予发出蓝色荧光的D-葡萄糖衍生物 (2-PBDG：100μM)和发出红色荧光的L-葡萄糖衍生物(2-TRLG： 20μM)的混合液的结果。

图2：表示对正常神经细胞给予发出蓝色荧光的L-葡萄糖衍生物 (2-PBLG：100μM)和发出红色荧光的L-葡萄糖衍生物(2-TRLG： 20μM)的混合液的结果。

图3：表示对正常神经细胞给予发出蓝色荧光的D-葡萄糖衍生物 (2-HCDG：100μM)和发出红色荧光的L-葡萄糖衍生物(2-TRLG： 20μM)的混合液的结果。

图4：表示使用荧光酶标仪定量解析使小鼠胰岛瘤细胞(MIN6)分 别摄入2-PBDG(100μM)和2-PBLG(100μM)5分钟时的由葡萄糖 转运抑制剂根皮素的有无引起的差异的结果。

图5：表示对培养第10日的小鼠胰岛瘤细胞细胞(MIN6)给予D- 葡萄糖衍生物(2-PBDG)、L-葡萄糖衍生物(2-PBLG)和非糖部分的 基本骨架PB-NH₂所致的荧光强度变化和葡萄糖转运抑制剂所致的效 果。

图6：表示使用荧光酶标仪定量解析使小鼠胰岛瘤细胞(MIN6)分 别摄入2-PBDM(100μM)5分钟时的由葡萄糖转运抑制剂根皮素的有 无引起的差异的结果。

图7：是在培养下显示三维的发达的癌细胞块(球状体，培养第15 日的MIN6细胞)中，表示发生凋亡的细胞、发生坏死的细胞、以及具 有被DAPI强染色的细胞核的细胞的空间配置的显微镜照片。

图8：是多个MIN6细胞集合的细胞块(从培养开始第13日)的显 微镜照片。

图9：是对实施例7的由小鼠胰岛瘤细胞(MIN6)形成的肿瘤细胞 块给予由100μM的2-PBLG、100μM的2-NBDLG和20μM的2-TRLG 组成的混合溶液中的利用实时激光扫描共焦点显微镜而取得的图像。

图10：是如上取得的图像从给予结束经过2分钟后的取得图像。

图11：是如上取得的图像从给予结束经过8分钟后的取得图像。

图12：是如上取得的图像从给予结束经过12分钟后的取得图像。

图13：是将图9所示的癌细胞块中心部付近放大的成像。

图14：是对实施例8的由小鼠胰岛瘤细胞(MIN6)构成的肿瘤细 胞块给予由100μM的2-PBLG和20μM的2-TRLG构成的混合溶液前 的利用实时激光扫描共焦点显微镜取得的图像。

图15：是如上取得的图像从给予结束经过2分钟后的取得图像。

图16：是如上取得的图像从给予结束经过8分钟后的取得图像。

图17：是如上取得的图像从给予结束经过12分钟后的取得图像。

具体实施方式

本发明的一个实施方式是使用键合有特定香豆素衍生物(Pacific  Blue或Marina Blue)的糖衍生物将细胞或细胞内的分子成像的成像剂， 以及使用该成像剂的细胞或细胞内分子的成像方法。

本发明的一个实施方式是键合有能够用于上述成像剂的特定香豆 素衍生物(Pacific Blue或Marina Blue)的荧光标记糖衍生物。

本发明的其他实施方式是使用对L-葡萄糖键合特定香豆素衍生物 (Pacific Blue或Marina Blue)的荧光标记L-葡萄糖衍生物来检测癌细 胞的成像剂，以及使用该成像剂检测癌细胞的方法。

本发明另一个实施方式是键合有能够用于上述成像剂的香豆素衍 生物(Pacific Blue或Marina Blue)的荧光标记L-葡萄糖衍生物。

根据本发明，将含有在分子内具有3-羧基-6，8-二氟-7-羟基香豆素 (Pacific Blue)或3-羧基甲基-6，8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素(Marina  Blue)作为荧光分子团的荧光标记糖衍生物的组合物(以下称为“本发 明组合物”或“本发明成像剂”)作为试剂，通过与靶细胞接触，从而 在各个细胞水平能够将靶细胞或靶细胞内分子(靶细胞内分子包括靶细 胞的内侧即细胞质或核内存在的分子、靶细胞的细胞膜中存在的分子、 靶细胞的细胞膜上存在的分子)成像。此外根据本发明，通过使本发明 的组合物与包含靶细胞的组织接触进行成像，从而在各个细胞水平能够 将组织中的细胞或细胞内的分子成像。

本发明的荧光标记糖衍生物的糖是活细胞(正常细胞或异常细胞) 中摄入细胞内的糖即可，可以是任意的糖，优选为葡萄糖、果糖、半乳 糖或甘露糖。此外，糖存在D型和L型，但是本发明中，能够使用任 意一种。通过使用D型和L型，基于这些各种糖的DL的立体构型，在 细胞水平将靶成像，从而不仅能够阐明其功能，而且能够识别正常细胞 和异常细胞。

另外，在与D型和L型的立体构型相关的糖的识别、转运、代谢 中，对具有与哺乳动物细胞不同性质的微生物，通过使用D型或L型 的荧光标记糖衍生物在细胞水平成像，也能够阐明其功能。

根据本发明，进一步将含有在分子内具有3-羧基-6，8-二氟-7-羟基 香豆素(Pacific Blue)或3-羧基甲基-6，8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素 (Marina Blue)作为荧光分子团的荧光标记L-葡萄糖衍生物的组合物 (以下称为“本发明组合物”或“本发明成像剂”)作为试剂，通过与 靶细胞接触，从而能够判定靶细胞是不是癌细胞。此外，本发明通过使 本发明组合物与含有靶细胞的组织接触进行成像，能够检测组织中的癌 细胞。另外，本发明通过对活体给予本发明组合物进行成像，从而能够 检测癌细胞或含有这些细胞的组织，该方法作为检测癌的方法是有用 的。

本发明的组合物包括含有本发明荧光标记糖衍生物的可对细胞适 用的任意形态的组合物，溶液、凝胶、另外只要能够应用于细胞则没有 特别限制。此外，组合物中的成分只要是能够适合应用于细胞的物质则 可以没有特别限制地含有。例如，能够将本发明荧光标记糖衍生物在缓 冲液、细胞培养用培养基中溶解而应用于细胞。

I.使用了荧光标记糖衍生物的细胞或细胞内分子的成像

(I-1)荧光标记糖衍生物

能够用于细胞或细胞内分子的成像的发出蓝色荧光的本发明荧光 标记糖衍生物是对糖、优选对葡萄糖、果糖、半乳糖或甘露糖键合3- 羧基-6，8-二氟-7-羟基香豆素(Pacific Blue)或3-羧基甲基-6，8-二氟 -7-羟基-4-甲基香豆素(Marina Blue)作为荧光分子团的荧光标记糖衍 生物。

糖衍生物的荧光分子团的键合部位只要是按照本说明书记载方法 或常规方法能够合成则可没有特别限制，对于葡萄糖而言可举出1位、 2位、3位、4位或6位(优选为2位、3位、4位或6位，更优选为2 位、4位或6位)，对于果糖而言可举出1位、3位、4位、5位或6位 (优选为1位、5位或6位，更优选为1位)，对于半乳糖而言可举出1 位、2位、3位、4位或6位(优选为2位、3位、4位或6位，更优选 为2位、3位或6位)，对于甘露糖而言可举出1位、2位、3位、4位 或6位(优选为2位、3位、4位或6位，更优选为2位、4位或6位)。

以下，参照葡萄糖，说明上述荧光分子团与糖的键合，其他的糖也 是同样的。

上述荧光分子团与糖的键合位置没有特别限制，按照常规方法能够 在任意位置键合。例如，与葡萄糖键合的情况下，可以在葡萄糖的1位、 2位、3位、4位或6位任意的位置键合上述荧光分子团，优选为2位、 3位、4位或6位。此外，例如在2位中，键合可以使用葡糖胺介由-NH- 进行。

葡糖胺可以使用D-葡糖胺或L-葡糖胺。D-葡糖胺可以使用合成的 D-葡糖胺或市售的D-葡糖胺。L-葡糖胺可以使用WO2010/16587号公 报记载的方法、或PCT/JP2012/58439号申请说明书记载的方法合成(这 些公报或申请说明书的记载通过引用构成本说明书的一部分)。 PCT/JP2012/58439号申请说明书记载的方法如下所示。

本发明的葡萄糖键合Pacific Blue(PB)的荧光标记葡萄糖衍生物 优选由以下的式(1)或(2)表示。

式(1)(对D-葡糖胺键合Pacific Blue(PB)的物质：称为2-PBDG) 和式(2)(对L-葡糖胺键合Pacific Blue(PB)的物质：称为2-PBLG) 存在镜像异构体关系，最大激发波长(Ex max)和最大荧光波长(Em  max)均为403nm(Ex max)和453nm(Em max)。

本发明的发出蓝色荧光的葡萄糖衍生物能够使用任意的溶液，例如 溶解于DMSO等溶剂使用，此外，由于在细胞或细胞内分子成像中使 用的溶剂、溶液中也是稳定的，所以作为成像剂是合适的。

(I-2)细胞或细胞内分子的成像

作为使用了本发明的发出蓝色荧光的糖衍生物的成像的对象的靶 细胞，没有特别限制，可以将哺乳动物来源的细胞、大肠菌、酵母等微 生物的细胞、植物的细胞、受精卵等作为对象，此外，也可以是从活体 分离的细胞、从活体分离的组织中存在的细胞、活体组织中存在的细胞、 从活体分离后的初代培养细胞、或分化细胞等任意形态的细胞。而且， 作为对象的细胞，可以是正常细胞，也可以是异常细胞(例如癌细胞)。

本发明的细胞或细胞内分子的成像方法中，摄入细胞内的本发明荧 光标记糖衍生物的检测，可以按照通常使用的检测荧光的方法进行。例 如可以按照以下方式进行。本发明方法中的存在于细胞内的荧光标记糖 衍生物的检测可以首先测量靶细胞的荧光，其次使荧光标记的糖衍生物 与靶细胞接触一定时间，然后将其冲洗，再次测量靶细胞的荧光，用相 对于接触前的靶细胞荧光强度的荧光强度的增加进行评价。此外，在使 荧光标记的糖衍生物接触中，也可以使用共焦点显微镜等能够识别细胞 内、细胞膜、细胞外的适当的装置将细胞成像。通过将荧光强度作为图 像识别，从而将细胞内具有本发明荧光标记糖衍生物的细胞图像化，能 够检测细胞或细胞内分子。另外，也可以使用荧光酶标仪、流式细胞仪 等以多个细胞显示的荧光强度的总和或者荧光强度的分布进行评价。

通过使用本发明荧光标记糖衍生物，能够将细胞和/或细胞内分子的 蓝色进行检测和/或成像。本发明的荧光标记糖衍生物可以与具有其他 荧光发色团的糖衍生物例如发出绿色荧光的2-NBDG、2-NBDLG和/或 发出红色荧光的2-TRLG同时使用。2-NBDG、2-NBDLG和2-TRLG 记载于WO2010/16587号公报(通过引用构成本说明书的一部分)。由 此，能够进行2色或3色的评价。

II.使用了L-葡萄糖衍生物的癌细胞的检测或成像

(II-1)

能够用于癌细胞的检测或成像的发出蓝色荧光的本发明L-葡萄糖 衍生物是对L-葡萄糖键合3-羧基-6，8-二氟-7-羟基香豆素(Pacific Blue) 或3-羧基甲基-6，8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素(Marina Blue)作为荧 光分子团的分子。与L-葡萄糖的键合，可以在葡萄糖的1位、2位、3 位、4位或6位任意位置键合上述荧光分子团，优选为2位、3位、4 位或6位，更优选为2位、4位或6位。此外，例如在2位，键合使用 葡糖胺介由-NH-进行。

本发明的荧光标记L-葡萄糖衍生物优选为下述式(2)表示。

(II-2)癌细胞的检测或成像

癌通过无限持续增殖，对活体产生多种不良影响，特别是近年指出 癌的内部存在对抗癌剂、放射线治疗具有抵抗性的癌细胞，这样的特殊 的癌细胞具有适应正常细胞不能生存的低氧、低营养环境的分子机制 (参照非专利文献19)。

本发明的荧光标记L-葡萄糖衍生物是将特定香豆素衍生物(Pacific  Blue或Marina Blue)作为键合分子，将具有不被正常细胞摄入的性质 的L-葡萄糖与之键合的化合物。由于香豆素及其衍生物与低氧、低营养 环境下存在的癌细胞过量表达的碳酸脱水酶键合而抑制其功能，因此通 过对含有癌细胞的细胞集团给予，能选择性将上述特殊的癌细胞荧光可 视化，而且能够抑制其功能，且对正常细胞的影响保持在最小限度。

作为本发明的方法中成为靶的细胞，例如存在于固体癌、或者消化 道等的内腔，存在于发现二维的或者三维的显著增殖的癌细胞集团中， 可举出在低氧、低营养等能量缺乏状态下存在的癌细胞(非专利文献 20)。靶细胞的形态，没有特别限制，可以是从活体分离的细胞、从活 体分离的组织中存在的细胞、活体组织中存在的细胞、从活体分离后的 初代培养细胞、或分化的细胞等任意的细胞形态。

对本发明的荧光标记L-葡萄糖衍生物(例如2-PBLG)呈强阳性的 细胞，认为是在应对低氧环境中获得优异转化的癌细胞，这样的癌细胞 有可能是获得在转移位置与本来该癌细胞存在的环境不同的环境下也 能够生存的能力之一的细胞，使用本发明的荧光标记L-葡萄糖衍生物， 能够选择性将这样的细胞识别·可视化。

本发明的检测癌的方法中，能够同时使用本发明的荧光标记L-葡萄 糖衍生物(分子内具有Pacific Blue或Marina Blue的L-葡萄糖衍生物) 和其他荧光标记的L-葡萄糖衍生物，例如2-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3- 二唑-4-基)氨基]-2-脱氧-L-葡萄糖(2-NBDLG)、2-德克萨斯红-2-氨基 -2-脱氧-L-葡萄糖(2-TRLG)。由此，也能够一同进行癌细胞、含有癌 细胞的肿瘤细胞块全体的状态评价。

本发明的检测癌的方法和用于其的成像剂，将手术时摘出的组织、 口腔内肿瘤、使用内视镜的消化器官肿瘤、宫颈癌等妇科肿瘤、其他的 肺、各种脏器的活检诊断时等得到的活体标本作为对象，能够用于低氧 抵抗性肿瘤细胞的存在、状态评价、与正常细胞的区别。由此，使用具 备荧光的简便的装置，能够迅速进行细胞单位的详细的细胞评价，对治 疗法选择的指导、药剂等治疗效果的判定、患部露出后的适当手术范围 的确定等是有效的。

本发明的检测方法中的、癌细胞内存在的荧光标记L-葡萄糖衍生物 的检测，例如可以首先测量靶细胞的荧光，接下来使荧光标记的L-葡萄 糖衍生物与靶细胞接触一定时间，然后将其冲洗，再次测量靶细胞的荧 光，以相对于接触前的靶细胞荧光强度的荧光强度的增加进行评价。通 过将荧光强度作为图像识别，能够将细胞内具有荧光标记的L-葡萄糖衍 生物的细胞图像化而能够检测癌细胞或具有这种可能的细胞。此外，也 可以使用荧光酶标仪、流式细胞仪等用多个细胞显示的荧光强度的总和 或者荧光强度的分布进行评价。此外，本发明的荧光标记的L-葡萄糖衍 生物在对静脉等血管给予时能够进行全身成像，此外，通过对要观察的 组织局部给予，也能够进行细胞成像。

根据以上说明可知，本发明的荧光标记L-葡萄糖衍生物对于检测癌 细胞是有用的，而且例如作为用于将癌细胞可视化的成像剂的有效成分 也是有用的。荧光标记L-葡萄糖衍生物可以溶解于用于溶解其的溶剂 (注射用生理盐水等)以溶液的形态提供，也可以以与用于将其溶解的 溶剂组合并在用时溶解而制备溶液的试剂盒的形态提供。溶液中荧光标 记L-葡萄糖衍生物的浓度，例如可以制备在1nM～100mM的范围。应 予说明，为了检测癌细胞，在使用本发明的标记的L-葡萄糖衍生物的方 法中，可以组合使用与荧光检测相关的或者与细胞检测相关的公知方 法，进一步实现判定精度的提高。

实施例

以下，通过实施例对本发明进行详细说明，但不能理解为本发明受 到以下记载的限制。

实施例1：化合物的合成

(1)荧光标记糖衍生物的合成

2-PBDG(2-脱氧-2-((6,8-二氟-7-羟基香豆素-3-基)甲酰胺)-D-葡萄糖)的合成

下述式表示的2-PBDG按照以下方式合成。

将D-葡糖胺盐酸盐(47.7mg)溶解于二甲基甲酰胺/水＝10/3 (1.3mL)，搅拌。添加Pacific Blue^TM琥珀酰亚胺酯(50mg)，进而添 加三乙胺(40.8μL)。5小时后加入醋酸中和，添加水通过膜过滤器。将 滤液和清洗液合并，使用HPLC精制。收集目标馏分，冷冻干燥。

收量：42.9mg、收率：72％

¹H-NMR(400MHz、氘代甲醇、ppm)：

δ9.11(d，0.8H，J＝9.2Hz，NH)，δ8.98(d，0.2H，J＝9.2Hz，NH)，δ8.7 7(s，1H，H4’)，δ7.43(dd，1H，J＝10.3Hz and J＝2.1Hz，H5’)，δ5.1 8(d，0.8H，J＝3.2Hz，H-1α)，δ4.77(d，0.2H，J＝8.7Hz，H-1β)，δ3. 35-δ4.10(m，6H，H-2，H-3，H-4，H-5，H-6，H-6).

ESI-MS：calcd for C₁₆H₁₆F₂NO₉[M+H]⁺404.07，found 404.0

激发极大波长：403nm

荧光极大波长：453nm

2-PBLG(2-脱氧-2-((6，8-二氟-7-羟基香豆素-3-基)甲酰胺)-L-葡萄糖)的合成

下述式表示的2-PBLG按照以下方式合成。

将L-葡糖胺盐酸盐(12.7mg)溶解于二甲基甲酰胺/水＝10/1 (1.1mL)，搅拌。添加Pacific Blue^TM琥珀酰亚胺酯(10mg)，进而 添加三乙胺(12.3μL)。3小时后加入醋酸中和，加入水通过膜过滤器。 合并滤液和清洗液用HPLC精制。收集目标馏分冷冻干燥。

收量：9.2mg、收率：77％

¹H-NMR(400MHz、氘代甲醇、ppm)：

δ9.11(d，0.8H，J＝9.2Hz，NH)，δ8.98(d，0.2H，J＝9.2Hz，NH)，δ8.7 7(s，1H，H4’)，δ7.43(dd，1H，J＝10.3Hz and J＝2.1Hz，H5’)，δ5.1 8(d，0.8H，J＝3.2Hz，H-1α)，δ4.77(d，0.2H，J＝8.7Hz，H-1β)，δ3. 35-δ4.10(m，6H，H-2，H-3，H-4，H-5，H-6，H-6).

ESI-MS：calcd for C₁₆H₁₆F₂NO₉[M+H]⁺404.07，found 404.0

激发极大波长：403nm

荧光极大波长：453nm

其他的PBDG和PBLG的合成

在D-葡萄糖的3位、4位或6位键合荧光分子团的Pacific Blue标 记D-葡萄糖衍生物可通过分别使用3-氨基-3-脱氧-D-葡萄糖、4-氨基-4- 脱氧-D-葡萄糖、或者6-氨基-6-脱氧-D-葡萄糖作为原料，按照常规方法， 将Pacific Blue导入D-葡萄糖的3位、4位或6位而合成。此外，在1 位的荧光分子团的导入可以合成作为中间体的1-叠氮化物，在还原后立 即进行荧光化。

Pacific Blue标记L-葡萄糖衍生物，通过使用氨基脱氧-L-葡萄糖作 为原料，能够同样地合成。

2-PBDM(2-脱氧-2-((6，8-二氟-7-羟基香豆素-3-基)甲酰胺)-D-甘露糖)的合成

下述式表示的2-PBDM按照以下方式合成。

将D-甘露糖胺盐酸盐(9.5mg)溶解于水(40μL)，添加二甲基甲 酰胺(100μL)和三乙胺(10.3μL)室温下搅拌。添加Pacific Blue^TM琥 珀酰亚胺酯(10mg)/二甲基甲酰胺(800μL)室温下搅拌。1小时30 分后添加三乙胺(5.2μL)，室温下搅拌。1小时30分后加入醋酸中和， 通过膜过滤器。合并滤液和清洗液，HPLC精制。收集目标馏分，冷冻 干燥。

收量：10.5mg、收率：88％

¹H-NMR(400MHz、氘代甲醇、ppm)：

δ9.14(m，0.5H，NH)，δ8.74(m，1H，Ar)，δ7.87(s，0.5H，NH)，δ7.4 0(m，1H，Ar)，δ5.14(d，0.5H，J＝1.8Hz，H-1)，δ4.93(d，0.5H，J＝1. 4Hz，H-1)，δ3.43-δ4.57(m，6H，H-2，H-3，H-4，H-5，H-6，H-6).

ESI-MS：calcd for C₁₆H₁₆F₂NO₉[M+H]⁺404.07，found 404.0

激发极大波长：404nm

荧光极大波长：453nm

2-PBLM(2-脱氧-2-((6，8-二氟-7-羟基香豆素-3-基)甲酰胺)-L-甘露糖)的合成法

下述式表示的2-PBLM按照与作为其镜像异构体的上述2-PBDM同 样的方法合成。

其他的PBDM和PBLM的合成

在D-甘露糖的3位、4位或6位键合荧光分子团的Pacific Blue标 记D-甘露糖衍生物可通过分别使用3-氨基-3-脱氧-D-甘露糖、4-氨基-4- 脱氧-D-甘露糖、或者6-氨基-6-脱氧-D-甘露糖作为原料，按照常规方法， 将Pacific Blue导入D-甘露糖的3位、4位或6位而合成。此外，在1 位的荧光分子团的导入可以合成作为中间体的1-叠氮化物，在还原后立 即进行荧光化。

Pacific Blue标记L-甘露糖衍生物通过使用氨基脱氧-L-甘露糖作为 原料，同样能够合成。

2-MBDG(2-脱氧-2-(2-(6，8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素-3-基)乙酰胺)-D-葡萄糖)的合成

下述式表示的2-MBDG按照以下方式合成。

将D-葡糖胺盐酸盐(11.7mg)溶解于水(50μL)，添加二甲基甲酰 胺(50μL)，搅拌。向其添加三乙胺(11.3μL)之后添加Marina Blue^TM琥珀酰亚胺酯(10mg)的二甲基甲酰胺溶液，室温下搅拌。添加醋酸 中和之后，通过膜过滤器，合并滤液和清洗液，用HPLC精制。收集目 标馏分，冷冻干燥。

收量：11.4mg、收率：97％

¹H-NMR(400MHz、氘代甲醇、ppm)：

δ7.89(d，0.4H，J＝10.1Hz，NH)，δ7.37(dd，1H，J＝11.9Hz and J＝2.3 Hz，H5’)，δ5.11(d，0.7H，J＝3.2Hz，H-1α)，δ4.61(d，0.3H，J＝7.8 Hz，H-1β)，δ3.34-δ3.87(m，8H，H-2，H-3，H-4，H-5，H-6，H-6，C3’- CH₂)，δ2.41(s，3H，C4’-CH₃)

ESI-MS：calcd for C₁₈H₂₀F₂NO₉[M+H]⁺432.10，found 432.1

激发极大波长：364nm

荧光极大波长：458nm

2-MBLG(2-脱氧-2-(2-(6，8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素-3-基)乙酰胺)-L-葡萄糖)的合成

下述式表示的2-MBLG按照以下方式合成。

将L-葡糖胺盐酸盐(7.1mg)溶解于水(56μL)，添加二甲基甲酰 胺(400μL)搅拌。添加Marina Blue^TM琥珀酰亚胺酯(10mg)/二甲 基甲酰胺(1.2mL)，接下来添加三乙胺(8.3μL)，室温下搅拌。1小时 30分后，追加L-葡糖胺盐酸盐(1.8mg)和三乙胺(1.1μL)，室温下 搅拌。进而1小时后追加三乙胺(1.9μL)，室温下搅拌。30分钟后添加 醋酸中和之后，通过膜过滤器，将滤液和清洗液合并，用HPLC精制。 收集目标馏分，冷冻干燥。

收量：10.0mg、收率：85％

¹H-NMR(400MHz、氘代甲醇、ppm)：

δ7.86(d，0.2H，J＝9.2Hz，NH)，δ7.36(dd，1H，J＝11.9Hz and J＝2.3H z，H5’)，δ5.10(d，0.7H，J＝3.2Hz，H-1α)，δ4.61(d，0.3H，J＝8.2H z，H-1β)，δ3.35-δ3.86(m，8H，H-2，H-3，H-4，H-5，H-6，H-6，C3’-C H₂)，δ2.40(s，3H，C4’-CH₃)

ESI-MS：calcd for C₁₈H₂₀F₂NO₉[M+H]⁺432.10，found 432.1

激发极大波长：365nm

荧光极大波长：458nm

其他的MBDG和MBLG的合成

在1位、3位、4位或6位具有Marina Blue的其他的MBDG和 MBLG，能够与PBDG和PBLG同样地合成。

2-MBDM(2-脱氧-2-(2-(6,8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素-3-基)乙酰胺)-D-甘露糖)的合成

与2-MBDG的合成方法同样，代替用于2-MBDG的合成的D-葡糖 胺盐酸盐而使用D-甘露糖胺盐酸盐，能够合成2-MBDM。

2-MBLM(2-脱氧-2-(2-(6,8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素-3-基)乙酰胺)-L-甘露糖)的合成

与2-MBLG的合成方法同样，代替用于2-MBLG的合成的L-葡糖 胺盐酸盐而使用L-甘露糖胺盐酸盐，能够合成2-MBLM。

比较例1：比较化合物的合成

2-HCDG(2-脱氧-2-((7-羟基香豆素-3-基)甲酰胺)-D-葡萄糖)的合成

下述式表示的2-HCDG按照以下方式合成。

将D-葡糖胺盐酸盐(11.9mg)溶解于水(2mL)，冰冷。向其添 加三乙胺(9.2μL)，接下来添加7-羟基香豆素-3-羧酸N-琥珀酰亚胺酯 (20mg)/二甲基甲酰胺(2mL)，室温下搅拌3小时。添加1％醋酸 水溶液(4mL)静置一夜。通过膜过滤器，用1％醋酸水溶液清洗。合 并滤液和清洗液，用HPLC精制。收集目标馏分，冷冻干燥。

收量：10.6mg、收率：44％

¹H-NMR(400MHz、重水、ppm)：

δ8.58(s x 2，1H，Ar)，δ7.53-δ7.56(m，1H，Ar)，δ6.79(m，1H，Ar) ，δ6.67(m，1H，Ar)，δ5.24(d，0.7H，J＝3.7Hz，H-1α)，δ4.84(d，0 .3H，J＝8.2Hz，H-1β)，δ3.41-δ4.06(m，6H，H-2，H-3，H-4，H-5，H-6， H-6).

ESI-MS：calcd for C₁₆H₁₈NO₉[M+H]⁺368.10，found 368.1

激发极大波长：402nm

荧光极大波长：447nm

2-MCDG(2-脱氧-2-(2-(7-甲氧基香豆素-4-基)乙酰胺)-D-葡萄糖)的合成

下述式表示的2-MCDG按照以下方式合成。

将D-葡糖胺盐酸盐(216mg)溶解于水(1mL)，添加二甲基甲酰 胺(9mL)。向其添加MocAc-OH(234mg)和HOBt(135mg)，冰冷。 向其添加WSCD(187μL)。在0℃搅拌1小时。追加WSCD(33.9μL)， 进一步搅拌2小时之后，减压浓缩中性的反应液，向得到的残渣添加水， 冷冻干燥。用HPLC精制残渣。收集目标馏分，冷冻干燥。

收量：69.6mg、收率：18％

¹H-NMR(400MHz、氘代甲醇、ppm)：

δ7.66(m，1H，Ar)，δ6.85(m，2H，Ar)，δ6.23(s x 2，1H，Ar)，δ5.03 (d，0.6H，J＝3.2Hz，H-1α)，δ4.54(d，0.4H，J＝7.3Hz，H-1β)，δ3.2 6-δ3.81(m，9H，H-2，H-3，H-4，H-5，H-6，H-6，OMe).

ESI-MS：calcd for C₁₈H₂₂NO₉[M+H]⁺396.13，found 396.1

激发极大波长：325nm

荧光极大波长：392nm

实施例2：2-PBDG对急性分离神经正常细胞的应用

按照WO2010/16587记载的方法进行。结果由图1示出。

从小鼠中脑的黑质网状部急性分离活神经细胞之后，在37度向其 给予含有2-PBDG 100μM、2-TRLG20μM的混合液5分钟。将就在此 之前的共焦点显微镜图像示于图1A～C。A是蓝色波长区域的荧光图像 (Blue channel、波长范围415-580nm)。通过自身荧光可知细胞位置。 荧光信号强度进行伪彩色表示。B是红色波长区域的荧光图像(Red  channel、580-740nm)。A和B是如下取得的：均以60％的强度使用 405nm Blue diode laser同时激发，分别使用光电倍增器(PMT)1和2， 与PMT1相比提高PMT2的灵敏度以能够灵敏地检测2-TRLG侵入的 有无。C是将明视野图像(Bright field image)重叠于A、B的荧光图 像的图。

荧光混合液给予结束，开始进行给予液的冲洗，4分钟后的影像由 图1D～F示出。图像取得条件与A～C是同样的。D的Blue channel 中，与给予前(A)比较，能够确认核以外的细胞内荧光强度增加的情 形。中央部暗的部分表示细胞核。与此相对，由E可以看出Red channel 的荧光强度没有增加(绿色点是以伪彩色表示在细胞表面被确认为暂时 的荧光信号的点)。2-TRLG是分子内具有比较大型的荧光基团的红色 荧光L-葡萄糖衍生物，2-TRLG不侵入细胞内表示在Blue channel看到 的荧光强度的增加不是由允许2-TRLG通过的细胞膜破裂所产生的。

分别将冲洗开始后8分钟后、20分钟后的影像示于图1G～I和图 1J～L。能够确认一旦被摄入细胞内的2-PBDG不容易衰减的情形。

实施例3：2-PBLG对急性分离神经正常细胞的应用

与实施例2同样地进行实验。结果由图2示出。

急性分离小鼠中脑黑质网状部神经细胞，在37度给予含有2-PBLG 100μM、2-TRLG20μM的混合液5分钟，给予之前的共焦点显微镜图 像由图2A～C示出。

荧光混合液给予结束，开始给予液的冲洗，4分钟后的影像由图 2D～F示出。图像取得条件与A～C是同样的。由D的Blue channel 可以看出，与给予前(A)比较，细胞内荧光强度基本没有增加。E的 Red channel的荧光强度也基本没有增加，没有发现允许2-TRLG侵入 的细胞膜破裂。图2G～I和图2J～L是分别冲洗开始后8分钟后、20 分钟后的影像。D中略微在细胞内发现的荧光强度的增加在冲洗开始后 20分钟的J中恢复到自身荧光水平。因此，与给予D型葡萄糖衍生物 2-PBDG的结果(图1)比较，可知L型葡萄糖衍生物2-PBLG基本没 有摄入细胞内。

比较例1：2-HCDG在急性分离的正常神经细胞中的应用

与实施例2同样地进行实验。结果由图3示出。

对从小鼠中脑黑质网状部急性分离的神经细胞在37℃给予含有 2-HCDG100μM、2-TRLG20μM的混合液3分钟，给予前后的共焦点显 微镜图像由图3示出。A、B分别是在Blue channel(415-580nm)和 Red channel(580-740nm)取得的给予前荧光图像。激发波长是405 nm。C是微分干涉(Differential Interference contrast,DIC)图像。D 是以上重叠的图像。E～H与A～D是同样的，但是是在37℃给予 2-HCDG+2-TRLG荧光示踪剂液3分钟后，开始荧光示踪剂的冲洗， 从冲洗开始4分钟后取得的图像。由E、F可以看出，对细胞的碎片 (debris)给予后，蓝色的荧光强度增加，与此相对，神经细胞的某一 位置中给予前后完全没有检测到荧光强度的增加。此外由于2-TRLG没 有侵入细胞内，因此，认为神经细胞的细胞膜保持健全。

比较例2：2-MCDG在急性分离的正常神经细胞中的应用

对从小鼠中脑黑质网状部急性分离的神经细胞与比较例1同样地给 予含有2-MCDG100μM、2-TRLG20μM的混合液，但给予前后没有发 现神经细胞中的荧光强度的增加。

应予说明，本实验中，由于最佳激发波长是320nm，非常低，因此 使用Nikon Ti-E实时去卷积显微镜，由氙气灯介由激发过滤器320nm (半宽值40nm)、荧光过滤器435nm(半宽值40nm)、分光镜409nm 的构成的特性过滤器，利用Q-imaging公司Retiga-2000R CCD照相机 取得图像。

实施例4：2-PBDG(100μM)和2-PBLG(100μM)对小鼠胰岛瘤 细胞(MIN6)的摄入和葡萄糖转运抑制剂根皮素的影响

(实验方法)

(1-1)细胞培养

冷冻保存的MIN6细胞(由大阪大学宫崎纯一教授提供，5-8次传 代的细胞)按照常规方法转移培养，将7-9次传代的细胞供于实验。

(1-2)用于MIN6细胞培养的培养液的组成

将含有高葡萄糖的Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM-HG)(SIGMA#D5648)13.4g、NaHCO₃(Wako,No.191-01305) 3.4g、2-巯基乙醇(Wako,No.135-14352)5μL溶解于1L的超纯水(Mili  Q)，在37℃的CO₂培养箱中，调整pH至pH7.3-7.35。添加Hyclone Fetal  Bovine Serum(Cat#SH30070.03)其终浓度为10％，此外添加青霉素 -链霉素(Gibco#15140)其终浓度为0.5％。

(1-3)KRB溶液

测量中使用下述组成的KRB溶液。

NaCl 129.0mM,KCl 4.75mM,KH₂PO₄1.19mM,MgSO₄·7H₂O 1.19mM,CaCl₂·2H₂O 1.0mM,NaHCO₃5.02mM,D-Glucose 5.6mM, HEPES 10mM(通过1M NaOH调整为pH7.35)。应予说明，以抑制 经由gap junction/hemichannel的荧光标记葡萄糖的出入作为目的，添 加0.1mM Carbenoxolone(SIGMA#C4790)。应予说明，该KRB溶液 作为用于制作2-PBLG溶液的溶液使用。

(2)2-PBLG溶液和其他荧光糖衍生物溶液的制备

2-PBLG溶液的制备

使用总计30μL二甲基亚砜(DMSO)回收0.5mg 2-PBLG小瓶全 量，按照Yamada K.et al.,Nat.Protoc.2,753-762,2007的方法添加到 3.1mL的KRB溶液中，溶解。

2-PBDG溶液的制备

代替2-PBDG使用2-PBLG，同样进行。

PB-NH₂溶液的制备

通过将0.3mg PB-NH₂小瓶一支全量同样溶解于3.1mL的KRB溶 液，得到终浓度200μM的PB-NH₂溶液。

2-NBDLG溶液的制备

通过将0.5mg 2-NBDLG小瓶一支全量溶解于KRB溶液7.3mL， 得到终浓度200μM的2-NBDLG溶液。

2-PBDM溶液的制备

通过将0.5mg 2-PBDM小瓶一支全量按照2-PBLG溶液的调整溶 解于3.1mL的KRB溶液，得到终浓度100μM的2-PBDM溶液。

(3)荧光测量

2-PBDG和2-PBLG使用8连移液器，分别给予到第3列和第5列 的孔。给予前，首先使用荧光酶标仪(Flex Station,Molecular Device 公司)测量各孔的自身荧光。测定条件是以Bottom Read，Ex 401nm,Em 453nm,Cut off 420nm,Averaging 3、光电倍增器灵敏度high来进行。 测定方法中，使用Well Scan Mode。Well Scan Mode是将一个孔中分 割为9个观察区域(直径1.5mm)，分别独立进行测量。

接下来，在测量葡萄糖转运抑制剂根皮素的效果的孔(3C,3E,3G) 中，从2-PBDG给予5分前，前给予根皮素(final 150μM)，在其他孔 (3B,3D,3F)添加KRB。对预定给予2-PBLG的第5列也进行同样的 操作。2-PBDG和2-PBLG的给予在37℃进行10分钟。

给予结束后，使用300μL的KRB溶液，每30秒重复稀释孔中的 荧光溶液的操作至确定次数。重复次数，将作为对照组设定的A行和H 行的孔显示的荧光强度与没有细胞的空白的孔的荧光强度为相同水平 作为基准进行确定，每次实验中确认完全被冲洗。2-PBDG和2-PBLG 时，由于这一冲洗过程需要8分钟，所以给予后的荧光测量在9分钟后 实施。

应予说明，根据这一方法，带来细胞膜状态破裂的细胞与2-PBDG 和2-PBLG接触后，即使这些化合物暂时摄入细胞内，也由于在测量时 已经流出至细胞外被清洗，所以判断对于观察区域整体的荧光强度的增 加的贡献是能够忽视的程度。这一事实，通过在其他药理学的抑制实验 中在抑制剂存在下荧光强度的增加基本消失可得到证明。上述方法，在 给予其他抑制剂例如细胞松弛素B(10μM)时也同样地实施。

结果由图4示出。

(实验结果)

将香豆素衍生物Pacific Blue与D-葡糖胺键合而得的2-PBDG、以 及与L-葡糖胺键合而得的2-PBLG均以100μM的浓度对培养开始后第 10日的多个MIN6小鼠胰岛瘤细胞给予，结果由图4示出。葡萄糖转运 抑制剂根皮素(PHT)150μM所致的抑制效果也一同示出。图4A是 使用荧光酶标仪测量给予前后的荧光强度的结果。括号内的数字是观察 区域数。给予前的荧光表示细胞的自身荧光。荧光强度在任一情况下均 与给予前相比有意义增加(ANOVA,Bonferroni-Dunn post hoc test)。 激发和荧光波长分别为401nm和453nm。图4B表示A的给予前后的 荧光强度的差。根皮素不存在下给予2-PBDG时的荧光强度的变化作为 100％表示。2-PBDG和2-PBLG的荧光强度之间没有发现显著差异。 此外，在根皮素存在下，与不存在相比，2-PBDG、2-PBLG任一的情 况下均发现荧光强度的降低，但荧光的大部分没有被根皮素抑制。独立 实施的二次实验中均得到同样的结果，2-PBDG、2-PBLG的由根皮素 所致的减少部分分别为平均22.4％和20.0％。

实施例5：2-PBDG、2-PBLG和PB-NH₂给予所致的荧光强度的变 化和葡萄糖转运抑制剂所致的效果

与实施例4同样地确认对培养第10日的MIN6细胞给予D-葡萄糖 衍生物(2-PBDG)、L-葡萄糖衍生物(2-PBLG)、和将Pacific Blue(PB) 发色团酰胺化的PB-NH₂所引起的荧光强度的变化和葡萄糖转运抑制剂 所致的效果。PB-NH₂是以下结构(Ex max.402nm,Em max.451nm)。 结果由图5示出。

(实验结果)

由图5A可知，对于2-PBDG(100μM)给予所致的荧光强度的增 加，GLUT选择性抑制剂细胞松弛素B(CB,10μM)未显示出有意义 的抑制效果。本例中，虽然平均荧光强度在CB存在下比不存在下减弱， 但独立实施3次的结果中也发现有增加的，并不稳定。图5B表示对于 2-PBLG(100μM)或者PB-NH₂(100μM)给予所致的荧光强度的增加 的葡萄糖转运抑制剂根皮素(PHT,150μM)的效果。根皮素与图4同样 略微抑制2-PBLG所致的荧光强度的增加，但是反而会显著促进 PB-NH₂所致的荧光强度的增加。需要注意B的纵轴的单位与A、C不 同。2-PBLG和PB-NH₂的给予实验在同一培养板上同时实施，独立实 施3次的实验中均确认根皮素对于PB-NH₂应答所引起的显著的增强效 果，荧光增加，在仅给予PB-NH₂时平均达到384.1±24.2％(n＝3)。此 外，不具有糖骨架的PB-NH₂，与具有糖骨架的L-葡萄糖衍生物2-PBLG 相比具有有意义大的荧光强度的增加。

实施例6：2-PBDM(100μM)对小鼠胰岛瘤细胞(MIN6)的给予、 以及葡萄糖转运抑制剂根皮素的影响

与实施例4同样地进行实验。结果由图6示出。

对培养第10日(10DIV)的MIN6细胞(20000cells/well)，给予 2-PBDM(100μM)，使用FlexStation测量根皮素(150μM,PHT)对于 给予前后荧光强度的增加所带来的抑制效果，结果确认2-PBDM受到根 皮素虽然略微但有意义的抑制效果。独立实施3次实验，均得到同样的 结果。2-PBDM给予实验中在极大激发光波长404nm激发，在极大荧 光波长453nm取得荧光。

实施例7：由小鼠胰岛瘤细胞(MIN6)构成的肿瘤细胞块的使用了 2-PBDG或者2-PBLG的成像(2-PBDG/2-TRLG或者2-PBLG/2-TRLG 或者2-PBLG/2-NBDLG/2-TRLG的使用)

(实验方法)

(1)小鼠胰岛瘤细胞(MIN6)的制备

将以10×10⁴cells/mL的比例悬浮有MIN6细胞的培养液滴加到盖 玻片上10μL之后，使其附着于玻璃面，添加培养液3mL培养。每3 日一次交换半量的培养液。

(1-1)MIN6细胞的培养

将冷冻保存的MIN6细胞(由大阪大学宫崎纯一教授提供，传代5-8 次的细胞)按照常规方法转移培养，将传代7-9次的细胞供于实验。每 2日一次交换半量的培养液。

(1-2)用于MIN6细胞培养的培养液的组成

将含有高葡萄糖的Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM-HG)(SIGMA#D5648)13.4g、NaHCO₃(Wako, No.191-01305)3.4g、2-巯基乙醇(Wako,No.135-14352)5μL溶解于 1L超纯水(Mili Q)，在37℃的CO₂培养箱中，调整pH至pH 7.3-7.35。 添加Hyclone Fetal Bovine Serum(Cat#SH30070.03)其终浓度为10％， 此外，添加青霉素-链霉素(Gibco#15140)其终浓度为0.5％。

(1-3)以10×10⁴cells/mL的比例悬浮有MIN6细胞的培养液

使用培养液使MIN6细胞以细胞数为10×10⁴cells/mL而制备。

(2)2-PBLG溶液以及与其他荧光糖衍生物的混合液的制备

2-PBLG溶液的制备

使用总计30μL二甲基亚砜(DMSO)回收0.5mg 2-PBLG小瓶全 量，通过按照Yamada K.et al.,Nat.Protoc.2,753-762,2007的方法添 加到6.25mL图像取得用HEPES溶液而溶解。

2-PBDG溶液的制备

代替2-PBDG使用2-PBLG，同样进行。

2-NBDLG溶液的制备

通过将0.5mg 2-NBDLG小瓶一支全量溶解于图像取得用HEPES 溶液14.6mL，得到终浓度100μM的2-NBDLG溶液。

2-TRLG溶液的制备

使用总计100μL的DMSO回收0.2mg 2-TRLG小瓶全量。通过添 加到6.5mL的KRB溶液而溶解。

2-PBLG+2-TRLG混合溶液的制备

上述的2-PBLG溶液以及2-TRLG溶液以1:1混合，制作目标荧光 衍生物混合液。

(2-1)图像取得用HEPES溶液

使用与FlexStation实验中使用的KRB溶液相同的下述组成的溶 液。

NaCl 129.0mM,KCl 4.75mM,KH₂PO₄1.19mM,MgSO₄·7H₂O1.19 mM,CaCl₂·2H₂O 1.0mM,NaHCO₃5.02mM,D-Glucose 5.6mM,HEPES 10mM(通过1M NaOH调整至pH7.35)。应予说明，以抑制经由gap  junction/hemichannel的荧光标记葡萄糖的出入为目的，添加0.1mM  Carbenoxolone(SIGMA#C4790)。应予说明，本图像取得用HEPES 溶液，可以作为用于制作2-PBLG溶液的溶液，此外可以作为制作 2-PBLG/2-TRLG溶液和2-PBLG/2-NBDLG/2-TRLG溶液的溶液使用。

(3)DAPI溶液对MIN6细胞的给予

将使MIN6细胞附着培养10-13日的盖玻片，转移至35mm培养皿 中装满的含有D-葡萄糖5.6mM的DAPI溶液中，在37℃边加温边静置 45分～1小时，使细胞摄入DAPI。在其他实验中，一边在共焦点显微 镜上连续观察，一边进行给予DAPI的实验，在实验时间内，确认没有 发现DAPI给予和405nm的激光照射所致的细胞的形态变化。

DAPI溶液的制备：将4',6-Diamidino-2-phenylindole DAPI(No. 049-18801,Wako Pure Chemical Industries,Osaka)在图像取得用 HEPES溶液中以终浓度1μg/mL的比例溶解使用。

(4)培养MIN6细胞的盖玻片的在荧光测量用灌流腔室内的使用 金属导板的固定法

在激光扫描共焦点显微镜(Leica公司TCS SP5)上的万能转台 (Leica 11600234)上所设置的灌流腔室内的图像取得用HEPES溶液 中，转移培养MIN6细胞的盖玻片，在腔室底部的玻璃面上轻轻密合。 静置后，从左右与盖玻片的长轴方向平行地使用2枚长方形金属导板(长 10mm、宽2mm、厚0.7mm、银制)夹住盖玻片两侧，通过慎重按压， 使在液流中盖玻片保持不动。此外在由这2枚金属导板夹持的空间内， 灌流液变为层流顺利地流动，具有能够快速液体交换的优异的效果。

(4-1)激光扫描共焦点显微镜载物台上的荧光测定用灌流腔室

在底部挖出物镜用圆孔(直径18mm)的铝制加温控制平台(PH1、 Warner Instruments,USA、利用温度控制装置TC-324加温至37℃, Warner Instruments)上，使用硅润滑油(HIVAC-G,Shin-Etsu Silicone, Tokyo)，使盖玻片(宽24mm×长50mm、厚No.1,Warner Instruments  No.CS-24/50)与平台中央的圆孔以外的部分密合。接下来，在盖玻片 上载置在中央实施流线型挖孔加工(将与玻璃底面接触侧加工为宽 10mm×长35mm、曲率半径33mm，将不与玻璃面接触侧即上方加工 为略宽)的厚度1mm的硅板(幅20mm×长50mm)，不使用硅润滑油 与盖玻片密合。

在硅板上的流线型孔的上流角，设置前端削平的粗细为20规格(ゲ ージ)的卡特兰针(カテラン針)，作为入口使用。

灌流液的排出用不锈钢管(出口)使用按照非专利文献16记载的 方法将前端部削平并切割为斜面的针，抽真空时，通过同时吸引空气和 溶液二者作为使其稳定的方式。

(5)对灌流腔室的灌流液供给系统

(a)灌流液的加温和对灌流腔室的供给

灌流液供给系统具有对照溶液用60mL注射筒一支和药剂供给用 10mL注射筒5支，可用电磁阀随时切换而灌流。本发明涉及的实验中， 使用60mL注射筒将5.6mM含葡萄糖图像取得用HEPES溶液，使用5 系统具有的10mL注射筒中一支给予2-PBLG/2-NBDLG/2-TRLG混合 溶液或者2-PBDG/2-TRLG混合溶液、或者2-PBLG/2-TRLG混合溶液。 如以下所述，为了二者在灌流腔室内不产生气泡，预先加温，而且在导 入灌流腔室之前，合并为一支管，用流量调节器进行速度调节，再次用 在线加热器加温，供给给共焦点显微镜上的灌流腔室。

图像取得用HEPES溶液，从在铝制针筒加热器(Model SW-61,温 度控制单元是No.TC-324B,Warner Instruments)中被加热的60mL 注射筒，与用于将溶液供给线的管内冲刷的3方活栓连接，接下来介由 细的气体透过性低的软管(Pharmed管,AY242409,Saint-Gobain  Performance Plastics,Ohio)，与超小型电磁阀(EXAK-3,3way clean  valve,Takasago Electric,Nagoya)的normally open侧连接。电磁阀的 开闭用脉冲产生装置(Master 8,AMPI公司,Israel)控制。对于图像取 得用HEPES溶液，使用蠕动泵(MCP泵12rollers、Ismatec)，从媒 介瓶向60mL注射筒内持续供给，以实验中注射筒内的溶液上表面的高 度不变化的方式与溶液落下速度相等地精密调整泵的溶液供给速度。由 于蠕动泵的溶液供给速度由数字表示，所以如果对灌流腔室的溶液供给 速度在实验中有变化则立刻通过溶液面的高度变化而知道。因此，为了 本溶液时常更新，用于液温维持的针筒加热器SW-61设定在38.5℃。

另一方面，2-PBLG和2-TRLG混合溶液或者 2-PBLG/2-NBDLG/2-TRLG混合溶液等由设置于针筒加热器(Model  SW-6,温度控制单元是No.TC-324,Warner Instruments)并被加温至 37.5℃的10mL注射筒供给。本注射筒介由三通活塞，与区别于图像取 得用HEPES溶液的另一电磁阀的normally closed侧连接，通过脉冲产 生装置的控制与对照溶液随时切换地供给。针筒加热器SW-6中能够设 置6支10mL注射筒，1支中加入蒸馏水，插入加温模块的温度监测用 探针。

对照溶液的图像取得用HEPES溶液和2-PBLG与2-TRLG混合溶 液或者2-PBLG/2-NBDLG/2-TRLG混合溶液等，从电磁阀的出口流出 后，通过6接口的小型歧管(MPP-6,Warner Instruments)集中于1 支。MPP-6歧管的出口与短的Pharmed管连接，将该管夹于通过螺杆 能够增减开度的流量调节器，通过开度的调整，将流量调整为1.2±0.2 mL/分。该Pharmed管以最短距离与在线加热器(Multi-Line In-Line  Solution Heater SHM-8、温度控制单元是TC-324B、Warner  Instruments)连接。这是为了将导入灌流腔室的溶液温度在即将导入之 前进行加温。SHM-8在线加热器的温度，按照灌流速度，以腔室中灌 流液的实测温度在盖玻片的存在区域为36-37℃的方式调整。加温的溶 液介由短的Tygon管(R-3603,inner diameter 1/32inch)以最短距离与 配置于灌流腔室上流的不锈钢管(入口)连接，供给于灌流腔室内。

由于来自注射筒的溶液供给是使用静水压确定供给压力，因此为了 高度的差异不会带来灌流速度的差异而产生腔室内的水面高度的变化， 对于2-PBLG与2-TRLG混合溶液或者2-PBLG/2-NBDLG/2-TRLG混 合溶液等，由于给予时间短，在一次实验中不进行实验中液体供给，每 当各实验结束时，以液体上表面与不含有荧光葡萄糖的HEPES溶液基 本相同的高度的方式追加溶液。此外，通过调整与注射筒连接的管的长 度和粗细度，以与作为对照溶液的图像取得用HEPES溶液的灌流速度 相同的速度排出方式慎重调整，由此能够避免液体交换所致的液面的变 动。此外，实验结束后和开始前，在管内部充分冲刷而确保通畅的水流。

(b)灌流腔室内层流的确保以及灌流液的除去

将灌流液排出用不锈钢管(出口)介由Tygon管依次导入二个大型 玻璃阱，使用真空泵(DAP-15,ULVAC KIKO,Inc)缓慢吸引。吸引压 用设置于在二个大型玻璃阱的中间从吸引线路分支出的管线的压力计 监测，通过三通活塞的开闭度的控制，以成为35kPa的方式调整。

灌流腔室内层流的确保，首先将蓝色色素(Pontamine sky blue,稀 释为1％以下的浓度使用)溶液在入口付近滴加，确保液流的左右对称 性、均一性和再现性。

腔室内灌流溶液中各部分的温度的确认，使用极细热敏电阻探头 (Physitemp公司IT-23)(非专利文献16)。此外为了防止出口前端部 在实验中附着来源于HEPES溶液的盐而引起的吸引压力的变化，用设 置于腔室上的操作显微镜(POM-50II,KONAN MEDICAL,西宫)在 每次实验中确认，进行清理。

(6)图像取得条件

以通常模式使用激光扫描共焦点显微镜(Leica制TCS-SP5系统、 显微镜本身是DMI6000CS trino电动倒立显微镜)。使用激光，使用405 nm二极管激光器，2-PBLG或2-PBDG的激发、2-PBLG(或者2-PBDG) 与2-TRLG的混合溶液以单一光源激发时，此外，在利用DAPI的核的 活体染色中使用。为了通过音响光学偏光元件(Acoustic Optical  Tunable Filter,AOTF)能够得到充分的观察强度，照射强度按照使用荧 光色素进行适当调节。此外2-NBDLG和2-TRLG用488nm Argon laser 激发。扫描速度使用200Hz或者400Hz。

荧光检测，利用2-PBDG或者2-PBLG的蓝色荧光的检测用光电倍 增器检测器(PMT)1进行2-PBLG/2-TRLG的二色检测时，在 415-580nm的波长检测范围内，进行2-PBLG/2-NBDLG/2-TRLG三色 检测时，设定415-500nm的波长检测范围，取得图像。2-NBDLG的绿 色荧光检测用PMT2(命名为绿色通道，以下相同)在500-580nm的波 长检测范围使用。此外，2-TRLG的红色荧光的检测用PMT3(命名为 红色通道，以下相同)在580-740nm的波长检测范围使用。以上的蓝、 绿、和红等荧光检测波长区域的选择，不是靠通常使用的Emission过 滤器方式，而是通过棱镜分光与缝隙组合的方式(Leica,TCS-SP5的标 准)取得。使用488nm氩激光时的分光镜使用500nm(RSP500)。405nm 用的分光镜在SP5系统中，与上述独立地成为415nm的固定式。 2-PBLG/2-NBDLG/2-TRLG三色检测实验中，荧光激发时，最初图像 取得488nm激发的2-NBDLG(绿色)和2-TRLG(红色)，通过Sequential  mode，在此之后立刻通过405nm激发取得2-PBDLG(蓝色)的图像。 2-PBLG/2-TRLG的二色检测时，通过405nm二极管激光器的单一激发， 为了能够高效地检测2-TRLG侵入细胞内而通过将红色波长区域的检 测灵敏度设定为比蓝色波长的检测灵敏度高(蓝色617V、红色738V 等)，从而同时取得2-PBLG(蓝色)和2-TRLG(红色)的图像。

为了获得立体的肿瘤细胞块的结构性特征而使用的微分干涉 (DIC)图像的取得，在488nm(或者405nm)激发时，同时使用透射 光用检测器PMT Trans检测(典型的检测灵敏度是145-200V)。为了 回避微分干涉方式(DIC)的图像取得所需要的偏光镜、分析仪进入光 路的切换时间、切换冲击的问题，在通过405nm激发的图像取得时， 也保持DIC用偏光镜和分析仪进入光路的状态。

本方法中，为了谋求对xy轴的高的分辨率和将细胞块的整体包含 于视野内的视角，物镜以光圈开放使用高分辨率的x40oil透镜(HCX PL  APO CS 40.0x1.25OIL UV,NA1.25)。为了实现取得荧光强度，将 Pinhole尺寸设置为3airy unit。即使该pinhole size在z轴方向也能够 实用地区分细胞内的核和细胞质，可在取得图像中确认。变焦基本不使 用(1倍)，在1024×1024或者512×512的分辨率下，在12bit的深度 取得图像。

应予说明，以上的溶液的给予和全部的图像取得是在24小时保持 一定室温(24℃)的暗室内进行。

结果由图7～图17示出。

(实验结果)

图7中，培养下显示三维发达的癌细胞块(球状体、培养第15日 的MIN6细胞)中，能够确认发生凋亡的细胞、发生坏死的细胞、以及 具有以DAPI强染色的细胞核的细胞的空间配置。图7A，在达到呈现 一定程度以上的直径(约100微米以上)和体积(约50微米以上)的 球状体的中心部，存在拥有异常强地结合发出蓝色荧光的 4’,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)的核的细胞。DAPI不使用福尔 马林固定地直接适用于活细胞。图7B，利用活凋亡标记物pSIVA-IANBD (IMGENEX,San Diego,USA)，发生凋亡的细胞以绿色荧光可视化。 阳性细胞点存在于球状体周围部等。图7C，红色荧光表示作为坏死 (Necrosis)标记物的通常的propidium iodide(PI)侵入细胞内的细胞。 可知球状体中央部附近比较集中。图7D表示微分干涉显微镜图像。图 7E表示以上的重叠图像。图像取得按照2-PBLG/2-NBDLG/2-TRLG三 色检测的方法实施。

图8表示多个MIN6细胞集合的细胞块(培养开始第13日)的显 微镜照片。图8是由2-NBDLG、2-TRLG、2-PBLG构成的荧光标记葡 萄糖衍生物混合液给予前。图8A和图8B是用488nm氩激光激发，在 分别2-NBDLG、2-TRLG的观察中最佳的500-580nm(绿色)、580-740 nm(红色)的各波长域中同时取得的荧光图像。图8C是与A、B同时 取得的微分干涉(Differential Interference Contrast,DIC)显微镜像。 图8D是，ABC的扫描之后连续地用405nm二极管激光器激发得到的 415-580nm(蓝色)的波长区域的荧光取得图像。图8E是以上的重叠 像。与C比较时，可知若干自身荧光的图案。

图9～图12表示由小鼠胰岛瘤细胞(MIN6)构成的肿瘤细胞块的 使用2-PBLG的成像结果。使用由100μM的2-PBLG、100μM的 2-NBDLG和20μM的2-TRLG构成的混合溶液，利用实时激光扫描共 焦点显微镜取得图像。

图9是给予由100μM的2-PBDLG、100μM的2-NBDLG和20μM 的2-TRLG构成的混合溶液中的MIN6细胞块的绿(A)、红(B)、蓝 (D)的荧光取得图像、微分干涉显微镜像(C)、以及以上的重叠图像 (E)。由于细胞块中心部的多个细胞的细胞膜透过性亢进，发现给予中 任意的荧光标记葡萄糖衍生物均存在强摄入的趋势。应予说明，将红绿 蓝三色重叠时呈现白色。图像是在经过数秒同时取得A,B,C的图像之 后，连续地图像取得D，因此在D图像取得时间点，灌流液侵入更深的 细胞块内部。

图10与图9同样但是2-NBDLG、2-TRLG、2-PBLG的混合液给 予结束后经过2分钟的时间点的图像。癌细胞块中心部的荧光强度与其 周围部相比，发现整体强的趋势(A,B,D,E)。观察利用细胞膜不透过 性的2-TRLG荧光图像，则不仅细胞块中心部，在细胞块周围部也发现 细胞膜状态恶化的细胞存在(B)。在混合液给予结束后2分钟的时间点， 这样的细胞中，2-NBDLG、2-PBLG暂时侵入细胞内，由于尚未流出至 细胞外，因此发现分别发出绿色、蓝色荧光的细胞。这些细胞的大多数， 在混合液给予结束后数分钟失去来源于2-NBDLG(绿)、2-PBLG(蓝) 的强的荧光(参照图11)。

图11是混合液给予结束后经过8分钟的时间点的图像。A和D中， 没有发现癌细胞块中心部的荧光强度比其周围部特别强的趋势。但是， 关于箭头表示的细胞，继续维持2-PBLG的强的蓝色荧光。该细胞即使 对于2-NBDLG的荧光强度，也显示比周围细胞强的趋势，但仅以 2-NBDLG的荧光图像来确定该细胞是困难的(A)。2-TRLG具有一旦 摄入没有完全死但是细胞膜透过性亢进的细胞则不容易流出细胞外的 性质，发出强的荧光。因此，即使给予结束后经过8分钟，也能够将在 癌细胞块中心部低氧、低营养区域主要存在的细胞识别可视化(B)。应 当注意箭头表示的显示2-PBLG的强的蓝色荧光的细胞的红色荧光非 常弱(B,E)。

图12是混合液给予结束后经过12分钟的时刻的图像。仅箭头表示 的细胞继续发出2-PBLG的蓝色荧光，与其他细胞识别开来，提示 2-PBLG与该细胞强结合(B,E)。图13是放大图11表示的癌细胞块中 心部附近的图像。箭头的细胞通过2-PBLG被强可视化。箭头是2-PBLG 强阳性细胞。该细胞的2-NBDLG的绿色荧光也是强的(A)，但是仅用 2-NBDLG识别该细胞是困难的。

实施例8：使用2-PBLG对由小鼠胰岛瘤细胞(MIN6)构成的肿瘤 细胞块的成像(使用2-PBLG/2-TRLG)

与实施例7同样，代替2-PBLG/2-NBDLG/2-TRLG的混合溶液， 使用2-PBLG/2-TRLG的混合溶液。

图14是培养第13日的MIN6细胞块的荧光标记葡萄糖衍生物给 予前的图像。A、B分别是580-740nm(红色)和415-580nm(蓝色) 的波长区域的荧光取得图像。C是微分干涉显微镜像。D是这些的重叠 图像。

图15是对MIN6细胞块给予含有20μM的2-TRLG和100μM的 2-PBLG的荧光混合液5分钟之后，开始冲洗在经过2分钟的时间点的 影像。由A可以看出，细胞膜不透过性的2-TRLG，主要是在细胞块中 心部侵入细胞膜透过性亢进的细胞的内部。此外，在该时间点，细胞块 外缘、细胞块外存在的细胞组织的碎片(Debris)的一部分也被染色。 由B可以看出，2-PBLG也一度侵入细胞膜透过性亢进的细胞内。但是， 可知在该时间点2-PBLG已经开始从该细胞内流出，在细胞块中心部荧 光强度开始减弱的情形。其中，需要注意的是几个细胞的蓝色荧光异常 强。其中像实施例7这样，给予2-PBLG和2-TRLG时，与2-NBDLG 同时给予的情况中，用488nm的氩激光进行2-NBDLG以及2-TRLG 的激发后，用405nm二极管激光器进行2-PBLG的激发。此时，由于 2-PBLG的荧光极大与2-NBDLG的激发波长重叠，所以随着局部浓度， 由FRET效果引起2-PBLG的荧光信号减弱。此外，由488nm激发的 2-TRLG的580-740nm的荧光强度分布中，混入在2-NBDLG 580nm以 上的区域中(长波长侧的区域)的荧光强度增加所致的部分。另一方面， 使用2-PBLG/2-TRLG的混合溶液时，由于能够避免这些FRET效果和 长波长侧的区域引起的影响，因此，能够分离荧光强度的增加，对于定 量化是有利的。

图16与图15是同样的，但是是给予结束，开始冲洗后8分钟后的 图像。红色2-TRLG和蓝色2-PBLG的分布图案大不相同(A,B,D)， 很难用细胞膜透过性的增大说明2-PBLG强阳性细胞的分布。蓝色 2-PBLG阳性细胞在细胞块中心部的外缘等点存在(B,D)。在给予结束 后经过2分钟的时间点，细胞外缘等看见的红色荧光因冲洗而减弱。

图17与图16是同样的，但是是给予结束，开始冲洗后12分钟后 的图像。发现多个继续呈现2-PBLG的强阳性信号的细胞(B,D)。

上述详细的记载，仅是说明本发明的目的和对象，不受添加的专利 权利要求的限定。在不脱离添加的专利权利要求，相对于记载的实施方 式的各种变更和置换，根据本说明书记载的教导对于本领域技术人员而 言是显而易见的。

产业上的利用可能性

本发明提供发出蓝色荧光色的新的荧光标记糖衍生物。此外，本发 明提供新的用于进行肿瘤细胞的检测的方法。