一种从茶树鲜叶中萃取、纯化、鉴定花青素的方法

摘要

本发明公开了一种从茶树鲜叶中萃取、纯化、鉴定花青素的方法，其特征在于：包括以下步骤：A.样品破碎；B.浸提；C.浓缩处理；D.过滤处理；E.固相萃取；F.浓缩处理；G.酸解；H.HPLC检测。本发明与现有技术相比的优点是：1、茶叶含有非常高的酚类物质，极易氧化花色素苷。本方法能有效地克服其它酚类物质的干扰，得到高纯度的花色苷。2、该方法从茶树鲜叶中提取花色苷的损失率低，重现性好。3、该方法适用于所有茶树品种的花色苷的定性、定量检测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种茶叶中提取、纯化保健成分的方法，尤其涉 及一种从茶树鲜叶中萃取、纯化、鉴定花青素的方法。

背景技术

茶树为山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)植物，为灌 木或小乔木，茶树芽叶可制茶，茶叶是当今世界三大饮料之一， 茶叶中含有450多种对人体有益的化学成分，主要包括茶多酚、 咖啡碱、茶氨酸、花色苷、维生素等，因此茶叶具有很好的保健 作用，能起到消炎杀菌、降血压、降血脂、抗氧化、抗辐射、抗 癌等良好作用。

花色苷(anthocyanin)，又名花青素，是一类水溶性色素。 正是由于花色苷的广泛存在，高等植物才呈现出五彩缤纷的色彩 世界。花色苷属于黄酮类物质，是由花色素(anthocyanidin) 和糖分子以糖苷键结合而成的一类化合物。目前已经鉴定出天然 花色苷的种类多达几千种，这主要是由于糖苷键的位置和糖取代 基的多样性，以及除糖基化之外的其它修饰造成的，如酰基化、 甲基化等。高等植物由于合成花色苷的组分以及浓度的差异而呈 现粉色、红色、蓝色、紫色、黑色等一系列鲜艳的色彩。

花色苷是重要的天然色素，安全、无毒，广泛用于食品行业。 花色苷还具有多种保健功能。诸多研究表明，花色苷抗氧化性， 降低高血脂大鼠的甘油脂水平，改善高甘油脂脂蛋白的分解代 谢，抑制胆固醇吸收，降低低密度脂蛋白胆固醇含量等。此外， 花色苷具有消炎、降低癌变发生率等功效。因此，花色苷合成的 相关性状直接关系到农、经作物的商品性。由于茶叶是极其重要 的饮料来源，而花色苷又极溶于水，因此喝茶是人体摄入花色苷 的理想方式。目前，含花色苷的茶叶是行业类的一大热点。

花色苷的常用提取方法有：溶剂提取法、超临界萃取法、微 波法、酶解法和超声波提取法。主要的分离纯化方法有：高效逆 流色谱、膜分离技术、凝胶层析法，大孔吸附树脂法。国外许多 学者利用C18柱、反相高效液相色谱(RP-HPLC)、高速逆流色谱 和高效液相色谱纯化花色苷。

花色苷的分子结构可以通过液相色谱-质谱联用技术获得。 但是对实验仪器要求高，成本高昂。另外一种比较实用的方法是 通过酸解分解糖苷键，再通过高效液相色谱(HPLC)的方法鉴定 糖苷配基的类型。虽然自然界存在的花色苷种类繁多，但是糖苷 配基即花色素的类型非常有限。天然的花色素绝大部分属于飞燕 草色素(delphinidin)、矢车菊色素(cyanidin)、天竺葵色素 (pelargonidin)、矮牵牛色素(petunidin)、锦葵色素 (malvidin)、芍药色素(peonidin)六种类型。

茶叶花色苷的提取、纯化、鉴定还没有相关成熟、标准的方 法。一是因为大多数茶树品种只合成少量或者不合成花色苷，如 常见的绿叶、黄叶品种。能大量合成花色苷的茶树品种相当稀少， 仅有国内知名的如“紫鹃”，国外知名的如日本的“Sun Rouge”。 二是茶树鲜叶的花色苷提纯相比其他植物而言更复杂更不易提 纯。到目前为止，茶叶中经分离、鉴定的已知化合物有700多种， 多酚类物质种类多，且含量丰富，包括儿茶素类、黄酮类、黄酮 醇类、花色苷、花白素类、酚酸及缩酚酸等。

山东农业大学王帅等人研究茶叶花色苷的提取纯化：

取紫娟品种茶树鲜叶样品2Kg，放于8L的1％盐酸甲醇溶液 中超声10min，4℃低温下冷浸两小时后收集提取液，重复处理 两次，合并提取液，提取液在30℃下真空旋转蒸发至近干，用 少量水将其溶解，分别用三氯甲烷、乙酸乙酯萃取。水溶液在处 理好的聚酰胺层析柱上梯度洗脱，并利用重结晶及铅盐沉淀技术 得到不同花色苷组分。

山东农业大学范艺凡等人研究茶叶花色苷的提取(食品与发 酵科技，2013，Vol.49，No.6，p38-42)：

取“紫娟”晒青绿茶2g粉碎2min后，加入400mL提取液 (V甲醇∶V水∶V甲酸∶V三氟乙酸＝70∶27∶2∶1)室温浸 提1h，再以5000r/min离心5min，上清液经溶剂微孔过滤膜(准 50mm、0.45μm、有机系)过滤后于50±2℃条件下减压浓缩至 30mL左右后，冷冻干燥至粉末并置于-10℃冰柜保存供色素定性 分析用。

山东农业大学吕海鹏等人研究茶叶花色苷组分的鉴定方法 (食品科学，2012，Vol.33，No.22，p203-206)：

以“紫鹃”烘青绿茶样品为原料，经提取、纯化花青素后， 采用如下条件鉴定花色苷组分：色谱柱，YMC-Pack ODS-AQ C18 (150mm×4.6mm)；流动相，0.5％甲酸溶液(A)和乙腈(B)；柱 温，35℃；流速，0.8mL/min；进样量，10μL；检测波长，520nm； 标准样品为天竺葵素-3，5-二葡萄糖苷(pelargonidin-3， 5-diglucoside chloride)、矢车菊-3-O-半乳糖苷 (cyanidin-3-Ogalactoside)、天竺葵色素(pelargonidin  chloride)、锦葵色素(malvidin chloride)。

山东农业大学王帅等人公开了一种“紫娟”茶提取纯化花 色苷的方法，该方法主要是用三氯乙烷、乙酸乙酯进行萃取，用 聚酰胺层析柱洗脱。范艺凡等(食品与发酵科技，2013，Vol.49， No.6，p38-42)公开了一种“紫娟”花色苷的提取方法。上述方 法提取的花色苷或纯化程度不高或提取过程损失率较大，依据这 些方法提取的花色苷不能用于下游的定性、定量鉴定。

吕海鹏等(食品与发酵科技，2013，Vol.49，No.6，p38-42) 公开了“紫鹃”花色苷组分的方法。第一，该方法仅仅在已经得 知花色苷分子结构的情况下才能实施。由于茶树遗传背景复杂， 目前已知不同茶树品种合成的花色苷类型大不一样。第二，该方 法使用的标准样品购买困难，作为标样的花色苷分子的提纯成本 高昂甚至无法从市场购买。第三，当某一茶树合成多种类型的花 色苷分子时，HPLC的目标物过多，背景过于复杂，可能无法分 离分子结构相近的花色苷。

发明内容

本发明是为了解决上述不足，提供了一种从茶鲜叶中萃取、 纯化、鉴定花青素的方法。

本发明的上述目的通过以下的技术方案来实现：一种从茶鲜 叶中萃取、纯化、鉴定花青素的方法，其特征在于：包括以下步 骤：

A.样品破碎：准确称量采摘新鲜紫色茶树的一芽二叶5g， 加液氮研磨后转至50ml离心管；

B.浸提：加20ml 1％的HCL-MeOH到样品，置于冰箱4箱冷 藏室静止浸提；2h后离心，转速9000r/min，离心时间10min； 吸出上清液移至新的50ml离心管；再加20ml 1％HCL-MeOH到样 品进行二次浸提，2h后离心，转速9000r/min，离心时间10min， 转移上清液；最后再加10ml 1％HCL-MeOH进行第三次浸提，12h 后离心，转移上清液；

C.浓缩处理：利用旋转蒸发仪Rotavapour R-300(Buchi， 瑞士)对获得的浸提液进行浓缩，旋蒸仪旋转速度为4-7，温度 为37°；最后得到体积为25～30ml的浓缩液；

D.过滤处理：将浓缩液经0.45μm有机相针筒式滤膜过滤器 过滤；

E.固相萃取：使用反式固相萃取柱C18 cartridge (Waters，美国)对花色苷进行萃取。萃取流程如下：柱活化， 5ml 0.01％HCL-MeOH，重复一次；平衡，5ml 0.01％HCL；上样； 淋洗，5ml 0.01％HCL，重复一次，接着加5ml正已烷，重复一次； 洗脱，加5ml 0.01％HCL-MeOH，收集洗脱液，洗脱3次；

F.浓缩处理：利用旋转蒸发仪Rotavapour R-300(Buchi， 瑞士)将固相萃取获得的提取液进行浓缩，浓缩后体积用 0.01％HCL-MeOH定容到10ml；

G.酸解：移去200ul样品到1.5ml离心管，加入400ul 5mol/L  HCl，用Parafilm封口膜密封。恒温箱90°处理30min，结束后 立即放冰上；

H.HPLC检测：进行HPLC检测，HPLC检测硬件条件如下：HPLC 系统为Agilent 1260(安捷伦，美国)，色谱柱ZORBAX SB-C18 (安捷伦，美国)；

洗脱条件：流动相A，水/乙腈/甲酸，87/3/10(v/v/v)； 流动相B，乙腈；0min，0％B；5min，5％B；10min，14％B；30min， 30％B；

检测条件：上样量，10μl；柱温，35℃；检测波长520nm；

标准样品：飞燕草色素(delphinidin)、矢车菊色素 (cyanidin)、天竺葵色素(pelargonidin)、锦葵色素 (malvidin)、芍药色素(peonidin)均购自美国ChromaDex公 司。

本发明与现有技术相比的优点是：

1、茶叶含有非常高的酚类物质，极易氧化花色素苷。本方 法能有效地克服其它酚类物质的干扰，得到高纯度的花色苷。如 图2和图3所示，采用该方法得到的花色苷提取物经过HPLC鉴 定，背景物质或干扰物质极少。

2、该方法从茶树鲜叶中提取花色苷的损失率低，重现性好。 在“紫嫣”品系花青素提取过程中，加入芍药色素作为内标，经 过HPLC检测发现，平均损失率为7.24％。

3、该方法适用于所有茶树品种的花色苷的定性、定量检测。 如图2和图3所示，“紫嫣”和“紫鹃”合成的花色苷类型相同， 但是组分比例不一样。

附图说明

图1为花色素标准品色谱图。

图2为茶树品系“紫嫣”花色苷酸解产物的色谱图。

图3为“紫鹃”品种花色苷酸解产物的色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明进一步详述。

实施例1：如图1、图2所示，一种从茶树鲜叶中萃取、纯 化、鉴定花青素的方法，包括以下步骤：

A.样品破碎：准确称量采摘新鲜紫色茶树品系“紫嫣”的一 芽二叶5g，加液氮研磨后转至50ml离心管；

B.浸提：加20ml 1％的HCL-MeOH到样品，置于冰箱4箱冷 藏室静止浸提；2h后离心，转速9000r/min，离心时间10min； 吸出上清液移至新的50ml离心管；再加20ml 1％HCL-MeOH到样 品进行二次浸提，2h后离心，转速9000r/min，离心时间10min， 转移上清液；最后再加10ml 1％HCL-MeOH进行第三次浸提，12h 后离心，转移上清液；

C.浓缩处理：利用旋转蒸发仪Rotavapour R-300(Buchi， 瑞士)对获得的浸提液进行浓缩，旋蒸仪旋转速度为4-7，温度 为37°；最后得到体积为25～30ml的浓缩液；

D.过滤处理：将浓缩液经0.45μm有机相针筒式滤膜过滤器 过滤；

E.固相萃取：使用反式固相萃取柱C18 cartridge (Waters，美国)对花色苷进行萃取。萃取流程如下：柱活化， 5ml 0.01％HCL-MeOH，重复一次；平衡，5ml 0.01％HCL；上样； 淋洗，5ml 0.01％HCL，重复一次，接着加5ml正已烷，重复一次； 洗脱，加5ml 0.01％HCL-MeOH，收集洗脱液，洗脱3次；

F.浓缩处理：利用旋转蒸发仪Rotavapour R-300(Buchi， 瑞士)将固相萃取获得的提取液进行浓缩，浓缩后体积用 0.01％HCL-MeOH定容到10ml；

G.酸解：移去200ul样品到1.5ml离心管，加入400ul 5mol/L  HCl，用Parafilm封口膜密封。恒温箱90°处理30min，结束后 立即放冰上；

H.HPLC检测：进行HPLC检测，HPLC检测硬件条件如下：HPLC 系统为Agilent 1260(安捷伦，美国)，色谱柱ZORBAX SB-C18 (安捷伦，美国)；

洗脱条件：流动相A，水/乙腈/甲酸，87/3/10(v/v/v)； 流动相B，乙腈；0min，0％B；5min，5％B；10min，14％B；30min， 30％B；

检测条件：上样量，10μl；柱温，35℃；检测波长520nm；

标准样品：飞燕草色素(delphinidin)、矢车菊色素 (cyanidin)、天竺葵色素(pelargonidin)、锦葵色素 (malvidin)、芍药色素(peonidin)均购自美国ChromaDex公 司。

实施例2：如图1、图3所示，一种从茶树鲜叶中萃取、纯 化、鉴定花青素的方法，包括以下步骤：

A.样品破碎：准确称量采摘新鲜紫色茶树品系“紫娟”的一 芽二叶5g，加液氮研磨后转至50ml离心管；

B.浸提：加20ml 1％的HCL-MeOH到样品，置于冰箱4箱冷 藏室静止浸提；2h后离心，转速9000r/min，离心时间10min； 吸出上清液移至新的50ml离心管；再加20ml 1％HCL-MeOH到样 品进行二次浸提，2h后离心，转速9000r/min，离心时间10min， 转移上清液；最后再加10ml 1％HCL-MeOH进行第三次浸提，12h 后离心，转移上清液；

C.浓缩处理：利用旋转蒸发仪Rotavapour R-300(Buchi， 瑞士)对获得的浸提液进行浓缩，旋蒸仪旋转速度为4-7，温度 为37°；最后得到体积为25～30ml的浓缩液；

D.过滤处理：将浓缩液经0.45μm有机相针筒式滤膜过滤器 过滤；

E.固相萃取：使用反式固相萃取柱C18 cartridge (Waters，美国)对花色苷进行萃取。萃取流程如下：柱活化， 5ml 0.01％HCL-MeOH，重复一次；平衡，5ml 0.01％HCL；上样； 淋洗，5ml 0.01％HCL，重复一次，接着加5ml正已烷，重复一次； 洗脱，加5ml 0.01％HCL-MeOH，收集洗脱液，洗脱3次；

F.浓缩处理：利用旋转蒸发仪Rotavapour R-300(Buchi， 瑞士)将固相萃取获得的提取液进行浓缩，浓缩后体积用 0.01％HCL-MeOH定容到10ml；

G.酸解：移去200ul样品到1.5ml离心管，加入400ul 5mol/L  HCl，用Parafilm封口膜密封。恒温箱90°处理30min，结束后 立即放冰上；

H.HPLC检测：HPLC检测硬件条件如下：HPLC系统为Agilent 1260(安捷伦，美国)，色谱柱ZORBAX SB-C18(安捷伦，美国)；

洗脱条件：流动相A，水/乙腈/甲酸，87/3/10(v/v/v)； 流动相B，乙腈；0min，0％B；5min，5％B；10min，14％B；30min， 30％B；

检测条件：上样量，10μl；柱温，35℃；检测波长520nm；

标准样品：飞燕草色素(delphinidin)、矢车菊色素 (cyanidin)、天竺葵色素(pelargonidin)、锦葵色素 (malvidin)、芍药色素(peonidin)均购自美国ChromaDex公 司。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利 范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变 换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本 发明的专利保护范围内。