一种牛AGPAT6基因单核苷酸多态性的检测方法

摘要

本发明公开了一种牛AGPAT6基因单核苷酸多态性的检测方法，其方法为：第一步、用牛的全血进行全基因组DNA提取；第二步、以提取的全基因组DNA为模板，分别以引物对A、B为引物，PCR扩增牛AGPAT6基因；第三步、用PCR混合产物测序，找出SNP位点；第四步、用限制性内切酶对PCR产物进行酶切；第五步、将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后根据电泳条带判定其多态性。有益效果：本发明利用PCR-RFLP技术对牛AGPAT6基因第1外显子的303bp处的T>C单核苷酸多态性和第12外显子的299bp处的G>A单核苷酸多态性进行检测。提供了一种低成本、简单、精准、便于推广应用的在DNA水平上筛查和检测与牛肉质性状和胴体性状密切相关的遗传标记，可用于牛的辅助选择和分子育种。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因单核苷酸多态性的检测方法，特别涉及一种牛AGPAT6基因单核苷酸多态性的检测方法。

背景技术

单核甘酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms,SNPs)是指基因组DNA序列中单个核苷酸(A/T/C/G)的变异，理论上包括转换、颠换、缺失和插入这4种不同的变异形式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者发生的概率比约为2:1。其中转换是指嘧啶与嘧啶之间或嘌呤与嘌呤之间的交换，而颠换是指嘧啶与嘌呤之间的交换。SNP在GC序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T，因为CG中的C常为甲基化的，自发脱氨后即成为T。理论上，SNP既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等位多态性，但实际上，后两个很少见，几乎可以忽略，因此我们在检测基因的单核甘酸多态性的时候只考虑二等位多态性即可。

根据基因的单核苷酸多态性对蛋白氨基酸序列的影响进行分类，其包括同义突变和非同义突变。同义突变是指SNP所致的碱基序列的变化不会导致其所翻译的蛋白氨基酸序列的改变，这是由于同一个氨基酸可能有多个密码子，即密码子的简并性所导致的；值得注意的是，虽然同义突变不会改变蛋白氨基酸序列，但是由于同一个氨基酸不同密码子所对应的tRNA比例不一样，其还是会影响蛋白的表达量，进而影响个体的性状。而非同义突变则是指碱基的变化导致所编码的氨基酸发生变化，从而使所翻译的蛋白改变，影响其功能发挥，对个体的表型产生重要作用。相对于非同义突变，同义突变其实更为常见，因为 一种蛋白发生重大改变很可能使个体致死。

目前，针对SNPs的检测主要有以下几种方法：DNA直接测序，单链构象多态技术(SSCP)，以及PCR-RFLP技术等。其中，PCR-RFLP是一种新的有效的检测SNP的方法。其首先通过混池测序找到SNP位点，在针对相应的SNP位点设计引物，再使用限制性内切酶进行切割，最后进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带分型即可准确的对SNP位点进行鉴别。PCR-RFLP方法快速，简便，结果准确，费用低，很适合群体SNP的检测。

AGPAT又称为LPAAT，是甘油三酯(TG)合成过程中的关键酶。在TG的甘油三磷酸(glycerol-3-phosphate，G3P)生物合成途径中，AGPAT催化LPA转变为PA，完成TGsn-2位置的酰基化。同时，PA是合成多种甘油磷脂类的主要前体，例如PS，PE，PC，PI等，其中PS，PE，PC是形成各种细胞膜的主要磷脂，因此AGPAT活性变化所导致的LPA和PA比例的改变，会影响细胞膜上磷脂的分布，并在细胞分裂时，影响膜的弯曲度。最新的研究表明，AGPAT总共有11中亚型，分别被不同的基因编码。在对小鼠的试验中发现，AGPAT1，AGPAT3在多种组织中表达，而AGPAT2，AGPAT4，AGPAT5的表达具有组织特异性。AGPAT8，AGPAT 9，AGPAT 10，AGPAT 11则分别在不同组织中具有较高的表达量。

对AGPAT6研究发现，其主要在脂肪组织和乳腺上皮细胞中表达，只位于内质网，缺乏AGPAT6的小鼠会厌食并避免遗传性肥胖，乳腺上皮细胞发育不良，奶中缺乏甘油二酯和甘油三酯。最新的研究表明，AGPAT6的氨基酸序列既与AGPAT家族相似，也类似于GPAT，AGPAT6具有GPAT活性，是一种GPAT微粒，因而又将其命名为GPAT4。而不管AGPAT家族还是GPAT家族，都是合成甘油三酯的重要酶。本课题组的前期转录组学研究结果也表明，AGPAT6基因可能与牛的肉质性状相关。因此，AGPAT6基因极有可能与中国西门塔尔牛的脂代谢相关。 动物从食物中获取能量，再在肝脏和脂肪等组织中把多余能量转变为脂肪储存起来。动物脂肪过度沉积就会影响肉质和人类健康。所以，减少动物脂肪的过度沉积，阐明其调控的分子机制及建立相应的调控技术已成为动物遗传学研究的热点。因而，对AGPAT6基因的研究具有重要意义。目前，有关AGPAT6多态性的研究主要是针对奶牛进行的。昝林森等在荷斯坦奶牛AGPAT6基因第三内含子检测到2个SNP位点，其与产奶量和乳脂率密切相关。张佳兰等在荷斯坦奶牛第二内含子发现1个SNP位点，其与产奶量、乳脂率和乳蛋白率相关。但有关AGPAT6基因与肉牛性状的相关性目前还没有报道。

发明内容

本发明解决的问题在于先利用PCR产物混合测序的方法筛查牛AGPAT6基因的多态性位点，再通过限制性内切酶对单个样本PCR产物进行酶切检测，提供了一种快速，简便，费用低的筛查和检测牛AGPAT6基因多态性的方法。通过AGPAT6基因SNP位点与牛性状之间的相关性的分析，以功能SNP作为分子育种和辅助选择的标记，加快良种选育速度和提高种群品质。

本发明的的技术方案如下：

牛AGPAT6基因的单核苷酸多态性，其基因SNP包括：

在牛AGPAT6基因第1外显子的303bp处有T>C的单核苷酸多态性；

在牛AGPAT6基因第12外显子的299bp处有G>A的单核苷酸多态性。

本发明提供的牛AGPAT6基因的单核苷酸多态性的检测方法，其步骤如下所述：

第一步、用牛的全血进行全基因组DNA提取；

第二步、以提取的全基因组DNA为模板，分别以引物对A、B为引物，PCR扩增牛AGPAT6基因；

所述引物对A为：

上游引物：5'TGGCAATGACAGACCTTCAGGAC 3'

下游引物：5'CAGGAGGCTGACAATCAGGCTGT 3'

所述引物对B为：

上游引物：5'CACCTTGTGTCCCTTTCCGC 3'

下游引物：5'AGAACAGCACTCCCCTAGCCCT 3'

第三步、用PCR混合产物测序，找出SNP位点；

第四步、用限制性内切酶对PCR产物进行酶切；

第五步、将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后根据电泳条带判定其多态性：

引物对A的PCR产物包含AGPAT6基因第1外显子的303bp处的T>C单核苷酸多态性，酶切后，TT基因型个体表现为139bp，102bp，61bp和48bp条带，CC基因型个体表现为163bp，139bp，61bp和48bp条带，TC基因型个体表现为163bp，139bp，102bp，61bp和48bp条带；

引物对B的PCR产物包含AGPAT6基因第12外显子的299bp处的G>A单核苷酸多态性，酶切后，GG基因型个体表现为119bp和58(62)bp条带，AA基因型个体表现为177bp，118bp和58(62)bp条带。

引物A、B的PCR扩增的反应程序均为：95℃预变性5min；95℃变性30s，61℃退火45s，72℃延伸45s，30个循环；延伸72℃10min，最后16℃保存。

酶切产物琼脂糖凝胶电泳采用4％的琼脂糖凝胶。

本发明的有益效果：

本发明利用PCR-RFLP技术对牛AGPAT6基因第1外显子的303bp处的T>C单核苷酸多态性和第12外显子的299bp处的G>A单核苷酸多态性进行检测。

本发明对牛群体的上述两个SNP进行了基因分型和基因频率分析，同时也将SNP位点与牛的肉质性状和胴体性状进行了关联分析。

本发明巧妙地利用PCR-RFLP法检测SNPs，发现了两个SNP位点与牛的肉质性状和胴体性状之间的相关性。提供了一种低成本、简单、精准、便于推广应用的在DNA水平上筛查和检测与牛肉质性状和胴体性状密切相关的遗传标记，可用于牛的辅助选择和分子育种。

附图说明

图1为本发明实施例中的中国西门塔尔牛AGPAT6基因引物对A的PCR产物2％的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为本发明实施例中的中国西门塔尔牛AGPAT6基因引物对B的PCR产物2％的琼脂糖凝胶电泳图。

图3为本发明实施例中的中国西门塔尔牛AGPAT6基因第1外显子的303bp处T>C位点的混池测序结果图。

图4为本发明实施例中的中国西门塔尔牛AGPAT6基因第12外显子的299bp处G>A位点的混池测序结果图。

图5为本发明实施例中的中国西门塔尔牛AGPAT6基因E1-303T>C位点酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图6为本发明实施例中的中国西门塔尔牛AGPAT6基因E12-299G>A位点酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

一、实验材料与方法

1、实验材料： 

1.1.实验动物： 

以两个中国西门塔尔牛群体为检测对象，分别是内蒙古乌拉盖地区中国西门塔尔牛群体和北京周边地区中国西门塔尔牛群体。

1.2.酶与试剂： 

DNA提取试剂盒、2XTaq PCR MasterMix均购自TIANGEN公司；限制性内切酶购自NEB公司；PCR引物由上海生物工程公司合成。

1.3.DNA分析软件： 

DNA序列测序结果分析软件：Chromas；

PCR引物设计软件：Primer Premier 5；

数据分析软件：SPSS 13.0；

2.实验方法： 

用中国西门塔尔牛的全血进行全基因组DNA提取，以提取的全基因组DNA为模板，设计引物进行PCR扩增西门塔尔牛AGPAT6基因，将PCR产物测序找到SNPs位点，然后将PCR产物用限制性内切酶进行酶切，最后将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳条带即可对SNP位点进行分型。下面对本发明做进一步详细描述，所述是对本发明的解释而不是限定。

2.1血样的采集： 

本发明具体以两个中国西门塔尔牛群体为检测对象，分别是：在内蒙古乌拉盖地区采集314个样本，在北京周边地区采集135个样本；均采用颈静脉采血的方式。

2.2血样基因组DNA的提取：

采用TIANGEN公司的TIANamp Blood DNA Kit提取西门塔尔牛血样中的基因组DNA。

1)在样品中加入2.5倍体积的细胞裂解液CL，颠倒混匀，10000rpm(11,500 ×g)离心1min，吸去上清，留下细胞核沉淀，向离心收集到的细胞核沉淀中加200μL缓冲液GS，振荡至彻底混匀。

2)加入20μL Proteinase K溶液，混匀。 

3)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置10min，期间颠倒混匀数次，溶液应变清亮，如溶液未变清亮，可延长裂解时间至溶液清亮为止。

4)加人200μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀。

5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

8)重复操作步骤7。

9)12,000rpm(13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10)将吸附柱CB3转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50～200μl洗脱缓冲液TB，室温放置2～5min，12,000rpm(13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。

用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组DNA的质量，-80℃保存。

2.3扩增引物设计：

(1)引物对A序列如下： 

上游引物：5'TGGCAATGACAGACCTTCAGGAC 3'

下游引物：5'CAGGAGGCTGACAATCAGGCTGT 3'

该引物扩增了中国西门塔尔牛AGPAT6基因的第1外显子区域，扩增片段长度为411bp。

(2)引物对B序列如下： 

上游引物：5'CACCTTGTGTCCCTTTCCGC 3'

下游引物：5'AGAACAGCACTCCCCTAGCCCT 3'

该引物扩增了中国西门塔尔牛AGPAT6基因的第12外显子区域，扩增片段长度为239bp。

2.4PCR扩增西门塔尔牛AGPAT6基因：

分别以两个中国西门塔尔牛群体的DNA为模板，用设计的上述两个引物对进行PCR扩增，其反应体系为25μL，见表一；

表一、PCR反应体系： 

两个引物对的PCR反应程序均为：95℃预变性5min；95℃变性30s，61℃退火45s，72℃延伸45s，30个循环；延伸72℃10min，最后16℃保存。

2.5缓冲液的配制：

50X TAE缓冲液：Tris 242g，Na₂EDTA·2H₂O 37.2g，向烧杯中加入约800ml 的去离子水，充分搅拌溶解，再加入57.1ml的醋酸，充分搅拌，最后加去离子水定容至1L，室温保存。

2.6PCR产物测序： 

将每45个不同模板的PCR扩增产物进行混合，送上海生物工程有限公司进行测序。测序完成后，分析测序峰图，出现套峰的位点即是有单核苷酸多态性。如图3，图4。

3、中国西门塔尔牛AGPAT6基因单核苷酸多态性的PCR-RFLP检测：

3.1PCR扩增中国西门塔尔牛AGPAT6基因：

PCR扩增体系和反应条件如上所述，PCR扩增产物用2％的琼脂糖凝胶进行跑电泳检测，电泳结果如图1，图2所示。

3.2PCR-RFLP检测中国西门塔尔牛AGPAT6基因单核苷酸多态性：

将引物对A和B的PCR扩增产物分别用NEB公司的限制性内切酶BstNI和HhaI进行酶切，酶切体系见表二；

表二 限制性内切酶BstNI和HhaI的酶切体系：

酶切条件：BstNI酶切体系在60℃金属浴中放置30min即可，酶切产物用4％的琼脂糖凝胶，120V电泳28min进行检测，如图5。HhaI酶切体系放在37℃金属浴中放置4h，酶切产物均用3％的琼脂糖凝胶，140V电泳30min进行检测，如图6。

用凝胶成像系统照相分析，并人工进行判型：

引物对A的PCR产物包含AGPAT6基因第1外显子的303bp处的T>C单核苷酸多态性，用限制性内切酶BstNI进行酶切时，T等位基因能被酶切开，而C等位基因不能被切开，同时因为PCR产物中还有其他的能被限制性内切酶BstNI切开的位点，所以TT基因型个体表现为139bp，102bp，61bp和48bp条带，CC基因型个体表现为163bp，139bp，61bp和48bp条带，TC基因型个体表现为163bp，139bp，102bp，61bp和48bp条带；

引物对B的PCR产物包含AGPAT6基因第12外显子的299bp处的G>A单核苷酸多态性，用限制性内切酶HhaI进行酶切时，G等位基因能被酶切开，而A等位基因不能被切开，同时因为PCR产物中还有一个能被限制性内切酶HhaI切开的位点，GG基因型个体表现为119bp和58(62)bp条带，AG基因型个体表现为177bp，118bp和58(62)bp条带。

4、本发明制备的分子标记在两个中国西门塔尔牛群体中多态性的诊断应用：

4.1群体多态性的诊断：

利用上述SNP多态性的检测方法对两个中国西门塔尔牛群体进行检测。

4.2SNP位点的频率统计分析：

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A＝(2N_AA+N_Aa)/2N。公式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aa表示群体中具有Aa基因型个体数量。

两个中国西门塔尔牛群体中AGPAT6基因的两个单核苷酸多态性位点的基因型频率和基因频率如下：

在E1-303T>C位点，CC型有243头，TT型有10头，TC型有105头。CC基因型频率为0.6788，TT基因型频率为0.0279，TC基因型频率为0.2933，C等位基因频率为0.8254，T等位基因频率为0.1746；因此，C等位基因占优势，以纯合型CC型为主要基因型，且符合哈代温伯格平衡。

在E12-299G>A位点，GG型有336头，AG型有42头，GG基因型频率为0.8889，AG基因型频率为0.1111，G等位基因频率为0.9444，A等位基因频率为0.0556；因此，G等位基因占优势，且以纯合型GG型为主要基因型。在所测的群体中没有检测到AA基因型，可能是由于AA基因型在遗传过程中不能维持稳定的遗传变异而逐渐被淘汰，或者是由于检测个体数不够，没有发现该基因型的存在。

AGPAT6基因两个SNP位点与西门塔尔牛性状之间的相关性分析：

表三 E1-303T>C位点不同基因型与西门塔尔牛性状之间的相关性分析：

注：同一个性状在平均数一栏里用不同字母标注表示具有显著性差异(P<0.05),同一个性状在平均数一栏里用相同字母标注表示差异不显著(P>0.05)。

表四、E12-299G>A位点不同基因型与西门塔尔牛性状的相关性分析

注：同一个性状在平均数一栏里用不同字母标注表示具有显著性差异(P<0.05),同一个性状在平均数一栏里用相同字母标注表示差异不显著(P>0.05)。