基于HPV/CYAA的嵌合蛋白及它们在诱导针对HPV感染和HPV诱导的疾病的免疫应答中的应用

摘要

本发明涉及一种嵌合蛋白，其包含以下或由以下构成：从N末端至C末端，(a)博德特氏菌CyaA蛋白的N末端部分；(b)异源多肽，其包含来自不同HPV的抗原；以及(c)博德特氏菌CyaA蛋白的C末端部分。本发明还涉及一种编码该嵌合蛋白的多核苷酸。本发明的另一方面，还涉及包含至少一种本发明的嵌合蛋白的组合物和所述组合物的预防和/或治疗用途。

说明书

技术领域

本发明涉及一种嵌合蛋白，其包含以下或由以下构成：从N末端至C末端，(a)博德特氏菌(Bordetella)CyaA蛋白的N末端部分；(b)异源多肽，其包含来自不同HPV的抗原；以及(c)博德特氏菌CyaA蛋白的C末端部分。本发明还涉及一种编码该嵌合蛋白的多核苷酸。本发明的另一方面，还涉及包含至少一种本发明的嵌合蛋白的组合物和所述组合物的预防和/或治疗用途。

背景技术

博德特氏菌型，特别是百日咳博德特氏菌的腺苷酸环化酶(CyaA)，已被广泛地描述为一个重组载体，其能将多肽(如抗原)有效地输送至抗原呈递细胞(APC)的细胞溶质内^{[1]、[2]、[3]}。此外，重组CyaAs已被用于有效治疗患肿瘤小鼠^{[4]、[5]、[6]}。

一些作者已强调，通过CyaA(用作载体)进行多肽输送的效率、特别是抗原输送的效率会受到插入多肽(抗原)的静电荷及其构象的正面或负面影响。1998年，Karimova等人^[7]描述了对于将插入至CyaA的CD8⁺T细胞多肽表位输送至抗原呈递细胞和抗原呈递细胞内取决于插入表位的静电荷：隐含OVA表位的重组CyaA能转运至APC内并诱导体内CTL应答，而带有融合至OVA表位的4个谷氨酸残基的相同构建体不能再转运，并且不能诱导可检测的体内细胞毒性T细胞淋巴细胞(CTL)应答。在2012年，Holubova等人描述了基于CyaA的各种构建体：缺失包含OVA表位SIINFEKL的N末端的CyaA蛋白，或N末端结构域截短并包含插入至不同位点的一些表位的CyaA蛋白^[25]。Holubova等人的结论是，他们的实验提供了构建基于CyaA的抗原输送的概念证据，其中，该构建体中以大型人工CTL多表位代替整个AC结构域。

在2001年，Gmira等人^[8]开发了一种新的CyaA载体，以助于重组CyaAs的构建，所述重组CyaAs的催化结构域中被插入外源性多肽或抗原。这些修饰如下：

-在密码子224下游借助新的独特限制性位点插入多克隆位点序列；

-缺失密码子225至234；以及

-改变密码子236、238和239；引入这些修饰以增加局部静电荷(酸性变低)，先前认为其对该CyaA-抗原杂合蛋白跨越原位APC细胞膜的转运是很关键的。

修饰后的CyaA具有与野生型CyaA类似的侵入活性。

作者测试了5个抗原，其大小范围为87～206残基，并带有-4～+14的静电荷，而且显示具有酸值的那些抗原已失去了它们的转运效率，这也证实了Karimova等人以前的结果。此外，他们用具有内部二硫桥或复杂的结构的抗原测试了CyaAs：它们都不能转运入靶细胞，其支持了以下的假设：插入CyaA催化结构域的多肽必须展开以被转运。

表1：摘自[7]和[8]。带有酸性电荷的插入物不会被转运至APC的细胞溶质内。酸性电荷是从赖氨酸和精氨酸残基的数量中减去天冬氨酸和谷氨酸残基的数量来计算的。

肿瘤消退实验中所使用的抗原具有一个短尺寸(OVA是8个残基长度)^[4]或它们的二级结构被抗原片段的内部重排而破坏并且最大尺寸为103个残基^[5]。

根据这些研究，得出以下结论，以改善通过CyaA载体的向量化效率：

-应避免多肽中的酸性区域的包含物被插入CyaA；以及

-这些插入物中应避免二级和三级结构的包含物，因为这样的结构干扰酶的腺苷酸环化酶(AC)结构域适当内化，该酶的腺苷酸环化酶(AC)结构域中插有多肽。

鉴于这些结论，构建两个重组CyaA，一个包含HPV16 R7抗原，另一个包含HPV18E7抗原。另外，还构建二价重组CyaA，其中，HPV16和HPV18 E7抗原被一起被插入该二价重组CyaA(专利EP1576967；Préville等人)。然而，未有实验报道以下的重组CyaA：

超过2种HPV E7蛋白被插入至相同的CyaA载体。

因此，Préville等人公开了3种重组CyaA载体，其插有HPV16型的E7多肽或其变体。

-CyaA-E7^full载体，含有全长E7蛋白，

-CyaA-E7_Δ30-42载体，含有酸性区域aa30～42缺失的E7片段

-CyaA-E7_49-57载体，含有存在于E7的鼠H-2D^b限制性T细胞表位。

将这些重组CyaA载体用于免疫小鼠，并检测E7特异性CTL应答。为了检测免疫小鼠后的免疫反应，采用了CTL铬释放检测定法。在体内动物实验中，相比于CyaA-E7_49-57，CyaA-E7_Δ30-42和CyaA-E7^full提供了最有效的CTL免疫应答。

另外，还评价了这些重组CyaA载体诱导肿瘤消退的能力。如果CyaA-E7_49-57和CyaA-E7^full所赋予的肿瘤消退速度不能明显区分，那么在肿瘤消退和生长抑制方面，CyaA-E7_Δ30-42明显更优异。因此，先前在C57BL/6小鼠中被识别的单独CTL表位已被证明是有效的，但其没有给予最佳的免疫应答。

接着，对免疫应答的持久性进行检测。对来自3个月之后的一些仍然存活小鼠的脾细胞进行检测，以确定它们的溶解表达E7抗原的TC-1细胞的能力，并且在进行接种第100天，用TC-1细胞重新刺激其它存活的动物。接种了CyaA-E7_Δ30-42的动物显示出高水平的防护。低于40％的接种了CyaA-E7_49-57的动物被保护，而90％～100％的接种了CyaA-E7_Δ30-42和CyaA-E7^full的动物存活下来。

根据该工作，可获得以下的教导：

-携带HPV16和/或HPV18 E7蛋白的CyaA载体引起C57BL/6小鼠内的免疫应答；

-与仅具有CD8⁺T细胞表位的E7_49-57表位相比，用同时具有CD8⁺和CD4⁺T细胞表位的抗原可获得一个完全应答；

-与采用CyaA-E7^full或CyaA-E7_49-57处理的小鼠相比，用CyaA-E7_Δ30-42载体处理小鼠可获得高效率，其中，该CyaA-E7_Δ30-42载体的E7蛋白缺失从残基30至42的酸性区域；

-用这些载体获得的免疫应答能够诱导肿瘤病变的消退；

-在治疗的无肿瘤小鼠中，由于排斥了以TC-1细胞进行的新刺激，从而得到了长期持久的应答；以及

-为了开发二价治疗而将两种重组CyaA进行共注射是可行的，每种抗原分别保持对其表位的应答。

因此，在现有技术中，嵌入了酸性氨基酸序列段(stretches)的某些多肽或抗原和整体带负电的多肽或抗原，已被证明可改变CyaA载体转运这些多肽跨越接种过疫苗的动物中的APC细胞膜的效率。这导致针对所述抗原细胞免疫应答很弱或无保护性细胞免疫应答。

本发明人认为，其可被视为候选药物设计的缺点，因为这种酸性氨基酸序列可含有保护性细胞免疫所需要的重要CD4⁺表位和/或CD8⁺表位。

因此，仍然需要承载免疫原性结构的改进载体，其可被用于诱导强而持久的细胞保护性免疫应答，尤其是可被用于肿瘤消退和肿瘤预防中，来对抗包含酸性氨基酸序列段的多肽和抗原以及对抗整体带负电的多肽或抗原。

附图说明

图1：(A)pKTRACE5-HPV16E7_Δ30-42的示意图，其中，指明了CyaA-HPV16E7_Δ30-42的相关限制性位点和插入序列；(B)pKTRACE5-HPV18E7_Δ32-42的示意图，其中，指明了CyaA-HPV18E7_Δ32-42的相关限制性位点和插入序列。

图2：gtCyaA蛋白和设计的gtCyaA突变体。从aa(氨基酸)(残基)1到400，为催化结构域(AC)；从aa401到1706，为溶血结构域。在催化结构域中，三个空白框表示CyaA活性所必须的三个区域([15]、[16]、[1])：涉及与ATP进行相互作用的结构域I(aa54-77)，涉及与Mg2+-ATP进行相互作用的结构域II(aa184-198)以及涉及与钙调蛋白(CaM)进行相互作用的结构域III(aa287-318)。gtCyaAd93相当于缺失了93个氨基酸(228-320)的gtCyaA序列。gtCyaAd203相当于缺失了203个氨基酸(184-386)的gtCyaA序列。

图3：(A)pGTPc608载体的示意图，其包含gtCyaAd93-pep216多核苷酸和根据IPTG诱导型启动子的cyaC优化基因；(B)pGTPc608载体的示意图，其包含gtCyaAd203-pep216多核苷酸和根据IPTG诱导型启动子的cyaC优化基因。

图4：CyaAd203-pep105质粒图谱。在EcoRI和XmaI限制性位点之间克隆Pep105。

图5：HPV16 E7_49-57、HPV18 E7_AS43-49和OVA_257-264及其特异性CD8⁺T淋巴细胞的频率，以及HPV16 E7(#116-2/3)和HPV18 E7(#171-1/2/3)特异性T淋巴细胞的频率，其是通过用安慰剂、ProCervix或CyaAd203-PEP105免疫后7天进行测定的。其显示了每百万总脾细胞的事件数。从左至右，在37℃、5％CO₂下，用培养基(对照)、MHCI类限制性肽HPV16 E7_49-57、HPV18 E7_AS43-49、OVA_257-264、#116-2/3肽库和#171-1/2/3肽库对总脾细胞进行再刺激20小时。

图6：LCMV GP_33-41、OVA_323-339、MOG_35-55和MAGEA3特异性T淋巴细胞的频率，其是通过用安慰剂、ProCervix或CyaAd203-PEP105免疫后7天进行测定的；并显示了每百万总脾细胞的事件数。从左至右，用培养基(对照)、LCMV GP_33-41、OVA_323-339、MOG_35-55肽、Histag MAGEA3蛋白再刺激总脾细胞，或者在B16肿瘤细胞系B16-GFP的存在下再刺激总脾细胞并将B16-MAGEA3-GFP作为APC，所有的再刺激都是在37℃、5％CO₂下进行20小时。

图7：(A)HPV16、18和45 E7蛋白序列的比对；黑框：pRB结合基序；灰框：在锌指环中涉及的半胱氨酸；黑色箭头凸显了酸性区域；(B)HPV31、33、52和58蛋白序列的比对；黑框：LXCXE基序；绿框：在锌指环中涉及的半胱氨酸；虚线框：用于HPV52 E7序列，自体免疫表位的位置。

图8：(A)三价候选疫苗抗原；(B)四价候选疫苗的重组抗原序列(N末端：E7蛋白的N末端部分；C末端：E7蛋白的C末端部分)。

图9：用IPTG诱导3小时后的蛋白表达谱(I0：诱导前；I3：诱导后)。

图10：HPV16 E7_49-57和HPV18 E7_AS43-49特异性CD8⁺T淋巴细胞的频率，其是通过免疫7天后进行测定的；用MHC I类限制性肽再刺激总脾细胞。其结果用每百万总脾细胞分泌IFN-γ的细胞数进行表示。

图11：HPV45 E7特异性IFN-γ分泌型T淋巴细胞的频率，其是通过免疫7天后进行测定的；用覆盖HPV45 E7全肽序列(子库1：#218-1；子库2：#218-2；子库3：#218-3)的15-聚体重叠肽再刺激总脾细胞。其结果用每百万总脾细胞的分泌IFN-γ的细胞数进行表示。

图12：用三价候选物(Btpr_114、Btpr115和BTpr_117)进行体内的杀死实验；左面版：在体内杀死负载有HPV18 E7肽文库#171-1和#171-2的脾细胞的百分比；右面版：在体内杀死负载有HPV45 E7肽文库#218-3的脾细胞的百分比。

图13：通过嵌入有HPV16 E7抗原，聚-ICLC作为佐剂的CyaA候选疫苗进行治疗性疫苗接种，引起TC-1诱导的实体瘤的清除；(A)疫苗接种方案：在第0天，将TC-1肿瘤细胞接种在所有小鼠的右腋下；在第11天对它们进行治疗。(B)监测肿瘤生长，直到第60天。

图14：清除了针对LL2-HPV18 E7细胞系或LL2-GFP细胞系生长的TC-1肿瘤细胞系的小鼠的预防性保护。(A)疫苗接种方案：在第65天，将已清除TC-1肿瘤的小鼠分为两个亚组，分别用LL2-HPV18 E7细胞系或对照LL2-GFP细胞系对小鼠进行接种。(B)监测肿瘤生长，直到第110天。

图15：通过免疫7天后测量HPV16 E7、HPV18 E7和HPV52 E7特异性T淋巴细胞的频率——用覆盖HPV16、HPV18和HPV52 E7蛋白的序列的15-聚体重叠肽再刺激总脾细胞。用正方形表示肽的子库。结果用每百万总脾细胞的IFN-γ斑点形成细胞(sfc)数进行表示。HPV18 E7 sfc不计其数(TNTC)。

图16(A、B、C和D)：通过免疫7天后测定的分泌IFN-γ的HPV16 E7、HPV18E7、HPV33 E7和HPV52 E7特异性T淋巴细胞的频率。用覆盖HPV16、HPV18、HPV33和HPV52 E7全肽序列(每种肽库被细分在E7蛋白的从N末端到C-末端的子库中)(如直方图所示)的15-聚体重叠肽再刺激总脾细胞。结果用每百万总脾细胞的IFN-γ斑点形成细胞数进行表示。

图17(A和B)：通过七价候选疫苗诱导分别负载有HPV16 E7肽文库(图17-A)或HPV18 E7肽文库(图17-B)的细胞的E7特异性杀死。

发明内容

详细说明

本发明人已经研发了新的CyaA载体，其缺失了野生型CyaA的腺苷酸环化酶(AC)结构域，并且该载体中插入有大尺寸(以具有多达441个氨基酸残基的序列来说明，但其并不局限于此)和/或呈现高度带负静电荷(也被称为酸性电荷)(多达-46)的抗原。已经检测了这些构建体的诱导特异性CD8⁺和CD4⁺T细胞应答和细胞毒性的能力以及它们诱导肿瘤排斥(tumor rejection)的能力。令人惊讶的是，这些新CyaA载体已显示出允许将带有高的负静电荷的抗原输送至靶细胞。此外，当抗原被插入这些新载体时，在严格条件下进行的细胞毒性实验中，相比于缺失了这些酸性结构域的相同抗原，具有它们的酸性结构域的抗原更有效。

本发明涉及一种编码CyaA衍生蛋白的多核苷酸，其中，所述CyaA衍生蛋白包含以下或由以下构成：

1)如SEQ ID NO:2所示的百日咳博德特氏菌CyaA蛋白的片段，所述片段的序列起始于SEQ ID NO:2的第一个残基，并终止于位于SEQ ID NO：2的第183位至第227位(即在第182位和第228位之间)中的一个残基，并且所述片段融合至

2)如SEQ ID NO:2所示的百日咳博德特氏菌CyaA蛋白的片段，所述片段的序列起始于位于SEQ ID NO:2的第321位至第387位(即在第320位和第388位之间)中的一个残基，并终止于SEQ ID NO:2的最后一个残基。

SEQ ID NO:2表示百日咳博德特氏菌的野生型CyaA蛋白的氨基酸序列。编码如SEQ ID NO：2所示的CyaA的多核苷酸的特定实施方式是如SEQ ID NO：1所示。另一种编码如SEQ ID NO：2所示的CyaA的多核苷酸的特定实施方式是通过沉默核苷酸突变(即通过修饰而不引起SEQ ID NO：2的氨基酸产生变化)的序列SEQ ID NO：1的修饰版。一个特定的SEQ ID NO：1修饰版是以下的序列：被优化的在大肠杆菌中表达的如SEQ ID NO：69所示的序列。SEQ ID NO：69是本发明的一部分。本发明中，编码本发明的CyaA衍生蛋白的多核苷酸并不编码或不包括编码SEQ ID NO：2的多核苷酸。此外，本发明所述的编码CyaA衍生蛋白的多核苷酸不包括SEQ ID NO：1或不由SEQ IDNO：1构成。

其结果是，由本发明所述的多核苷酸获得的本发明CyaA衍生蛋白包含两个片段或由两个片段构成，该两个片段是由相同博德特氏菌CyaA蛋白融合在一起或重新结合而成。对于“片段”，是指野生型博德特氏菌CyaA蛋白序列中发现的连续氨基酸残基的序列段或串联。

第一个片段(所述CyaA衍生的多肽的N末端部分)起始于SEQ ID NO：2的第一个残基，并终止于位于SEQ ID NO：2的第183位至第227位之间的一个残基。

该第一片段具有的尺寸范围为183至227个残基，即最少为183残基、最多为227残基的长度。在一个特定的实施方式中，该片段为至少183个残基，至少190个残基，至少200个残基，至少210个残基或至少220个残基。在一个特定的实施方式中，该第一片段的大小为183个残基或227个残基。

因此，该片段起始于SEQ ID NO：2的第一个残基，终止于选自由以下残基构成的组中的一个残基：

SEQ ID NO：2的残基183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226和227。

换句话说，该第一片段包含选自由以下残基构成的组的序列或者由选自由以下残基构成的组的序列构成：

SEQ ID NO：2的残基1-183、1-184、1-185、1-186、1-187、1-188、1-189、1-190、1-191、1-192、1-193、1-194、1-195、1-196、1-197、1-198、1-199、1-200、1-201、1-202、1-203、1-204、1-205、1-206、1-207、1-208、1-209、1-210、1-211、1-212、1-213、1-214、1-215、1-216、1-217、1-218、1-219、1-220、1-221、1-222、1-223、1-224、1-225、1-226和1-227。

在一个特定的实施方式中，该第一片段包含SEQ ID NO：2的残基1至227或SEQID NO：2的残基1至183，或者该第一片段由SEQ ID NO：2的残基1至227或SEQ IDNO：2的残基1至183构成。

在一个特定的实施方式中，假如所述核苷酸片段的长度是3的倍数，那么编码所述第一片段的多核苷酸起始于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：69的第一个核苷酸，终止于位于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：69的第549位至第681位之间的一个核苷酸。因此，编码该片段的多核苷酸包含选自由以下残基构成的组的序列或者由选自由以下残基构成的组的序列构成：

SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：69的残基1-549、1-552、1-555、1-558、1-561、1-564、1-567、1-570、1-573、1-576、1-579、1-582、1-585、1-588、1-591、1-594、1-597、1-600、1-603、1-606、1-609、1-612、1-615、1-618、1-621、1-624、1-627、1-630、1-633、1-636、1-639、1-642、1-645、1-648、1-651、1-654、1-657、1-660、1-663、1-666、1-669、1-672、1-675、1-678和1-681。

第二片段(所述CyaA衍生的多肽的C末端部分)起始于SEQ ID NO：2的第321位至第387位之间的一个残基，终止于SEQ ID NO：2的最后一个残基。

该第二片段具有的尺寸范围为1320至1386个残基，即其为至少1320个残基、最多1386个残基的长度。在一个特定实施方式中，该片段为至少1320个残基，至少1330个残基，至少1340个残基，至少1350个残基，至少1360个残基，至少1370个残基，或至少1380个残基。在一个特定实施方式中，该第二片段的大小是1320个残基或为1386个残基。

因此，该第二片段起始于选自由以下残基构成的组中的一个残基，并终止于SEQ IDNO：2的最后一个残基(即残基1706)：

SEQ ID NO：2的残基321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386和387。

换句话说，该第二片段包含选自由以下残基构成的组的序列或者由选自由以下残基构成的组的序列构成：

SEQ ID NO：2的残基321-1706、322-1706、323-1706、324-1706、325-1706、326-1706、327-1706、328-1706、329-1706、330-1706、331-1706、332-1706、333-1706、334-1706、335-1706、336-1706、337-1706、338-1706、339-1706、340-1706、341-1706、342-1706、343-1706、344-1706、345-1706、346-1706、347-1706、348-1706、349-1706、350-1706、351-1706、352-1706、353-1706、354-1706、355-1706、356-1706、357-1706、358-1706、359-1706、360-1706、361-1706、362-1706、363-1706、364-1706、365-1706、366-1706、367-1706、368-1706、369-1706、370-1706、371-1706、372-1706、373-1706、374-1706、375-1706、376-1706、377-1706、378-1706、379-1706、380-1706、381-1706、382-1706、383-1706、384-1706、385-1706、386-1706和387-1706。

在一个具体实施方式中，该第二片段包括SEQ ID NO：2的残基321-1706或SEQ IDNO：2的残基387-1076，或者该第二片段由SEQ ID NO：2的残基321-1706或SEQ IDNO：2的残基387-1076构成。

在一个具体实施方式中，假如所述核苷酸片段的长度是3的倍数，那么编码所述第二片段的多核苷酸起始于位于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：69的第961位至第1159位之间的一个核苷酸，终止于位于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：69的最后一个核苷酸(即核苷酸5118)。因此，编码该第二片段的多核苷酸包含选自由以下残基构成的组的序列或者由选自由以下残基构成的组的序列构成：

SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：69的残基961-5118、964-5118、967-5118、970-5118、973-5118、976-5118、979-5118、982-5118、985-5118、988-5118、991-5118、994-5118、997-5118、1000-5118、1003-5118、1006-5118、1009-5118、1012-5118、1015-5118、1018-5118、1021-5118、1024-5118、1027-5118、1030-5118、1033-5118、1036-5118、1039-5118、1042-5118、1045-5118、1048-5118、1051-5118、1054-5118、1057-5118、1060-5118、1063-5118、1066-5118、1069-5118、1072-5118、1075-5118、1078-5118、1081-5118、1084-5118、1087-5118、1090-5118、1093-5118、1096-5118、1099-5118、1102-5118、1105-5118、1108-5118、1111-5118、1114-5118、1117-5118、1120-5118、1123-5118、1126-5118、1129-5118、1132-5118、1135-5118、1138-5118、1141-5118、1144-5118、1147-5118、1150-5118、1153-5118、1156-5118和1159-5118。

在一个特定实施方式中，CyaA衍生蛋白包含如SEQ ID NO：10所示序列的多肽或由该多肽构成；SEQ ID NO：10是由一片段(该片段是由SEQ ID NO：2的残基1至227构成)构成，并且该片段融合至由SEQ ID NO：2的残基321至1706构成的片段。

在另一个特定实施方式中，CyaA衍生蛋白包含如SEQ ID NO：12所示序列的多肽或由该多肽构成；SEQ ID NO：12是由一片段(该片段是由SEQ ID NO：2的残基1至183构成)构成，并且该片段融合至由SEQ ID NO：2的残基387至1706构成的片段。

另外，还公开了其他特定的实施方式：

-所述CyaA衍生蛋白包含如SEQ ID NO：19所示序列的多肽或由该多肽构成，即一个由一片段(该片段是由SEQ ID NO：2的残基1至227构成)构成的序列，并且该片段融合至由SEQ ID NO：2的残基387至1706构成的片段；以及

-所述CyaA衍生蛋白包含如SEQ ID NO：20所示序列的多肽或由该多肽构成，即一个由一片段(该片段是由SEQ ID NO：2的残基1至183构成)构成的序列，并且该片段融合至由SEQ ID NO：2的残基321至1706构成的片段。

表述“融合至”，当涉及蛋白质或多肽时，其是指每个肽部分(例如，一些CyaA片段以及任选的异源多肽)通过肽键共价连接在一起。此处描述的这些不同肽部分的顺序是从N末端至C末端，也就是说，一个部分的最后C末端残基通过肽键连接另一部分的第一个N末端残基。表述“融合至”，当涉及多核苷酸时，其是指两个以上的多核苷酸部分(例如，一些核苷酸CyaA片段以及任选的编码异源多肽的核苷酸)通过磷酸二酯键共价连接在一起。此处描述的这些不同核苷酸部分的顺序是从5'到3'，即一个部分的最后一个3'核苷酸通过磷酸二酯键连接另一部分的第一个5'核苷酸。由核苷酸序列融合而构成的多核苷酸特别可作为重组多核苷酸产物，其包括cyaA的天然编码序列中的序列片段的缺失。

本发明还涉及一种编码变体CyaA衍生蛋白的多核苷酸，其中，所述第一片段是一个具有与如SEQ ID NO：2所示百日咳博德特氏菌CyaA蛋白的片段至少95％相似性的变体，所述片段的序列起始于SEQ ID NO：2的第一个残基、终止于位于SEQ ID NO：2的第183位至第227位之间的一个残基，和/或其中所述第二片段是一个具有与以下片段至少95％相似性的变体：

该片段起始于位于SEQ ID NO：2的第321位至第387位之间的一个残基，终止于SEQ ID NO：2的最后一个残基。

“具有至少95％相似性的变体”涉及蛋白质或多肽时，其是指氨基酸一致性为用于引起改变的多肽的至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的蛋白序列。计算相似性的百分比，比较两个所述变体和所述用于引起改变的多肽的全长序列，特别超过两个序列中的较短一个。因此，当通过一个或一个以上的添加和/或一个或一个以上的缺失和/或一个或一个以上的替换，使其残基的5％不同于该多肽的残基时，该变体具有与多肽95％的相似性。在一个特定实施方式中，仅通过替换、优选保守替换，使所述变体不同于所述多肽，因此，该变体保持与用于引起改变的序列相同的长度。在另一个实施方式中，通过至少1个单独氨基酸缺失(优选通过1、2、3、4或5个单独氨基酸缺失)和通过替换(优选保守替换)，使所述变体不同于所述多肽。

本发明还涉及多核苷酸变体，其具有与编码SEQ ID NO：1部分(或片段)的多核苷酸至少75％的相似性。在一个特定的实施方式中，假如所述核苷酸片段的长度是3的倍数，那么编码所述第一片段的多核苷酸具有与以下多核苷酸75％的相似性：

该多核苷酸起始于SEQ ID NO：1的第一个核苷酸，终止于位于SEQ ID NO：1的第549位至第681位之间的一个核苷酸。

在另一实施方式中，独立地或结合以上论述，假如所述核苷酸片段的长度是3的倍数，那么编码所述第二片段的多核苷酸具有与以下多核苷酸75％的相似性：

该多核苷酸起始于位于SEQ ID NO：1的第961位至第1159位之间的一个核苷酸，终止于SEQ ID NO：1的最后一个核苷酸(即核苷酸5118)。

在一个特定实施方式中，编码所述第一和第二片段的多核苷酸来源于以下的多核苷酸：

其全长序列具有与SEQ ID NO：1至少75％的相似性。

这种变体的一个例子是SEQ ID NO：69。在一个特定实施方式中，该多核苷酸变体是因用于由上述公开的SEQ ID NO：1获得的多核苷酸或SEQ ID NO：69的多核苷酸的遗传密码的简并而导致的。在一个特定实施方式中，由此获得的多核苷酸变体在摆动位置上具有一个衰退(degenerated)碱基。

“具有至少75％相似性的变体”涉及多核苷酸时，其是指核苷酸一致性为用于引起改变的多核苷酸的至少75％、至少79％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的核苷酸序列。计算相似性的百分比，比较两个所述变体和所述用于引起改变的多核苷酸的全长序列，特别超过两个序列中的较短一个。因此，当通过一个或一个以上以上的核苷酸添加和/或一个或一个以上的核苷酸缺失和/或一个或一个以上的核苷酸替换，使其核苷酸的25％不同于所述多核苷酸的核苷酸时，该变体具有与多核苷酸75％的相似性。在一个特定实施方式中，仅通过核苷酸替换，使所述变体产生不同，因此，该变体保持与用于引起改变的序列相同的长度。在一个特定实施方式中，仅通过核苷酸沉默突变，使所述变体产生不同，因此，其保持编码与通过用于引起改变的序列相同的蛋白。在一个特定实施方式中，仅通过核苷酸替换(它们中的一部分为沉默突变)，使所述变体产生不同，以致于被所述多核苷酸变体编码的蛋白的序列具有与本发明的蛋白或多肽至少95％的相似性，或具有100％的一致性。

此处所示的核苷酸和蛋白的相似性百分比，可通过基于Needleman和Wunsch算法(如MeAlign^[18])的公知程序来计算。

在一个特定实施方式中，此处所定义的变体CyaA衍生蛋白保持其以下的能力：结合至靶细胞和/或将它的腺苷酸环化酶(AC)结构域转运至靶细胞的细胞溶质中。在一个特定实施方式中，靶细胞是表达CD11b的细胞，即在其表面表达CD11b/CD18受体的细胞(CD11b⁺)。特别地，这些细胞是粒细胞/中性粒细胞、巨噬细胞、NK细胞、T CD8⁺亚群、B细胞亚群、如朗格汉斯细胞的树突细胞或髓样树突状细胞。

本发明变体的结合至靶细胞的能力可被检测，特别是，可根据EP03291486或WO02/22169申请中公开的方法进行测定。此外，通过WO02/22169申请中所描述的方法或实施例A中关于p105肽的详细描述的方法，可检测变体的将其N末端结构域转运至靶细胞的细胞溶质的能力。

百日咳博德特氏菌CyaA蛋白的全长野生型序列的变体是公知的；通过引用SEQ IDNO：4(欣氏博德特氏菌(Bordetella hinzii)CyaA蛋白)、SEQ ID NO：6(副百日咳博德特氏菌CyaA蛋白)和SEQ ID NO：8(支气管炎博德特氏菌CyaA蛋白)的序列，可提供这种变体的例证。编码SEQ ID NO：4、6和8的核苷酸序列，分别如SEQ ID NO：3、5和7所示，或者其为通过沉默突变的SEQ ID NOs：3、5和7的变体。本发明中，所述CyaA衍生蛋白质不包含SEQ ID NOs：2、4、6和8，或其不是由SEQ ID NOs：2、4、6和8构成。此外，编码本发明变体CyaA衍生蛋白的多核苷酸不包含SEQ ID NOs：3、5或7，或者其不是由SEQ ID NOs：3、5或7构成。

在一个本发明的特定实施方式中，编码变体CyaA衍生蛋白(优选此处所定义的百日咳博德特氏菌CyaA衍生蛋白的变体)的多核苷酸，是编码包含以下或由以下构成的多肽的多核苷酸：

(a)如SEQ ID NO：4、6或8所示的博德特氏菌CyaA蛋白的片段，所述片段的序列起始于SEQ ID NO：4、6或8的第一个残基，并终止于位于SEQ ID NO：4、6或8的第183位至第227位之间的一个残基，并且所述片段融合至

(b)分别如SEQ ID NO：4、6或8所示的博德特氏菌CyaA蛋白的片段，所述片段的序列起始于位于SEQ ID NO：4、6或8的第321位至第387位之间的一个残基，并终止于SEQ ID NO：4、6或8的最后一个残基。

以上针对包含SEQ ID NO：2片段的特定CyaA衍生蛋白的定义同样适用于包含SEQID NO：4和6片段的变体CyaA衍生蛋白。

关于包含SEQ ID NO：8片段的变体CyaA衍生蛋白，同样地，所有的定义也适用，除了SEQ ID NO：8的最后一个残基是残基1705而非残基1706。因此，对于包含SEQID NO：8片段的变体CyaA衍生蛋白，涉及残基1706的所有方面都必须由残基1705来代替。特别地，所述第二片段具有的小大范围为1319至1385个残基，并且优选1319个残基或1385个残基的长度。关于编码包含SEQ ID NO：8片段的变体CyaA衍生蛋白的多核苷酸，涉及核苷酸5118的所有定义和实施方式都必须由核苷酸5115所代替。

编码本发明变体CyaA衍生蛋白的特定多核苷酸选自包含以下或由以下构成的多核苷酸：

1)编码如SEQ ID NO：13所示多肽的多核苷酸；SEQ ID NO：13是由片段1融合至片段2构成，其中片段1由SEQ ID NO：4的残基1至227构成，片段2由SEQ ID NO：4的残基321至1706构成；

2)编码如SEQ ID NO：14所示多肽的多核苷酸；SEQ ID NO：14是由片段1融合至片段2构成，其中片段1由SEQ ID NO：4的残基1至183构成，片段2由SEQ ID NO：4的残基387至1706构成；

3)编码如SEQ ID NO：15所示多肽的多核苷酸；SEQ ID NO：15是由片段1融合至片段2构成，其中片段1由SEQ ID NO：6的残基1至227构成，片段2由SEQ ID NO：6的残基321至1706构成；

4)编码如SEQ ID NO：16所示多肽的多核苷酸；SEQ ID NO：16是由片段1融合至片段2构成，其中片段1由SEQ ID NO：6的残基1至183构成，片段2由SEQ ID NO：6的残基387至1706构成；

5)编码如SEQ ID NO：17所示多肽的多核苷酸；SEQ ID NO：17是由片段1融合至片段2构成，其中片段1由SEQ ID NO：8的残基1至227构成，片段2由SEQ ID NO：8的残基321至1705构成；以及

6)编码如SEQ ID NO：18所示多肽的多核苷酸；SEQ ID NO：18是由片段1融合至片段2构成，其中片段1由SEQ ID NO：8的残基1至183构成，并片段2由SEQ IDNO：8的残基387至1705构成。

编码本发明的CyaA衍生蛋白或变体CyaA衍生蛋白的多核苷酸也可被定义成全长编码博德特氏菌CyaA核苷酸序列的缺失版，即，对于编码一多肽(该多肽包含SEQ IDNO：2、4、6或8，或者由SEQ IDNO：2、4、6或8构成)的多核苷酸来说，其是缺失编码一多肽片段的所述多核苷酸，所述多肽片段的第一个氨基酸残基分别位于SEQ IDNO：2、4、6或8的残基184至残基228，最后一个氨基酸残基分别位于SEQ ID NO：2、4、6或8的残基320至残基386。在一个特定实施方式中，编码一多肽(该多肽包含SEQ ID NO：2、4、6或8，或者由SEQ IDNO：2、4、6或8构成)，其是缺失编码一多肽片段的多核苷酸，所述多肽片段的第一个氨基酸残基选自由以下残基构成的组：SEQID NO：2、4、6或8各自的残基184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227和228；并且该片段的最后一个氨基酸残基选自由以下残基构成的组：SEQ ID NO：2、4、6或8各自的残基320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385或386。

此处所述的制备编码本发明的CyaA衍生蛋白、特别是变体CyaA衍生蛋白的多核苷酸的方法也是本发明的一部分。该方法包括以下步骤：

(a)从编码如SEQ ID NO：2、4、6或8所示的博德特氏菌CyaA的多核苷酸中缺失所述序列中的连续核苷酸残基的核苷酸片段，其中，该核苷酸片段中，编码一个氨基酸残基的前3个核苷酸位于SEQ ID NO：2、4、6或8的残基184至残基228，并且编码一个氨基酸残基的最后3个核苷酸位于SEQ ID NO：2、4、6或8的残基320至残基386；以及

(b)回收所述多核苷酸。

或者，根据所寻求CyaA衍生蛋白的序列，使用常规方法可化学合成编码所述CyaA衍生蛋白的多核苷酸，并且可选地考虑遗传密码的简并性和/或表达的优化。

本发明还涉及通过此处所述的本发明多核苷酸而编码的CyaA衍生蛋白。特定CyaA衍生蛋白是由如SEQ ID NO：10、12、13、14、15、16、17、18、19和20所示的序列构成的。

在本发明的框架中，编码CyaA衍生蛋白(包括变体CyaA衍生蛋白)的多核苷酸用于制备本发明的嵌合多核苷酸以及异源多肽，其中，该嵌合多核苷酸编码嵌合蛋白，且该嵌合蛋白包含所述CyaA衍生蛋白或变体CyaA衍生蛋白，或者该嵌合蛋白是由所述CyaA衍生蛋白或变体CyaA衍生蛋白构成的，编码所述异源多肽的多核苷酸代替CyaA缺失的核苷酸片段。

因此，本发明涉及一种嵌合多核苷酸，即编码此处所定义的嵌合蛋白的多核苷酸，其中，此处所公开的每一个实施方式采用了涉及编码CyaA衍生蛋白的多核苷酸。

因此，本发明还涉及一种制备编码嵌合蛋白的多核苷酸的方法，包括：

(a)从编码如SEQ ID NO：2、4、6或8所示的博德特氏菌CyaA或者编码与SEQID NO：2具有至少95％相似性的变体的多核苷酸中，缺失一核苷酸片段，其中，该核苷酸片段中，编码一个氨基酸残基的前3个核苷酸位于SEQ ID NO：2、4、6或8的残基184至残基228，并且编码一个氨基酸残基的最后3个核苷酸位于SEQ ID NO：2、4、6或8的残基320至残基386；

(b)在(a)获得的多核苷酸中以及缺失核苷酸片段的位点上，插入编码异源多肽的多核苷酸；其中，步骤(a)和(b)可以任意顺序或同时进行；以及

(c)回收所述编码嵌合蛋白的多核苷酸。

本发明还涉及一种制备嵌合蛋白的方法，包括：

(a)从编码如SEQ ID NO：2、4、6或8所示的博德特氏菌CyaA或者编码与SEQID NO：2具有至少95％相似性的变体的多核苷酸中，缺失一核苷酸片段，其中，该核苷酸片段中，编码一个氨基酸残基的前3个核苷酸位于SEQ ID NO：2、4、6或8的残基184至残基228，并且编码一个氨基酸残基的最后3个核苷酸位于SEQ ID NO：2、4、6或8的残基320至残基386；

(b)在(a)获得的多核苷酸中以及缺失核苷酸片段的位点上，插入编码异源多肽的多核苷酸；其中，步骤(a)和(b)可以任意顺序或同时进行；

(c)在细胞中表达(b)获得的多核苷酸；以及

(d)回收所述表达的嵌合蛋白。

制备本发明嵌合蛋白的方法可进一步包括以下步骤：在嵌合多核苷酸构建体中，将步骤(b)获得的多核苷酸和编码CyaC蛋白的多核苷酸结合。在一个优选的实施方式中，在一个构建体中将步骤(b)获得的多核苷酸和和编码CyaC蛋白的多核苷酸的结合方式使得结合之后获得的嵌合多核苷酸包括或包含以下：从5'端至3'端，步骤(b)的多核苷酸构建体，随后的编码博德特氏菌菌株(特别是百日咳博德特氏菌菌株)的CyaC蛋白的多核苷酸构建体。

本发明中，当涉及“前三个核苷酸”或“最后三个核苷酸”时，应该理解，根据遗传密码，这三个核苷酸是指密码子，其对应位于SEQ ID NO：2、4、6或8中的位置确定的氨基酸残基。因此，多核苷酸的核苷酸缺失的大小为3的倍数。此外，除了大小为3的倍数，该多核苷酸的核苷酸缺失也在框架中，即通过缺失去除了所寻求的氨基酸残基，而没有修饰阅读框，也没有修饰所缺失的周围(上游和下游)残基。

缺失步骤和插入步骤的顺序并不重要，并且这两个步骤可以同时进行。

在所述方法的第一实施方式中，在插入步骤之前，进行缺失步骤。因此，一旦进行了所述片段的缺失，在缺失的核苷酸片段位点上插入编码异源多肽的多核苷酸。“在缺失的核苷酸片段位点上”是指在CyaA(对应于第一CyaA片段)的N末端侧和CyaA的C末端侧之间(对应于第二CyaA片段)之间，插入编码异源多肽的多核苷酸。插入的位点可被容易地识别，因为根据本发明，CyaA的N末端侧和C末端侧的序列都与SEQ IDNO：2、4、6或8或者变体的N末端部分和C末端部分的序列相同。

在第二个实施方式中，在缺失步骤之前，进行插入步骤。一旦识别了将被缺失的片段，编码异源多肽的多核苷酸插在编码将被缺失片段的第一个残基的3个核苷酸(密码子)上游(在5'端)或者插在编码将被缺失片段的最后一个残基的最后3个核苷酸(密码子)下游(在3'端)。一旦已经进行了编码异源多肽的多核苷酸的插入，将被缺失的片段从编码CyaA/异源多肽分子的多核苷酸中切除。

在第三个实施方式中，这两个缺失和插入的步骤可同时进行，也就是说，在单个反应步骤中，采用适当的限制性酶。

在所述方法的一个特定实施方式中，缺失步骤包含：从一个编码如SEQ ID NO：2、4、6或8所示的博德特氏菌CyaA的多核苷酸中，去除以下的核苷酸片段：

编码SEQ ID NO：2、4、6或8的残基228至320的核苷酸片段，或者编码SEQ IDNO：2、4、6或8的残基184至386的核苷酸片段，或者编码SEQ ID NO：2、4、6或8的残基228至386的核苷酸片段，或者编码SEQ ID NO：2、4、6或8或本发明所述的变体的残基184至320的核苷酸片段。

在另一个实施方式中，缺失步骤包含：从一个如SEQ ID NO：1、3、5或7或者SEQID NO：69所示的多核苷酸中，去除以下的核苷酸片段：

由SEQ ID NO：1、3、5或7或者SEQ ID NO：69的核苷酸682至960构成的核苷酸片段，或者由SEQ ID NO：1、3、5或7或者SEQ ID NO：69的核苷酸550至1158构成的核苷酸片段，或者如SEQ ID NO：1、3、5或7或者SEQ ID NO：69所示的多核苷酸，或者由SEQ ID NO：1、3、5或7或者SEQ ID NO：69的核苷酸682至1158构成的核苷酸片段，或者由SEQ ID NO：1、3、5或7或者SEQ ID NO：69的核苷酸550至960构成的核苷酸片段。

为了进行片段的缺失，技术人员将可能需要在编码CyaA的多核苷酸中进行较大的缺失，然后，当克隆编码异源多肽的多核苷酸以实现如上公开的缺失作为最终结果时，进行补偿。或者，根据所寻求嵌合蛋白的序列，使用常规方法，可化学合成编码本发明嵌合蛋白的嵌合多核苷酸，并且可选地考虑遗传密码的简并性和/或表达的优化。因此，所述化学合成的多核苷酸在细胞中表达，从而回收被表达的嵌合蛋白。

本发明还涉及一种编码嵌合蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸包含以下或由以下构成：从5'至3'，

(a)编码如SEQ ID NO：2所示的百日咳博德特氏菌CyaA蛋白片段的多核苷酸，所述片段的序列起始于SEQ ID NO：2的第一个残基，并终止于位于SEQ ID NO：2的第183位至第227位之间的一个残基；或者一个与所述片段具有至少95％相似性的变体；

(b)编码异源多肽的多核苷酸；以及

(c)编码如SEQ ID NO：2所示的百日咳博德特氏菌CyaA蛋白片段的多核苷酸，所述片段的序列起始于位于SEQ ID NO：2的第321位至第387位之间的一个残基，并终止于SEQ ID NO：2的最后一个残基；或者一个与所述片段具有至少95％相似性的变体。

以上对于CyaA衍生蛋白所描述的定义，涉及如SEQ ID NO：2所示的百日咳博德特氏菌CyaA蛋白片段，所述片段的序列起始于SEQ ID NO：2的第一个残基，并终止于位于SEQ ID NO：2的第183位至第227位之间的一个残基；关于如SEQ ID NO：2所示的百日咳博德特氏菌CyaA蛋白片段，所述片段的序列起始于位于SEQ ID NO：2的第321位至第387位之间的一个残基，并终止于SEQ ID NO：2的最后一个残基，同样适用于编码嵌合蛋白的多核苷酸的上下文中的这些片段。

以上关于具有至少95％相似性的变体所描述的定义同样适用于编码嵌合蛋白的多核苷酸的上下文中所描述的片段的变体。

在一个特定实施方式中，所述编码嵌合蛋白的多核苷酸是选自由以下构成的组：

1)一个多核苷酸，其包含以下或由以下构成：从5'至3'，(a)编码由SEQ ID NO：2、4或6的残基1至227构成的多肽片段的多核苷酸，(b)编码异源多肽的多核苷酸，以及(c)编码由SEQ ID NO：2、4或6的残基321至1706构成的多肽片段的多核苷酸；

2)一个多核苷酸，其包含以下或由以下构成：从5'至3'，(a)编码由SEQ ID NO：8的残基1至227构成的多肽片段的多核苷酸，(b)编码异源多肽的多核苷酸，以及(c)编码由SEQ ID NO：8的残基321至1705构成的多肽片段的多核苷酸；

3)一个多核苷酸，其包含以下或由以下构成：从5'至3'，(a)编码由SEQ ID NO：2、4或6的残基1至183构成的多肽片段的多核苷酸，(b)编码异源多肽的多核苷酸，以及(c)编码由SEQ ID NO：2、4或6的残基387至1706构成的多肽片段的多核苷酸；

4)一个多核苷酸，其包含以下或由以下构成：从5'至3'，(a)编码由SEQ ID NO：8的残基1至183构成的多肽片段的多核苷酸，(b)编码异源多肽的多核苷酸，以及(c)编码由SEQ ID NO：8的残基387至1705构成的多肽片段的多核苷酸；

5)一个多核苷酸，其包含以下或由以下构成：从5'至3'，(a)编码由SEQ ID NO：2、4或6的残基1至227构成的多肽片段的多核苷酸，(b)编码异源多肽的多核苷酸，以及(c)编码由SEQ ID NO：2、4或6的残基387至1706构成的多肽片段的多核苷酸；

6)一个多核苷酸，其包含以下或由以下构成：从5'至3'，(a)编码由SEQ ID NO：8的残基1至227构成的多肽片段的多核苷酸，(b)编码异源多肽的多核苷酸，以及(c)编码由SEQ ID NO：8的残基387至1705构成的多肽片段的多核苷酸；

7)一个多核苷酸，其包含以下或由以下构成：从5'至3'，(a)编码由SEQ ID NO：2、4或6的残基1至183构成的多肽片段的多核苷酸，(b)编码异源多肽的多核苷酸，以及(c)编码由SEQ ID NO：2、4或6的残基321至1706构成的多肽片段的多核苷酸；以及

8)一个多核苷酸，其包含以下或由以下构成：从5'至3'，(a)编码由SEQ ID NO：8的残基1至183构成的多肽片段的多核苷酸，(b)编码异源多肽的多核苷酸，以及(c)编码由SEQ ID NO：8的残基321至1705构成的多肽片段的多核苷酸。

在编码此处所定义的嵌合蛋白的任何多核苷酸的一个特定实施方式中，(a)多核苷酸被融合至(b)多核苷酸，其中，(b)多核苷酸自身被融合至(c)多核苷酸。

本发明中，编码异源多肽的多核苷酸的大小为3的倍数，以保持(c)多核苷酸的阅读框(例如，如SEQ ID NO：2所示的百日咳博德特氏菌CyaA蛋白的片段的阅读框，所述片段的序列起始于位于SEQ ID NO：2的第321位至第387位之间的一个残基，并终止于SEQ ID NO：2的最后一个残基，或者其变体)。

在本发明的特定实施方式中，所述嵌合多核苷酸还包括：在其3'末端的编码博德特氏菌菌株、特别是百日咳博德特氏菌菌株的CyaC蛋白的多核苷酸。

编码嵌合蛋白的多核苷酸可通过此处所描述的方法获得或得到。

本发明还涉及一种核酸载体，如质粒，其包含此处所定义的多核苷酸，即编码包括变体CyaA衍生蛋白的CyaA衍生蛋白的多核苷酸，或者编码嵌合蛋白的多核苷酸。在一个特定实施方式中，所述载体是表达载体，即一载体，其包含：

除明确提及的元件，所有必需的驱动本发明多核苷酸表达的元件(表达控制序列)，特别是转录调控元件。“转录调控元件”定义为涉及所述多核苷酸转录调节的任何DNA区域，并且其包括启动子，如用IPTG诱导的启动子，例如lac、tac或T7启动子，或者由温度变化诱导的启动子，例如噬菌体λpR或pL启动子、增强子或顺式作用调节元件。这些元件，特别是启动子，是根据被核酸载体转染的细胞性质来选择。根据所寻求的表达水平或被转染的细胞来确定合适的启动子，是本领域技术人员的一部分知识。在一个特定实施方式中，所述载体是质粒。适合于本发明载体制备的常规质粒的例子是pUC或pBR322。

在一个特定实施方式中，所述核酸载体还包括博德特氏菌菌株的CyaC编码序列，例如，如SEQ ID NO：21所示的百日咳博德特氏菌的cyaC基因。在另一个实施方式中，所述核酸载体还包括博德特氏菌菌株的CyaC编码序列的版本，其被优化以用于一个特定细胞类型中的更佳表达，特别是，被优化以用于大肠杆菌中的更佳表达。用于大肠杆菌的CyaC序列的优化版本如SEQ ID NO：22所示。

用于制备本发明所定义的嵌合蛋白的特定质粒是在材料和方法中所描述的质粒，并且其序列为如SEQ ID NO：59、62、65和68所示。通过此处所描述的编码异源多肽的多核苷酸，可去除和替换这四个质粒中所含的编码异源多肽的多核苷酸。因此，通过此处所描述的编码异源多肽的多核苷酸，可去除和替换起始于SEQ ID NO：59的质粒并包含在核苷酸904和1731之间的序列。或者，通过此处所描述的编码异源多肽的多核苷酸，可去除和替换起始于SEQ ID NO：62的质粒并包含在核苷酸772和1599之间的序列。或者，通过此处所描述的编码异源多肽的多核苷酸，可去除和替换起始于SEQ ID NO：65的质粒并包含在核苷酸904和1836之间的序列。或者，通过此处所描述的编码异源多肽的多核苷酸，可去除和替换起始于SEQ ID NO：68的质粒并包含在核苷酸772和1704之间的序列。

值得注意的是，当核酸载体包含一些多核苷酸时，所述转录调控元件(多个)可能对所有多核苷酸都是唯一的，或者通过其中的一些多核苷酸具有相同的转录调控元件或相反的，每种多核苷酸可与一个或一个以上的特定转录调节元件相关联。在后一种情况下，所述转录调控元件可以是相似的或不同的。

本发明还涉及包含此处所定义的多核苷酸的细胞(优选分离的)或细胞培养物，即该多核苷酸为编码包括变体CyaA衍生蛋白的CyaA衍生蛋白的多核苷酸，或者编码嵌合蛋白的多核苷酸，或者包含此处所定义的载体的细胞(优选分离的)或细胞培养物。在一个特定实施方式中，所述细胞或细胞培养物能被本发明的载体转染。

所述细胞可以是原核细胞或原核细胞形成的细胞培养物。在一个特定实施方式中，所述细胞适合于表达和/或制备重组蛋白。在一个特定实施方式中，所述细胞或细胞培养物是细菌或细菌培养物。在一个优选的实施方式中，所述细胞或细胞培养物是大肠杆菌菌株培养物，如BL21、BLR、TG1或HMS174菌株。

因此，本发明的细胞或细胞培养物表达本发明的多核苷酸，即其为编码包括变体CyaA衍生蛋白的CyaA衍生蛋白的多核苷酸，或者编码嵌合蛋白的多核苷酸，并且在适当的时候，同时为cyaC基因或cyaC基因的优化版本。

术语“CyaA”或“CyaA衍生蛋白”或“嵌合蛋白”包括，优选的是，所述博德特氏CyaA蛋白的翻译后修饰版本。因此，在一个特定实施方式中，本发明的所述“CyaA衍生蛋白质”或“嵌合蛋白”是通过其至少一个残基的翻译后酰化作用来进行修饰，特别是，对应于位于百日咳博德特氏菌、欣氏博德特氏菌或副百日咳博德特氏菌CyaA的全长序列中的第860位和第983位之间的残基中的赖氨酸残基中的至少两个中的一个，优选2个；或者对应于位于支气管炎博德特氏菌CyaA全长序列中的第859位和第982位之间的残基中的赖氨酸残基中的至少两个中的一个，优选2个。

对于“酰化”，此处是指棕榈酰化，即将棕榈酸酯和/或棕榈油酸基团加添加到本发明的CyaA、CyaA衍生蛋白或嵌合蛋白的(多个)残基。因此，所述“CyaA衍生蛋白”或“嵌合蛋白”在这些残基中的一些残基上带有棕榈酰基，优选在对应于位于百日咳博德特氏菌、欣氏博德特氏菌或副百日咳博德特氏菌CyaA的全长序列中的第860位和第983位之间的残基中的赖氨酸残基中的至少两个中的一个，优选在2个；或者对应于位于支气管炎博德特氏菌CyaA全长序列中的第859位和第982位之间的残基中的赖氨酸残基中的至少两个中的一个，优选在2个。“对应于”是指在本发明的CyaA衍生蛋白或嵌合蛋白中进行翻译后修饰的残基，其位置与百日咳博德特氏菌、欣氏博德特氏菌或副百日咳博德特氏菌的CyaA(分别如SEQ ID NO：2、4和6所示)序列中的第860位赖氨酸和第983位赖氨酸相匹配，或者与支气管炎博德特氏菌CyaA(SEQ ID NO：8)序列中的第859位赖氨酸和第982位赖氨酸相匹配。通过SEQ ID NO：2、4、6或8所定义的序列，比对和比较本发明蛋白序列，本领域技术人员可以识别本发明蛋白中的这些赖氨酸残基。

棕榈酰化的过程可通过博德特氏菌种类的cyaC基因(优选百日咳博德特氏菌菌CyaC编码序列，其天然序列如SEQ ID NO：21所示)介导。优化的用于大肠杆菌中生产的CyaC编码序列的版本如SEQ ID NO：22所示。通过编码CyaA蛋白的多核苷酸、编码本发明CyaA衍生蛋白的多核苷酸或者编码本发明嵌合蛋白的多核苷酸以及cyaC基因的共表达，可获得这种或这些翻译后修饰。

在一个特定实施方式中，表达CyaA和CyaC蛋白的本发明多核苷酸构建体包含：从5'端至3'端，cyaA多核苷酸或基因，优选其由用于在确定的宿主细胞(例如大肠杆菌)中表达的优化序列以及cyaC多核苷酸或基因构成的，优选其由用于在确定的宿主细胞(例如大肠杆菌)中表达的优化序列构成的。这种在构建体中的多核苷酸的插入顺序有利于表达各自数量的CyaA和cyaC蛋白以及适合CyaA翻译后修饰版本的表达效率增加的构象。

在本发明的特定实施方式中，除了在此处所公开的野生型博德特氏菌CyaA蛋白中进行片段[其第一氨基酸残基分别位于SEQ ID NO：2、4、6或8中的残基184至残基228，并且其最后一个氨基酸残基分别位于SEQ ID NO：2、4、6或8中的残基320至残基386]的缺失，与SEQ ID NO：2、4、6或8相比，本发明的CyaA衍生蛋白或嵌合蛋白的CyaA部分并不经过任何其它的改变(增加、缺失和/或替换)。

有趣的是，本发明的CyaA衍生蛋白和嵌合蛋白是无细胞毒性的，即随着一片段的缺失，它们的酶活性已经被灭活，其中，该片段的第一氨基酸残基分别位于SEQ ID NO：2、4、6或8中的残基184至残基228，且其最后一个氨基酸残基分别位于SEQ ID NO：2、4、6或8中的残基320至残基386。因此，一个特定实施方式中，不进行插入、缺失或替换。特别是，当CyaA的残基188和189仍然存在于本发明的蛋白质时，在残基188和189之间没有二肽(如二肽LQ或GS)的插入。

本发明还涉及一种嵌合蛋白质，其是通过本发明的多核苷酸所编码的，并由本发明的载体表达或通过本发明的细胞培养物制备。

本发明的嵌合蛋白包含以下或由以下构成：

从N末端到C末端，(a)如SEQ ID NO：2所示的百日咳博德特氏菌CyaA蛋白的片段，所述片段的序列起始于SEQ ID NO：2的第一个残基并终止于位于SEQ ID NO：2的第183位至第227位之间的一个残基；或者与该片段具有至少95％相似性的变体；(b)异源多肽；以及(c)如SEQ ID NO：2所示的百日咳博德特氏菌CyaA蛋白的片段，所述片段的序列起始于位于SEQ ID NO：2的第321位至第387位之间的一个残基并终止于SEQ ID NO：2的最后一个残基；或者与该片段具有至少95％相似性的变体。

以上所描述的对于CyaA衍生蛋白的定义，涉及如SEQ ID NO：2所示的百日咳博德特氏菌CyaA蛋白的片段、所述片段的序列起始于SEQ ID NO：2的第一个残基并终止于位于SEQ ID NO：2的第183位至第227位之间的一个残基，并且涉及如SEQ ID NO：2所示的百日咳博德特氏菌CyaA蛋白的片段、所述片段的序列起始于位于SEQ ID NO：2的第321位至第387位之间的一个残基并终止于SEQ ID NO：2的最后一个残基，同样适用于上下文中的编码嵌合蛋白的多核苷酸的这些片段。

以上关于具有至少95％相似性的变体所描述的定义，同样适用于上下文中嵌合蛋白所描述的片段。

因此，本发明还涉及一种嵌合蛋白，其包含以下或由以下构成：

1)从N末端至C末端，(a)由SEQ ID NO：2、4或6的残基1至227构成的片段，(b)异源多肽，以及(c)由SEQ ID NO：2、4或6的残基321至1706构成的片段；

2)从N末端至C末端，(a)由SEQ ID NO：8的残基1至227构成的片段，(b)异源多肽，以及(c)由SEQ ID NO：8的残基321至1705构成的片段；

3)从N末端至C末端，(a)由SEQ ID NO：2、4或6的残基1至183构成的片段，(b)异源多肽，以及(c)由SEQ ID NO：2、4或6的残基387至1706构成的片段；以及

4)从N末端至C末端，(a)由SEQ ID NO：8的残基1至183构成的片段，(b)异源多肽，以及(c)由SEQ ID NO：8的残基387至1705构成的片段。

在此处定义的嵌合蛋白的一个特定实施方式中，(a)片段被融合至(b)异源多肽中，该(b)异源多肽自身被融合至(c)片段。

关于“嵌合”，是指包含或由以下构成的蛋白：此处所定义的源自博德特氏菌CyaA的片段、以及非源自博德特氏菌CyaA的多肽。因此，所述多肽是所述异源的，即其整个序列与博德特氏菌CyaA的一部分不相同，特别是，如SEQ ID NO：2、4、6或8所示的CyaA的一部分；在一个特定实施方式中，这种异源多肽的整个序列并不与博德特氏菌CyaA的一部分相似，特别是，如SEQ ID NO：2、4、6或8所示的CyaA的一部分，即其序列具有的相似性小于博德特氏菌CyaA的一部分的80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％或小于20％，特别是与如SEQ ID NO：2、4、6或8所示的CyaA蛋白的一部分；通过比较异源多肽的序列和同等大小的博德特氏菌CyaA的部分(异源多肽和博德特氏菌CyaA部分具有相同尺寸)，可计算该定义的所述相似性。在一个特定实施方式中，此处所定义的异源肽的序列和来自博德特氏菌CyaA的部分(或片段)的序列，并不享有超过7个连续氨基酸残基的一致性(100％的相似性)。

在一个特定实施方式中，异源多肽具有的大小范围为9至500个氨基酸残基，特别是9至400个残基、9至300个残基、9至200个残基、9至100个残基、20至500个残基、20至400个残基、20至300个残基、20至200个残基、20至100个残基、50至500个残基、50至400个残基、50至300个残基、50至200个残基、50至100个残基、100至500个残基、100到400个残基、100至300个残基或100至200个残基。假如编码异源多肽的核苷酸的大小(核苷酸数)为3的倍数，那么该多核苷酸的大小范围为27至1500个核苷酸，特别是27至1200个核苷酸、27至900个核苷酸、27至600个核苷酸、27至300个核苷酸、60至1500个核苷酸、60至1200个核苷酸、60至900个核苷酸、60至600个核苷酸、60至300个核苷酸、150至1500个核苷酸、150至1200个核苷酸、150至900个核苷酸、150至600个核苷酸、150至300个核苷酸、300至1500个核苷酸、300至1200个核苷酸、300至900个核苷酸或300至600个核苷酸。

在一个特定实施方式中，异源多肽、优选以上定义的大小范围的组合，具有负静电荷，即该异源多肽是酸性的。在另一个实施方式中，该异源多肽的片段具有负静电荷，即所述异源多肽的片段是酸性的。异源多肽的片段被定义成具有一个连续氨基酸残基的串联，其大小为整个异源多肽大小的10％至40％，优选15％至30％。

特别是，静电荷被定义为异源多肽中所含的赖氨酸和精氨酸残基的数量减去天冬氨酸和谷氨酸残基的数量。在一个实施方式中，异源多肽的静电荷等于-1或小于-1，特别是等于或小于-2、-3、-4、-5、-10、-15、-20、-30、-40、-45或-50。在一个特定实施方式中，优选与前句话序列值中的一个进行组合，所述异源多肽的静电荷不小于-55、-60、-70或-80。换言之，该异源多肽的静电荷的范围为-55至-1、-50至-2或-40至-3。作为比较，经典的OVA表位(SIINFEKL)的静电荷为0。

此处，对在本发明的嵌合蛋白内被测试的一些异源多肽的例子进行了报道：

-肽216(SEQ ID NO：34)，在嵌合蛋白Btpr_114和Btpr_116中进行了测试，具有-16的静电荷；

-肽217(SEQ ID NO：36)，在嵌合蛋白Btpr_115和Btpr_117中进行了测试，具有-37的静电荷；

-肽233(SEQ ID NO：38)，在嵌合蛋白Btpr_143和Btpr_144中进行了测试，具有-13的静电荷；

-肽234(SEQ ID NO：40)，在嵌合蛋白Btpr_145和Btpr-146中进行了测试，具有-38的静电荷；

-肽326(SEQ ID NO：42)，在嵌合蛋白Btpr_161和Btpr_169中进行了测试，具有-11的静电荷；

-肽327(SEQ ID NO：46)，在嵌合蛋白Btpr_162和Btpr_170中进行了测试，具有-10的静电荷；

-肽328(SEQ ID NO：50)，在嵌合蛋白Btpr_163和Btpr_171中进行了测试，具有-18的静电荷；

-肽329(SEQ ID NO：54)，在嵌合蛋白Btpr_164和Btpr_172中进行了测试，具有-19的静电荷；

-肽330(SEQ ID NO：44)，在嵌合蛋白Btpr_165和Btpr_173中进行了测试，具有-30的静电荷；

-肽331(SEQ ID NO：48)，在嵌合蛋白Btpr_166和Btpr_174中进行了测试，具有-30的静电荷；

-肽332(SEQ ID NO：52)，在嵌合蛋白Btpr_167和Btpr_175中进行了测试，具有-45的静电荷；以及

-肽333(SEQ ID NO：56)，在嵌合蛋白Btpr_168和Btpr_176中进行了测试，具有-46的静电荷。

在一个特定实施方式中，所述异源多肽包含一个或几个抗原或者由一个或几个抗原构成，每个抗原包含一个或几个此处所定义的表位。本发明中，抗原被定义为一种多肽，其能够引发针对包含在该多肽(免疫原性多肽)中的一个或几个表位的免疫应答，特别是T细胞免疫应答。抗原是细胞或病毒来源的全长抗原多肽，该全长抗原多肽的片段能引发针对该片段中所含的抗原决定簇的免疫应答、特别是T细胞免疫应答；或者，如果合成的多肽能引发针对该合成的多肽所含的抗原决定簇的T细胞免疫应答，该抗原是一个合成的非天然的多肽，其带有由融合在一起的一些抗原多肽部分构成的表位，或者该抗原是一个合成的非天然的多肽，其是由一些融合在一起的抗原多肽的一部分或一些部分构成。

因此，所述异源多肽带有、包含至少一个表位或由至少一个表位构成，优选至少一个的CD8⁺表位和/或至少一个CD4⁺表位。关于“至少”，是指一个或多个表位。此处将表位定义为涉及引发或诱导细胞介导的免疫应答(特别是T细胞免疫应答)的的任何氨基酸序列，并且其是线性或构象的。因此，此处所描述的表位包括那些在宿主中通过APC(抗原呈递细胞)进行处理的表位，特别是与I类MHC(主要组织相容性复合物)分子相联合而识别的T表位，如靶细胞是CD8⁺T淋巴细胞的表位，或者与II类MHC分子相联合而识别的T表位，如那些靶细胞是CD4⁺T淋巴细胞的表位。本发明中的表位优选具有的大小范围为9至17个残基，更优选9至12个残基。此处所描述的表位也涉及体液应答的B表位。

本发明人已设计了包括各种来源的一些抗原的一个特定异源多肽。该异源多肽带有抗原，其包括鼠类和人的MHCⅠ类(CD8应答)和MHC II类(CD4应答)限制性T细胞表位：GFP11、MOG_35-55、OVA_257-264、IE_191-110、CLA4、HA_512-520、OVA_323-339、MELAN-A_26-35、HA_307-319、LCMV GP_33-41、MAGEA3_111-180、MAGEA3_244-285、HPV16E7片段和HPV18E7片段。这种抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示，并且其是本发明的一部分。

在一个特定实施方式中，所述异源多肽包含或由以下构成：至少一种抗原或至少一个表位；所述至少一种抗原或至少一个表位为病毒来源。因此，所述的至少一种抗原或至少一个表位来源于HIV、HBV、HCV、腺病毒、EBV、疱疹病毒、HTLV.1病毒和CMV。在一个特定实施方式中，所述的至少一种抗原或至少一个表位来源于HPV。在一个特定实施方式中，所述异源多肽、至少一种抗原或至少一个表位并不来源于HPV。在一个特定实施方式中，当多肽包含数量大于1的表位或数量大于1的抗原，或者该多肽由数量大于1的表位或数量大于1的抗原构成时，这些表位或抗原来自同一目、同一群、同一科、同一亚科、同属或同一物种和/或来自不同的目、不同的群、不同的科、不同的亚科、不同的属或不同的物种。

在一个特定实施方式中，所述异源多肽包含以下或由以下构成：至少一种抗原或至少一个表位；所述至少一种抗原或至少一个表位为细胞来源。因此，所述至少一种抗原或至少一个表位来源于原核生物或真核生物细胞。

在一个实施方式中，所述至少一种抗原或至少一个表位来源于细菌、真菌或寄生虫，例如但不限于衣原体、疟原虫、念珠菌、利什曼原虫或结核分枝杆菌。在一个特定实施方式中，所述至少一种抗原或至少一个表位并不来自博德特氏菌菌株。在另一个特定实施方式中，所述至少一种抗原或至少一个表位来源于博德特氏菌菌株的抗原，但其并不是CyaA。在一个特定实施方式中，当该多肽包含以下或由以下构成时：数量大于1的表位或数量大于1的抗原；这些表位或抗原来自同一细菌、同一真菌或同一寄生虫。在另一个实施方式中，当该多肽包含以下或由以下构成时：数量大于1的表位或数量大于1的抗原；这些表位或抗原来自不同的细菌、不同的真菌或不同的寄生虫。

在另一个实施方式中，所述至少一种抗原或至少一个表位来源于哺乳动物细胞。在一个特定实施方式中，所述至少一种抗原或至少一个表位来自一个肿瘤抗原，即由肿瘤或癌细胞表达的肽，并且该肿瘤为自身或由病原体诱发；在一个特定实施方式中，肿瘤抗原是自身的，特别是人类来源的。术语“肿瘤抗原”包括以下的肿瘤抗原组，并且本发明的嵌合蛋白中所含的异源多肽可选自以下组中的至少一个：

(a)癌胚肿瘤抗原；

(b)肿瘤病毒性肿瘤抗原；

(c)过表达/积累的肿瘤抗原，其表达于多种正常组织并在肿瘤中过表达；

(d)共享的肿瘤特异性抗原或癌症-睾丸抗原，其表达于许多肿瘤中，但不在正常组织(包括BAGE族、GAGE族、MAGE族、SAGE族和XAGE族)中表达；

(e)谱系限制性肿瘤抗原；

(F)突变的肿瘤抗原，由普遍被表达的基因中的点突变而引起；以及

(g)分化肿瘤抗原，表达于肿瘤起源的正常组织，但不属于肿瘤特异性。

当本发明的异源多肽包含多个抗原时，这些抗原是融合的、或由肽连接子分开、或者至少两种所述的抗原融合，而至少两种所述抗原被连接子分开。在一个特定实施方式中，所述肽连接子的大小范围为2至10个残基。该连接子可以被添加到分离的抗原和/或改善免疫应答。

在一个特定实施方式中，所述异源多肽包含以下或由以下构成：至少一种抗原或至少一个表位；所述至少一种抗原或至少一个表位来源于HPV。在一个特定实施方式中，所述异源多肽包含以下或由以下构成：来源于HPV的2、3、4、5、6、7、8、9或10种抗原。在一个优选的实施方式中，所述异源多肽包含至少3种HPV抗原，每种HPV抗原来源于不同的HPV类型。在一个特定实施方式中，所述HPV抗原包括以下或由以下构成：至少一个表位；优选至少一个CD8⁺表位和/或至少一个CD4⁺表位。

因此，本发明涉及一种嵌合蛋白，其包含以下或由以下构成，从N末端到C末端：

(a)如SEQ ID NO：2所示的百日咳博德特氏菌CyaA蛋白的片段，所述片段的序列起始于SEQ ID NO：2的第一个残基，并终止于位于SEQ ID NO：2的第183位至第227位之间的一个残基；或者与该片段具有至少95％相似性的变体；

(b)异源多肽，其包含至少3种HPV抗原，每种HPV抗原来自不同的HPV类型；以及

(c)如SEQ ID NO：2所示的百日咳博德特氏菌CyaA蛋白的片段，所述片段的序列起始于位于SEQ ID NO：2的第321位至第387位之间的一个残基，并终止于SEQ IDNO：2的最后一个残基；或者与该片段具有至少95％相似性的变体。

以上所描述的对于CyaA衍生蛋白的定义，涉及如SEQ ID NO：2所示的百日咳博德特氏菌CyaA蛋白的片段、所述片段的序列起始于SEQ ID NO：2的第一个残基并终止于位于SEQ ID NO：2的第183位至第227位之间的一个残基，并且涉及如SEQ ID NO：2所示的百日咳博德特氏菌CyaA蛋白的片段、所述片段的序列起始于位于SEQ ID NO：2的第321位至第387位之间的一个残基并终止于SEQ ID NO：2的最后一个残基，同样适用于编码上下文中嵌合蛋白的多核苷酸的这些片段。

以上关于具有至少95％相似性的变体所描述的定义，同样适用于上下文中所描述的嵌合蛋白的片段。同理，涉及所述异源多肽的定义适用于定义编码所述异源多肽的多核苷酸。

在一个特定实施方式中，本发明的嵌合蛋白包含以下或者由以下构成：

1)从N末端至C末端，(a)由SEQ ID NO：2、4或6的残基1至227构成的片段，(b)异源多肽，其包含至少3种HPV抗原，并且每种HPV抗原来自不同的HPV类型，以及(c)由SEQ ID NO：2、4或6的残基321至1706构成的片段；

2)从N末端至C末端，(a)由SEQ ID NO：8的残基1至227构成的片段，(b)异源多肽，其包含至少3种HPV抗原，并且每种HPV抗原来自不同的HPV类型，以及(c)由SEQ ID NO：8的残基321至1705构成的片段；

3)从N末端至C末端，(a)由SEQ ID NO：2、4或6的残基1至183构成的片段，(b)异源多肽，其包含至少3种HPV抗原，并且每种HPV抗原来自不同的HPV类型，以及(c)由SEQ ID NO：2、4或6的残基387至1706构成的片段；

4)从N末端至C末端，(a)由SEQ ID NO：8的残基1至183构成的片段，(b)异源多肽，其包含至少3种HPV抗原，并且每种HPV抗原来自不同的HPV类型，以及(c)由SEQ ID NO：8的残基387至1705构成的片段；

5)从N末端至C末端，(a)由SEQ ID NO：2、4或6的残基1至227构成的片段，(b)异源多肽，其包含至少3种HPV抗原，并且每种HPV抗原来自不同的HPV类型，以及(c)由SEQ ID NO：2、4或6的残基387至1706构成的片段；

6)从N末端至C末端，(a)由SEQ ID NO：8的残基1至227构成的片段，(b)异源多肽，其包含至少3种HPV抗原，并且每种HPV抗原来自不同的HPV类型，以及(c)由SEQ ID NO：8的残基387至1705构成的片段；

7)从N末端至C末端，(a)由SEQ ID NO：2、4或6的残基1至183构成的片段，(b)异源多肽，其包含至少3种HPV抗原，并且每种HPV抗原来自不同的HPV类型，以及(c)由SEQ ID NO：2、4或6的残基321至1706构成的片段；以及

8)从N末端至C末端，(a)由SEQ ID NO：8的残基1至183构成的片段，(b)异源多肽，其包含至少3种HPV抗原，并且每种HPV抗原来自不同的HPV类型，以及(c)由SEQ ID NO：8的残基321至1705构成的片段。

表述“HPV类型”包括任何的HPV类型，尤其是选自以下属的HPV类型：α-乳头瘤病毒、β-乳头瘤病毒、γ-乳头瘤病毒、δ-乳头状瘤病毒、ε-乳头瘤病毒，ζ-乳头瘤病毒、η-乳头瘤病毒、θ-乳头瘤病毒、ι-乳头瘤病毒、κ-乳头瘤病毒、λ-乳头瘤病毒、μ-乳头瘤病毒、ν-乳头瘤病毒、ξ-乳头瘤病毒、ο-乳头瘤病毒和π-乳头瘤病毒。在一个特定实施方式中，具有人趋性的乳头瘤病毒(例如，来自以下属的类型：α-乳头瘤病毒、β-乳头瘤病毒、γ-乳头瘤病毒、μ-乳头瘤病毒或ν-乳头瘤病毒)是优选的。在一个特定实施方式中，所述异源多肽包含以下或由以下构成：来自α-乳头瘤病毒属的HPV类型的抗原；特别是来自乳头瘤病毒属的HPV 7型和9型的类型^[17]。因此，所述异源多肽包含以下或由以下构成：来自HPV的高度致癌型物种(如HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52或HPV58)的抗原。

在包含(多个)HPV抗原或表位的嵌合蛋白的一个特定实施方式中，包含在所述异源多肽中的所述抗原选自以下：HPV的E1、E2、E4、E5、E6和E7蛋白或其任意的抗原性片段中的一个或多个。

在一个特定实施方式中，包含在所述异源多肽中的所述抗原为一个HPV类型的E7蛋白，或者包含在所述异源多肽中的所述抗原为不同HPV类型的E7蛋白或该E7蛋白的任意抗原性片段(也称为E7片段)。在一个优选的实施方式中，E7蛋白或其片段来自HPV16型(SEQ ID NO：25)、HPV18型(SEQID NO：26)、HPV31型(SEQ IDNO：27)、HPV33型(SEQ ID NO：28)、HPV45型(SEQ ID NO：29)、HPV52型(SEQ ID NO：30)或HPV58型(SEQID NO：32)。为了去除在HPV52型(如SEQ IDNO：30所示)的E7蛋白中被本发明人所识别的天然人类自身免疫表位，第84位和第86位上的氨基酸残基被替换(在第84位上，M->L；在第86位上，L->M)；该修饰的HPV52型的E7蛋白的序列如SEQ ID NO：31所示，并且其作为本发明的一部分。

在一个特定实施方式中，所述异源多肽包含以下或由以下构成：一个HPV类型的E7蛋白的至少3个片段(抗原性片段)，或来自不同HPV类型的E7蛋白的至少3个片段。在该实施方式中，假如在这些3、4、5、6、7、8、9或10个片段中，至少3个片段来源于不同的HPV类型，“至少3个片段”是指3、4、5、6、7、8、9或10个片段。在一个优选的实施方式中，所述异源多肽包含6个E7片段或者由6个E7片段构成，其中的3个来源于三种不同的HPV类型。在另一个优选的实施方式中，所述异源多肽包含8个E7片段或由8个E7片段构成，其中的4个来源于四种不同的HPV类型。

在一个特定实施方式中，所有的E7片段来源于不同的HPV类型。在另一个实施方式中，只有一些E7片段(至少3个)来源于不同的HPV类型，其它E7片段都来源于所述不同HPV类型中的一种、来源于所述不同HPV类型中的两种、所述不同HPV类型中的三种、来源于所述不同HPV类型中的四种或者来源于所述不同HPV类型中的五种。在一个特定实施方式中，所述异源多肽包含以下或由以下构成：E7蛋白的至少4个片段，来源于不同HPV类型的E7蛋白的这些E7片段中的至少3个，以及来源于一个HPV类型的相同E7蛋白的这些E7片段中的至少2个(1个E7片段同时存在于不同HPV类型的E7片段组中以及一个相同HPV类型的E7片段组中)。作为一个非限制性的例子，对于一个带有HPV类型的6个E7片段的异源多肽，可发现以下的组合：

a)来自第一HPV类型的1个E7片段、来自第二HPV类型的1个E7片段以及来自第三HPV类型的4个E7片段；

b)来自第一HPV类型的1个E7片段、来自第二HPV类型的2个E7片段以及来自第三HPV类型的3个E7片段；以及

c)来自第一HPV类型的2个E7片段、来自第二HPV类型的2个E7片段以及来自第三HPV类型的2个E7片段。

在一个特定实施方式中，所述HPV类型的E7片段由E7蛋白的N末端部分或E7蛋白的C末端部分构成。

关于“E7的N末端部分”，是指一个片段，其序列为E7蛋白的至少前25％、前30％、前35％、前40％，并且最多为起始于第一个N末端氨基酸残基的E7蛋白的氨基酸残基长度的前50％。因此，关于“前25％”，是指一种多肽，其序列起始于E7蛋白的残基1，并终止于对应于全长E7蛋白大小中的25％的残基。在一个特定实施方式中，一个由所述E7蛋白的N末端部分构成的片段，是由以下的序列构成的：其范围为所述E7蛋白的前28％至前31％。在另一个实施方式中，由所述E7蛋白的N末端部分构成的片段，是由以下的序列构成的：其范围为所述E7蛋白的前31％至前41％。特定实施方式是一个由SEQ ID NO：25的残基1至29构成的片段、一个由SEQ ID NO：26的残基1至31构成的片段、一个由SEQ ID NO：27的残基1至28构成的片段、一个由SEQ IDNO：28的残基1至29构成的片段、一个由SEQ ID NO：29的残基1至32构成的片段、一个由SEQ ID NO：31的残基1至29构成的片段或一个由SEQ ID NO：32的残基1至29构成的片段。其它实施方式是一个由SEQ ID NO：25的残基1至34构成的片段、一个由SEQ ID NO：26的残基1至42构成的片段、一个由SEQ ID NO：27的残基1至32构成的片段、一个由SEQ ID NO：28的残基1至31构成的片段、一个由SEQ ID NO：29的残基1至37构成的片段、一个由SEQ ID NO：31的残基1至31构成的片段或一个由SEQ ID NO：32的残基1至31构成的片段。

关于“E7的C末端部分”，是指一个片段，其序列为起始于最后一个氨基酸残基的E7蛋白的氨基酸残基长度的至少最后25％、最后30％、最后40％、最后50％、最后60％，并最多为E7蛋白的最后70％或最后80％。关于“最后25％”，是指一个多肽，其序列终止于E7蛋白的最后一个残基，并且起始于对应于全长E7蛋白大小的25％的残基。在一个特定实施方式中，一个由所述E7蛋白的C末端部分构成的片段，是由以下的序列构成的：其范围为所述E7蛋白的最后55％至最后61％。在另一实施方式中，一个由所述E7蛋白的C末端部分构成的片段，是由以下的序列构成的：其范围为所述E7蛋白的最后60％至最后70％。特定实施方式是一个由SEQ ID NO：25的残基43至98构成的片段、一个由SEQ ID NO：26的残基43至105构成的片段、一个由SEQ ID NO：27的残基42至98构成的片段、一个由SEQ ID NO：28的残基43至97构成的片段、一个由SEQ ID NO：29的残基44至106构成的片段、一个由SEQ ID NO：31的残基45至99构成的片段或者一个由SEQ ID NO：32的残基44至98构成的片段。其它实施方式是一个由SEQ ID NO：25的残基35至98构成的片段、一个由SEQ ID NO：26的残基43至105构成的片段、一个由SEQ ID NO：27的残基33至98构成的片段、一个由SEQ IDNO：28的残基32至97构成的片段、一个由SEQ ID NO：29的残基38至106构成的片段、一个由SEQ ID NO：31的残基32至99构成的片段或者一个由SEQ ID NO：32的残基32至98构成的片段。

在一个特定实施方式中，所述异源多肽包含此处所定义的相同HPV类型的E7蛋白的N末端片段和C末端片段。在一个特定实施方式中，当所述异源多肽包含相同HPV类型(未融合)的E7蛋白的N末端片段和C末端片段时，N末端部分的大小与C末端部分的大小的总和不超过全长E7蛋白的大小。

在另一实施方式中，所述异源多肽包含：此处所定义的第一HPV类型的E7蛋白的N末端片段和C末端片段，此处所定义的第二HPV类型的E7蛋白的N末端片段和C末端片段，此处所定义的第三HPV类型的E7蛋白的N末端片段和C末端片段，以及可选地此处所定义的第四HPV类型的E7蛋白的N末端片段和C末端片段。这些N末端和C末端片段可在所述多肽分别进行分组。此外，它们在天然E7蛋白中的位置可被颠倒，C末端片段位于自N末端的上游。

因此，本发明的嵌合蛋白包括一个外源多肽，其包含以下或由以下构成，从N末端至C末端：

(i)第一HPV类型的E7蛋白的C末端部分、第二HPV类型的E7蛋白的C末端部分、第三HPV类型的E7蛋白的C末端部分、可选地第四HPV类型的E7蛋白的C末端部分；以及

(ii)所述第一HPV类型的E7蛋白的N末端部分、所述第二HPV类型的E7蛋白的N末端部分、所述第三HPV类型的E7蛋白的N末端部分以及可选地所述第四HPV类型的E7蛋白的N末端部分。

以上所定义的术语“可选地”是指HPV的第四价的存在。因此，嵌合蛋白包含：以上所定义的第一、第二和第三HPV的E7蛋白的这两个C末端部分和N末端部分，以及可选地不同HPV的第四E7蛋白的C末端部分和N末端部分。

在一个特定实施方式中，不同的E7片段为融合的、或通过肽连接子被分离、或至少两个E7片段被融合而至少两个E7片段被肽连接子分离。在一个特定实施方式中，所述肽连接子的大小范围为2至10个残基。在一个特定实施方式中，所述连接子是二肽AS。所述连接子可被添加，以分离每个片段或一些片段，和/或改善免疫应答。在一个特定实施方式中，二肽AS直接被加在HPV的E7片段的C末端部分的上游。在一个特定实施方式中，二肽AS直接被加在HPV18型的E7片段的C末端部分的上游，特别是，仅在该片段的上游。

本发明的一个特定嵌合蛋白包含一个异源多肽或由一个异源多肽构成；该异源多肽，从N末端至C末端，由以下构成：

第一HPV类型的E7蛋白的C末端部分，融合至第二HPV类型的E7蛋白的C末端部分，融合至第三HPV类型的E7蛋白的C末端部分，融合至所述第一HPV类型的E7蛋白的N末端部分，融合至所述第二HPV类型的E7蛋白的N末端部分，融合至所述第三HPV类型的E7蛋白的N末端部分。

本发明的另一个特定嵌合蛋白包含一个异源多肽或由一个异源多肽构成；该异源多肽，从N末端至C末端，由以下构成：

第一HPV类型的E7蛋白的C末端部分，融合至第二HPV类型的E7蛋白的C末端部分，融合至第三HPV类型的E7蛋白的C末端部分，融合至第四HPV类型的E7蛋白的C末端部分，融合至所述第一HPV类型的E7蛋白的N末端部分，融合至所述第二HPV类型的E7蛋白的N末端部分，融合至所述第三HPV类型的E7蛋白的N末端部分，融合至所述第四HPV类型的E7蛋白的N末端部分。

在此处所描述的嵌合蛋白的一个特定实施方式中，所述第一、第二和第三HPV类型是HPV16、HVP18和HPV45型。在一个特定实施方式中，所述第一、第二和第三HPV类型是是HPV16、HVP18和HPV45型，并且AS二肽被直接加在HPV18型的E7片段的C末端部分的上游。在另一个实施方式中，所述第一、第二和第三HPV类型是HPV31、HPV52和HPV58型。在另一个实施方式中，所述第一、第二和第三HPV类型是HPV31、HVP33和HPV52型。在另一个实施方式中，所述第一、第二、第三和第四HPV类型是HPV31、HPV33、HPV52和HPV58型。在另一个实施方式中，所述第一、第二、第三和第四HPV类型是HPV16、HVP18、HPV33和HPV45型。在另一个实施方式中，所述第一、第二、第三和第四HPV类型是HPV16、HVP18、HPV45和HPV58型。在另一个实施方式中，所述第一、第二、第三和第四HPV类型是HPV16、HVP18、HPV33和HPV45型，并且AS二肽被直接加在HPV18型的E7片段的C末端部分的上游。在另一个实施方式中，所述第一、第二、第三和第四HPV类型是HPV16、HVP18、HPV45和HPV58型，并且AS二肽被直接加在HPV18型的E7片段的C末端部分的上游。

在一个特定实施方式中，一个HPV类型的E7蛋白的N末端部分由一个序列构成，该序列的范围为E7蛋白的前28％至前31％；并且所述相同HPV类型的E7蛋白的C末端部分由一个序列构成，该序列的范围为E7蛋白的最后55％至最后61％。相同HPV类型的E7蛋白的N末端部分/C末端部分的例子，无论什么情况，它们的排列都在所述异源多肽之内，特别是，根据此处所描述的排列，其如下：

-SEQ ID NO：25的残基1至29/SEQ ID NO：25的残基43至98；

-SEQ ID NO：26的残基1至31/SEQ ID NO：26的残基43至105；

-SEQ ID NO：27的残基1至28/SEQ ID NO：27的残基42至98；

-SEQ ID NO：28的残基1至29/SEQ ID NO：28的残基43至97；

-SEQ ID NO：29的残基1至32/SEQ ID NO：29的残基44至106；

-SEQ ID NO：31的残基1至29/SEQ ID NO：31的残基45至99；以及

-SEQ ID NO：32的残基1至29/SEQ ID NO：32的残基44至98。

在另一个实施方式中，一个HPV类型的E7蛋白的N末端部分由一个序列构成，该序列的范围为E7蛋白的前31％至前41％；并且该E7蛋白的C末端部分由一个序列构成，该序列的范围为E7蛋白的最后60％至最后70％。在一个特定实施方式中，E7蛋白的N末端部分的大小与C末端部分的大小的总和最多为E7蛋白尺寸的100％。在那种情况下，整个E7蛋白(两个片段中)可被包含在所述异源多肽中。相同HPV类型的E7蛋白的N末端部分/C末端部分对的例子，不论它们在所述异源多肽之内的排列，特别地，根据此处所描述的排列如下所示：

-SEQ ID NO：25的残基1至34/SEQ ID NO：25的残基35至98；

-SEQ ID NO：26的残基1至42/SEQ ID NO：26的残基43至105；

-SEQ ID NO：27的残基1至32/SEQ ID NO：27的残基33至98；

-SEQ ID NO：28的残基1至31/SEQ ID NO：28的残基32至97；

-SEQ ID NO：29的残基1至37/SEQ ID NO：29的残基38至106；

-SEQ ID NO：31的残基1至31/SEQ ID NO：31的残基32至99；以及

-SEQ ID NO：32的残基1至31/SEQ ID NO：32的残基32至98。

在嵌合蛋白的一个特定实施方式中，当所述第一、第二和第三HPV类型是HPV16、HVP18和HPV45型时，所述异源多肽由以下的序列构成：如SEQ ID NO：34所示的序列(其由如SEQ ID NO：33所示的多核苷酸编码)，或者如SEQ ID NO：36所示的序列(其由如SEQ ID NO：35所示的多核苷酸编码)。

在嵌合蛋白的一个特定实施方式中，当所述第一、第二和第三HPV类型是HPV31、HVP52和HPV58型时，所述异源多肽由以下的序列构成：如SEQ ID NO：42所示的序列(其由如SEQ ID NO：41所示的多核苷酸编码)，或者如SEQ ID NO：44所示的序列(其由如SEQ ID NO：43所示的多核苷酸编码)。

在嵌合蛋白的一个特定实施方式中，当所述第一、第二和第三HPV类型是HPV31、HVP33和HPV52型时，所述异源多肽由以下的序列构成：如SEQ ID NO：46所示的序列(其由如SEQ ID NO：45所示的多核苷酸编码)，或者如SEQ ID NO：48所示的序列(其由如SEQ ID NO：47所示的多核苷酸编码)。

在嵌合蛋白的一个特定实施方式中，当所述第一、第二、第三和第四HPV类型是HPV31、HPV33、HPV52和HPV58型时，所述异源多肽由以下的序列构成：如SEQ IDNO：38所示的序列(其由如SEQ ID NO：37所示的多核苷酸编码)，或者如SEQ IDNO：40所示的序列(其由如SEQ ID NO：39所示的多核苷酸编码)。

在嵌合蛋白的一个特定实施方式中，当所述第一、第二、第三和第四HPV类型是HPV16、HVP18、HPV33和HPV45型时，所述异源多肽由以下的序列构成：如SEQ IDNO：50所示的序列(其由如SEQ ID NO：49所示的多核苷酸编码)，或者如SEQ IDNO：52所示的序列(其由如SEQ ID NO：51所示的多核苷酸编码)。

在嵌合蛋白的一个特定实施方式中，当所述第一、第二、第三和第四HPV类型是HPV16、HVP18、HPV45和HPV58型时，所述异源多肽由以下的序列构成：如SEQ IDNO：54所示的序列(其由如SEQ ID NO：53所示的多核苷酸编码)，或者如SEQ IDNO：56所示的序列(其由如SEQ ID NO：55所示的多核苷酸编码)。

本发明还涉及一种多肽，其包含以下或由以下构成：从N末端至C末端，第一HPV类型的E7蛋白的C末端部分，第二HPV类型的E7蛋白的C末端部分，第三HPV类型的E7蛋白的C末端部分，可选地第四HPV类型的E7蛋白的C末端部分，所述第一HPV类型的E7蛋白的N末端部分，所述第二HPV类型的E7蛋白的N末端部分，所述第三HPV类型的E7蛋白的N末端部分，以及可选地所述第四HPV类型的E7蛋白的N末端部分。此处所提供的对于包含在本发明嵌合蛋白中的异源多肽的定义，同样适用于所述多肽本身，特别是涉及以下的定义：HPV类型的E7蛋白的N末端部分，HPV类型的E7蛋白的C末端部分，连接子的可选存在性、特别是AS二肽，HPV类型的性质，来自SEQ ID NO：25、26、27、28、29、31和32的E7蛋白的特定片段。此处所提供的对于包含本发明嵌合蛋白的组合物的定义，同样适用于所述多肽本身，特别是涉及所述第一、第二、第三、第四、第五和第六HPV类型以及当可适用的所述第七HPV类型的一般或特定组合。

在一个特定实施方式中，所述多肽由如SEQ ID NO：34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54或56所示的序列构成。本发明还涉及此处定义的编码这些多肽的多核苷酸(特别是如EQ ID NO：33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53和55所示的多核苷酸以及包含这些多核苷酸的载体)，和包含这些多核苷酸的细胞或细胞培养物或者包含这些多核苷酸的载体。

不管它的尺寸(大于200个残基)、它的复杂性(存在多个半胱氨酸残基)和它的负静电荷，所述多肽已令人惊奇地显示出可以有效地被转运到抗原呈递细胞的细胞溶质中，从而获得强而大的T细胞免疫应答。

在一个特定实施方式中，本发明涉及本发明的嵌合蛋白，其包含以下或由以下构成：如SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：61所示的序列。这些钱和蛋白分别由SEQ IDNO:57或SEQ ID NO:60所示的多核苷酸序列编码。在一个特定实施方式中，SEQ IDNO：58或SEQ ID NO：61的嵌合蛋白是由质粒表达，所述质粒的序列分别如SEQ IDNO：59或SEQ ID NO：62所示。

在一个特定实施方式中，本发明还涉及本发明的嵌合蛋白，其包含以下或由以下构成：如SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：67所示的序列。这些嵌合蛋白分别由如SEQ IDNO：63或SEQ ID NO：66所示序列的多核苷酸编码。在一个特定实施方式中，SEQ IDNO：64或SEQ ID NO：67的嵌合蛋白是由质粒表达，所述质粒的序列分别如SEQ IDNO：65或SEQ ID NO：68所示。

因此，此处所定义的包含异源多肽的本发明的任何嵌合蛋白可通过使用作为表达载体的SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：68的质粒来表达，其中，所述异源多肽包含以下或由以下构成：来自HPV的至少一种抗原或至少一个表位。在这个规则中，包含在SEQ ID NO：59的核苷酸904和1731之间的多核苷酸被去除，并被编码本发明的异源多肽的多核苷酸所替换，从而能表达包含这种异源多肽的本发明嵌合蛋白。类似地，包含在SEQ ID NO：62的核苷酸772和1599之间的多核苷酸被去除，并被编码本发明的异源多肽的多核苷酸所替换，从而能表达包含这种异源多肽的本发明嵌合蛋白。类似地，包含在SEQ ID NO：65的核苷酸904和1836之间的多核苷酸被去除，并被编码本发明的异源多肽的多核苷酸所替换，从而能表达包含这种异源多肽的本发明嵌合蛋白。类似地，包含在SEQ ID NO：68的核苷酸772和1704之间的多核苷酸被去除，并被编码本发明的异源多肽的多核苷酸所替换，从而能表达包含这种异源多肽的本发明嵌合蛋白。

在本发明的一个特定实施方式中，包含在SEQ ID NO：59的核苷酸904和1731之间的多核苷酸被去除，并被编码来源于一个独特HPV E7蛋白的本发明异源多肽的多核苷酸所替换，该多核苷酸选自编码所述多肽的多核苷酸，其中，所述多肽分别具有如SEQ IDNO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：72所示的序列，这种构建体能表达包含异源多肽的本发明一价嵌合蛋白，所述异源多肽具有SEQID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：73或SEQ ID NO：72的序列，并分别代表缺失其酸性区域的HPV31 E7、缺失其酸性区域的HPV33 E7、缺失其酸性区域的HPV58 E7、缺失其酸性区域的HPV52 E7和缺失其酸性区域的HPV45 E7。

在本发明的一个特定实施方式中，包含在SEQ ID NO：59的核苷酸904和1731之间的多核苷酸被去除，并被编码来源于一个独特HPV E7蛋白的本发明异源多肽的多核苷酸所替换，该多核苷酸选自以下的多核苷酸：分别具有如SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：78和SEQ ID NO：77所示的序列。

本发明还涉及一种组合物，其包含至少一个本发明的嵌合蛋白，优选一个或两个，特别是至少两个、优选两个本发明的不同的嵌合蛋白。

在一个特定实施方式中，当该组合物包含多于一个不同的嵌合蛋白、优选两个不同的嵌合蛋白时，所述嵌合蛋白的CyaA部分(或片段)的序列是相同或不同的，然而，异源多肽的序列是不同的。在一个特定实施方式中，不同的嵌合蛋白、优选两个不同的嵌合蛋白选自此处所描述的不同嵌合蛋白。在一个特定实施方式中，两个不同的嵌合蛋白为：

1)两个嵌合蛋白，其包含以下或由以下构成：从N末端到C末端，(a)由SEQ IDNO：2的残基1至227构成的片段；(b)异源多肽，其包含至少3种HPV抗原，并且每种HPV抗原来自一个不同的HPV类型；以及(c)由SEQ ID NO：2的残基321到1706构成的片段，如果这两个嵌合蛋白的异源多肽在它们的序列和HPV类型方面存在不同；或者

2)两个嵌合蛋白，其包含以下或由以下构成：从N末端到C末端，(a)由SEQ IDNO：2的残基1至183构成的片段；(b)异源多肽，其包含至少3种HPV抗原，并且每种HPV抗原来自一个不同的HPV类型；以及(c)由SEQ ID NO：2的残基387到1706构成的片段，如果这两个嵌合蛋白的异源多肽在它们的序列和HPV类型方面存在不同。

在另一个实施方式中，所述不同的、优选2个不同的嵌合蛋白的CyaA部分(或片段)的序列是不同的，并且异源多肽的序列是不同的。在一个特定实施方式中，不同类型的、优选两个不同类型的嵌合蛋白选自此处所描述的不同嵌合蛋白。在一个特定实施方式中，不同的、优选2个不同的嵌合蛋白中的至少一个，优选一个，其包含以下或由以下构成：从N末端到C末端，(a)由SEQ ID NO：2的残基1至227构成的片段；(b)异源多肽，其包含至少3种HPV抗原，并且每种HPV抗原来自一个不同的HPV类型；以及(c)由SEQ ID NO：2的残基321到1706构成的片段；并且不同的、优选2个不同的嵌合蛋白中的至少一个，优选一个，其包含以下或由以下构成：从N末端到C末端，(a)由SEQ ID NO：2的残基1至183构成的片段；(b)异源多肽，其包含至少3种HPV抗原，并且每种HPV抗原来自一个不同的HPV类型，其中，所述异源多肽与来自其它至少一个嵌合蛋白的异源多肽在其序列和HPV类型方面存在不同；以及(c)由SEQ ID NO：2的残基387到1706构成的片段。

在一个组合物的特定实施方式中，其中，所述组合物包含多于一种不同类型的、优选2种不同类型的嵌合蛋白，异源多肽如此处所定义。在一个特定实施方式中，每个异源多肽包含：

此处所定义的第一HPV类型的E7蛋白的N末端片段和C末端片段；

此处所定义的第二HPV类型的E7蛋白的N末端片段和C末端片段；

此处所定义的第三HPV类型的E7蛋白的N末端片段和C末端片段；以及

可选地此处所定义的第四HPV类型的E7蛋白的N末端片段和C末端片段；

其中，每个异源多肽具有与其它异源多肽不同的序列。

在一个特定实施方式中，包含2种不同类型的嵌合蛋白的组合物中，第一种嵌合蛋白的异源多肽包含：此处所定义的第一HPV类型的E7蛋白的N末端片段和C末端片段、此处所定义的第二HPV类型的E7蛋白的N末端片段和C末端片段、以及此处所定义的第三HPV类型的E7蛋白的N末端片段和C末端片段；并且第二种嵌合蛋白的异源多肽包含：此处所定义的第四HPV类型的E7蛋白的N末端片段和C末端片段、此处所定义的第五HPV类型的E7蛋白的N末端片段和C末端片段以及此处所定义的第六HPV类型的E7蛋白的N末端片段和C末端片段；其中，第一、第二、第三、第四、第五和第六HPV类型是不同的HPV类型。

在一个特定实施方式中，第一、第二、第三、第四、第五和第六HPV类型选自：(a)HPV16、HPV18、HPV45、HPV31、HPV52和HPV58；或(b)HPV16、HPV18、HPV45、HPV31、HPV33和HPV52。

在一个特定实施方式中，第一、第二和第三HPV类型是HPV16、HPV18和HPV45。在一个特定实施方式中，所述异源多肽包含以下或由以下构成：如SEQ IDNO：34或36所示的序列。在一个特定实施方式中，所述嵌合蛋白包含以下或由以下构成：如SEQ ID NO：58、61、64或67所示的序列。对于这些特定实施方式，可联合第四HPV亚型，其选自HPV33或HPV58。

在一个独立的特定实施方式或结合该实施方式的第一、第二和第三HPV类型，其第四、第五与第六HPV类型是HPV31、HPV52和HPV58。在一个特定实施方式中，所述异源多肽包含以下或由以下构成：如SEQ ID NO：42或44所示的序列。

在一个独立的特定实施方式或结合该实施方式的第一、第二、第三HPV类型，其第四、第五与第六HPV类型是HPV31、HPV33和HPV52。在一个特定实施方式中，所述异源多肽包含以下或由以下构成：如SEQ ID NO：46或48所示的序列。在一个特定实施方式中，所述嵌合蛋白包含以下或由以下构成：如SEQ ID NO：58、61、64或67所示的序列；其中，如SEQ ID NO：34或36所示的序列被如SEQ ID NO：42、44、46或48所示的序列替换。

本发明涉及一个特定实施方式中，上述指定HPV亚型中所述抗原的组合，当这些抗原按以下顺序中在嵌合蛋白被提供时：该顺序对应于以上HPV亚型的指定引用顺序，或者可选地这些抗原在嵌合蛋白中以任何其他顺序被提供，所述其他顺序对应于那些所述HPV(特别是以下的组：HPV16、HPV18和HPV45，或HPV31、HPV52和HPV58，或HPV31、HPV33和HPV52)中的第一、第二、第三和可选地第四HPV的任何组合。

在一个特定实施方式中，第一、第二、第三、第四、第五和第六HPV类型分别是(a)HPV16、HPV18、HPV45、HPV31、HPV52和HPV58，或(b)HPV16、HPV18和HPV45、HPV31、HPV33和HPV52。

在一个特定实施方式中，两种不同的嵌合蛋白包含：用于第一嵌合蛋白的此处所公开的HPV16、HPV18、HPV45的抗原；以及用于第二嵌合蛋白的此处所公开的HPV31、HPV52、HPV58的抗原。在另一特定实施方式中，两个不同的嵌合蛋白包含：用于第一嵌合蛋白的HPV16、HPV18、HPV45的此处所公开的抗原；以及用于第二嵌合蛋白的HPV31、HPV33、HPV52的此处所公开的抗原。在一个优选的实施方式中，但不是必须的，由此定义的多个HPV抗原以指定顺序被插入嵌合蛋白内。

在一个特定实施方式中，包含2种不同类型嵌合蛋白的组合物中，第一种嵌合蛋白的异源多肽包含：第一HPV类型的E7蛋白的此处所定义的N末端片段和C末端片段、第二HPV类型的E7蛋白的此处所定义的N末端片段和C末端片段、第三HPV类型的E7蛋白的此处所定义的N末端片段和C末端片段以及第四HPV类型的E7蛋白的此处所定义的N末端片段和C末端片段；并且第二种嵌合蛋白的异源多肽包含：第五HPV类型的E7蛋白的此处所定义的N末端片段和C末端片段、第六HPV类型的E7蛋白的此处所定义的N末端片段和C末端片段以及第七HPV类型的E7蛋白的此处所定义的N末端片段和C末端片段；其中，第一、第二、第三、第四、第五、第六和第七HPV类型是不同的HPV类型。

在一个特定实施方式中，第一、第二、第三、第四、第五、第六和第七HPV类型选自由以下构成的组：

(a)HPV31、HPV33、HPV52、HPV58、HPV16、HPV18和HPV45；

(b)HPV16、HPV18、HPV33、HPV45、HPV31、HPV52和HPV58；

(c)HPV16、HPV18、HPV45、HPV58、HPV31、HPV52和HPV33；

(d)HPV16、HPV18、HPV33、HPV45、HPV31、HPV58和HPV52；

(e)HPV16、HPV18、HPV45、HPV58、HPV31、HPV33和HPV52；以及

(f)HPV16、HPV18、HPV45、HPV33、HPV31、HPV52和HPV58。

在一个特定实施方式中，第一、第二、第三和第四HPV类型是HPV16、HPV18、HPV33和HPV45。在一个特定实施方式中，所述异源多肽包含以下或由以下构成：如SEQ ID NO：50或52所示的序列。在一个特定实施方式中，第一、第二、第三和第四HPV类型是HPV16、HPV18、HPV45和HPV58。在一个特定实施方式中，所述异源多肽包含以下或由以下构成：如SEQ ID NO：54或56所示的序列。在一个特定实施方式中，第一、第二、第三和第四HPV类型是HPV31、HPV33、HPV52和HPV58。在一个特定实施方式中，所述异源多肽包含以下或由以下构成：如SEQ ID NO：40或42所示的序列。在一个特定实施方式中，所述第一嵌合蛋白包含以下或由以下构成：如SEQ IDNO：58、61、64或67所示的序列；其中，如SEQ ID NO：34或36所示的序列已被如SEQ ID NO：40、42、50、52、54或56所示的序列替换。

在一个独立的特定实施方式或与把HPV31、HPV33、HPV52和HPV58分别作为第一、第二、第三和第四HPV类型的实施方式相结合，其第五、第六和第七HPV类型是HPV16、HPV18和HPV45。在一个特定实施方式中，所述异源多肽包含以下或由以下构成：如SEQ ID NO：34或36所示的序列。在一个特定实施方式中，所述第二嵌合蛋白包含以下或由以下构成：如SEQ ID NO：58、61、64或67所示的序列。

在一个独立的特定实施方式或与把HPV16、HPV18、HPV33和HPV45或HPV16、HPV18、HPV45和HPV58分别作为第一、第二、第三和第四HPV类型的实施方式相结合，其第五、第六和第七HPV类型分别为HPV31、HPV52和HPV58或HPV31、HPV33和HPV52。在一个特定实施方式中，所述异源多肽包含以下或由以下构成：如SEQ IDNO：42或44所示的序列。在一个独立的特定实施方式或与把HPV16、HPV18、HPV33和HPV45或HPV16、HPV18、HPV45和HPV58分别作为第一、第二、第三和第四HPV类型的实施方式相结合，其第五、第六和第七HPV类型分别为HPV31、HPV52和HPV58或HPV31、HPV33和HPV52。在一个特定实施方式中，所述异源多肽包含以下或由以下构成：如SEQ ID NO：46或48所示的序列。在一个特定实施方式中，所述第二嵌合蛋白包含以下或由以下构成：如SEQ ID NO：58、61、64或67所示的序列；其中，如SEQ ID NO：34或36所示的序列已被如SEQ ID NO：42、44、46或48所示的序列替换。

在一个特定实施方式中，第一、第二、第三、第四、第五、第六和第七HPV类型选自由以下构成的组：

(a)分别为HPV31、HPV33、HPV52、HPV58、HPV16、HPV18和HPV45；

(b)分别为HPV16、HPV18、HPV33、HPV45、HPV31、HPV52和HPV58；

(c)分别为HPV16、HPV18、HPV45、HPV58、HPV31、HPV52和HPV33；

(d)分别为HPV16、HPV18、HPV33、HPV45、HPV31、HPV58和HPV52；以及

(e)分别为HPV16、HPV18、HPV45、HPV58、HPV31、HPV33和HPV52。

本发明涉及一个特定实施方式中，上述指定HPV亚型中所述抗原的组合，当这些抗原按以下顺序在嵌合蛋白中被提供时：该顺序对应于以上HPV亚型的指定引用顺序，或者可选地这些抗原在嵌合蛋白中以任何其他顺序被提供，该其他顺序对应于那些HPV(特别是以下的组：HPV16、HPV18、HPV33和HPV45，或HPV16、HPV18、HPV45和HPV58，或HPV31、HPV52和HPV58，或HPV31、HPV33和HPV52)中的第一、第二、第三和存在时的第四HPV的任何组合。

在一个特定实施方式中，两个不同的嵌合蛋白包含：此处所公开的用于第一嵌合蛋白的HPV16、HPV18、HPV45、HPV58的抗原；以及此处所公开的用于第二嵌合蛋白的HPV31、HPV33、HPV52的抗原。在另一特定实施方式中，两个不同的嵌合蛋白包含：用于第一嵌合蛋白的HPV16、HPV18、HPV45、HPV33的此处所公开的抗原；以及用于第二嵌合蛋白的HPV31、HPV52、HPV58的此处所公开的抗原。在另一特定实施方式中，两个不同的嵌合蛋白包含：此处所公开的用于第一嵌合蛋白的HPV31、HPV33、HPV52、HPV58的抗原；以及此处所公开的用于第二嵌合蛋白的HPV16、HPV18、HPV45的抗原。在一个优选的实施方式中，但不是必须的，由此定义的HPV抗原以指定顺序被插入到嵌合蛋白内。

在一个特定实施方式中，所述组合物还包括一个合适的药物载体，如其选自以下：缓冲剂、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、水、乙醇及其类似物以及它们的组合。

在一个特定实施方式中，带有或不带有合适的药物载体的组合物还包含：至少一种佐剂(优选一种佐剂)和/或一种表面活性剂和/或免疫调节物质(如细胞因子或趋化因子)和/或生长因子(如GM-CSF)。各种佐剂是本领域所公知的，其包括：完全弗氏佐剂(CFA)、不完全弗氏佐剂(IFA)、montanide ISA(不完全SEPPIC佐剂)、如胞壁酰二肽(MDP)MDP-Lys(L18)(N^α-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-N^e硬脂酰-L-赖氨酸)的胞壁酰肽、硫酸锌、胶体氢氧化铁、磷酸钙或氯化钙、如CPG ODN1826和CPG ODN 2007的CpG寡脱氧核苷酸(CPG ODN)、MF59(其是稳定于含5％(w/v)角鲨烯的水包油乳液中的清洁剂)、0.5％80(w/v)和0.5％Span(w/v)的水溶液、TLR4配体(如MPL、GLA)TLR3配体(如聚IC，聚ICLC称为)、多糖(如菊粉)和脂质体(如阳离子脂质体ISCOMs)。

在一个特定实施方式中，至少一种佐剂选自以下：具有激活T细胞免疫应答的能力的分子。优选的佐剂如下：结合免疫细胞(如APC)上的TLR(Toll样受体)3、4、7、8和/或9的佐剂；或者免疫细胞(如APC)上的TLR(Toll样受体)3、4、7、8和/或9的激动剂。在一个特定实施方式中，所述佐剂为TLR配体，特别是选自由以下构成的组：如聚ICLC的3类TLR配体，如MPL的4类TLR配体，如CpG的9类TLR配体以及如咪喹莫特的7/8类TLR配体。佐剂的例子为咪喹莫特和聚ICLC。一个基于咪喹莫特的市售药物是Aldara^TM(作为含5％咪喹莫特的霜出售)，聚ICLC可从Oncovir公司(华盛顿州，美国)的购买。

在一个特定实施方式中，此处所定义的嵌合蛋白或组合物可通过不同途径被注入病人中：皮下(S.C.)、皮内(I.D.)、肌内(I.M.)或静脉内(I.V.)注射，口服及粘膜给药，特别是鼻腔给药或吸入。在一个特定实施方式中，此处所定义的嵌合蛋白或组合物为皮内给药。

此外，此处所定义的嵌合蛋白或组合物可与至少一种免疫增强剂(如至少一种佐剂，优选一种佐剂)和/或一种表面活性剂和/或免疫调节物质组合或混合。对于“组合”，其是指此处所定义的嵌合蛋白或组合物以及免疫增强剂，在相同或不同的时间和/或通过施用相同或不同的模式(优选相同的接触位点)下，都被放入以与宿主接触。与此相反，“混合”是指当被施用时，此处所定义的嵌合蛋白或组合物以及免疫增强剂在同一制剂中。

此处所定义的嵌合蛋白或组合物可以是固体形式(胶囊、粉末、片剂、丸剂、栓剂、快速释放片剂、胃耐受片剂、缓释片剂)、粉末状，优选冷冻干燥后(冻干形式或冻干粉末形式)，其需要再配制，例如在注射前用稀释剂配制，或者以液体形式，如可注射的溶液或可注射的悬浮液。

嵌合蛋白的给药量(剂量)取决于待治疗个体，包括考虑患者的状况、个体的免疫系统状态、给药途径和宿主的重量。常规的剂量范围为1至2400μg、100至2000μg、200至1000μg和500至1000μg。一个特定剂量选自由以下构成的组：100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000或2400μg±10％。在另一个实施方式中，常规剂量的范围为1至100μg、1至50μg和1至10μg的载体携带的多肽。以本发明的活性成分进行整个治疗的总剂量范围为200至2400μg、300至2000μg、400至1000μg和500至800μg。根据情况，本领域技术人员可对这些例子进行修改。

本发明还涉及作为药物使用的本发明的嵌合蛋白或本发明的组合物。在一个特定实施方式中，本发明的嵌合蛋白或本发明的组合物用于预防或治疗病原体感染。在另一个实施方式中，本发明的嵌合蛋白或本发明的组合物用于预防或治疗基于致癌的疾病，优选基于致癌的肿瘤疾病，如肿瘤疾病、恶性肿瘤疾病或恶性肿瘤。在一个特定实施方式中，本发明的嵌合蛋白或本发明的组合物用于预防性免疫应答的诱导或治疗性免疫应答的诱导。

在一个特定实施方式中，本发明还涉及一种方法，其用于治疗带有病原体感染或疑似有病原体感染的动物或人类患者，所述方法包括：

(a)将本发明的嵌合蛋白或本发明的组合物施用于所述动物或人类患者，可能为多个给药剂量；以及

(b)追踪所述动物或人类患者的状况。

在另一个实施方式中，本发明还涉及一种方法，其用于治疗患有肿瘤疾病的动物或人类患者，所述方法包括：

(a)将本发明的嵌合蛋白或本发明的组合物施用于所述动物或人类患者，可能为多个给药剂量；以及

(b)追踪所述动物或人类患者的状况。

本发明还涉及一种方法，其用于防止动物或人类患者的病原体感染，所述方法包括：

(a)将本发明的嵌合蛋白或本发明的组合物施用于所述动物或人类患者，可能为多个给药剂量；以及

(b)追踪所述动物或人类患者的状况，可能为多个给药剂量。

本发明还涉及一种方法，其用于防止动物或人类患者中的肿瘤疾病的出现或发展，所述方法包括：

(a)将本发明的嵌合蛋白或本发明的组合物施用于所述动物或人类患者，可能为多个给药剂量；以及

(b)追踪所述动物或人类患者的状况。

根据本发明，治疗性治疗的目的在于改善有需要的动物或人类患者的临床状况，该动物或人类患者已被诊断为病原体感染或疑似病原体感染或者被诊断为患有病理状态。在一个特定实施方式中，该治疗的目的在于消除疾病的病原体(causative agent)或生物体(organism)，或者在于降低所述病原体或生物体的丰度。在病毒感染的情况下，该治疗可能会导致宿主的靶向组织中的病毒载量(viral load)的显著下降，该病毒载量低于测定时所检测得到的。在肿瘤疾病中，该治疗可能会导致肿瘤的尺寸降低或发展，或者导致肿瘤细胞的根除，或者导致肿瘤细胞数量减少至低于测定时所检测得到的。治疗性治疗的目的还在于通过消除或降低与病原体感染或肿瘤疾病相关的症状，来改善动物或人类患者的临床状况，且优选目的在于恢复健康。

动物或人类患者的预防性治疗的目的在于防止所述动物或人类患者的病原体感染，或者防止肿瘤疾病的出现或发展，或者防止所述动物或人类患者中的病理状态的产生。预防性治疗包括接种。

使用本发明的嵌合蛋白或组合物进行的治疗性和预防性治疗，是基于针对在宿主中的异源多肽所含的表位的有效免疫应答(优选细胞免疫应答)的引发。

因此，本发明还涉及使用本发明的嵌合蛋白或组合物来诱导或引发针对在宿主中的异源多肽所含的表位的免疫应答，优选细胞免疫应答(例如CTL应答)，其中，在该宿主中进行了所述嵌合蛋白或组合物给药。

在一个特定实施方式中，本发明还涉及本发明的嵌合蛋白或组合物，用于：

(i)通过诱导针对包含在异源多肽中的第一组表位的T细胞免疫应答，对哺乳动物宿主中所诊断的第一确定的病理状态进行免疫治疗；以及

(ii)通过诱导针对包含在异源多肽中的第二组表位的T细胞记忆免疫应答，来预防在同一哺乳动物宿主中的第二确定的病理状态；

所述免疫应答通过将所述嵌合蛋白或组合物施用于所述宿主后获得，其中，当所述第二组表位没有包含在所述异源多肽时，观察不到针对第二确定的病理状态的所述预防。

事实上，本发明人已经表明，本发明的嵌合蛋白能避开不同表位之间所存在的竞争、或者涉及接近APC、由APC进行的加工和呈递以及细胞因子的可用性。因此，使用本发明的嵌合蛋白时，在治疗性治疗中，能诱导针对第一组表位的免疫应答；并且在预防性治疗中，也能诱导针对第二组表位的免疫应答。因此，本发明的嵌合蛋白对于以下是有效的：

在宿主中所诊断的第一确定的病理状态进行免疫治疗以有效诱导T细胞免疫应答；以及

在对同一宿主中第二确定的病理状态的风险进行预防中，引起T细胞记忆免疫应答。

具体实施方式

I、材料和方法

小鼠

从Janvier实验室购买六周大的雌性C57BL/6小鼠(H-2^b)。小鼠在无病原体以及随意饮用的水和食物的条件下进行饲养。涉及动物及其护理的程序符合Genticel指南，该指南遵守国家和国际法律以及政策，并且由当地伦理委员会进行审核。

对于本发明中所使用的一些HPV类型，其它具有不同的遗传背景的小鼠可以有利地使用。这种小鼠可以从Janvier实验室购买，并包括：DBA/2JRi(H2K^d/H2D^d)，或CBA/JRi(H2K^k/H2D^k)SJL/JRi(H2K^s/H2D^s)和FVB/NRi(H2K^q/H2D^q)。

其他小鼠，如人源化小鼠，其具有HLA，特别是HLA-A2单体型，该小鼠也在确定由本发明的构建体引发的免疫应答方面受到关注。转基因HLA-A2.1小鼠可以从TACONIC(USA)购买，在表达人类HLA-A2.1单体型小鼠中，测试所描述的针对来自所选HPV类型的每个E7的候选疫苗的免疫原性。

这些小鼠用于测试所描述的针对来自所选HPV类型的每个E7的候选疫苗的免疫原性。

肿瘤细胞系

TC-1(组织培养1号)肿瘤细胞^[19]是由以下的方法制备：通过用HPV16E6和E7癌基因以及激活的人c-Ha-Ras癌基因转化C57BL/6原始小鼠肺细胞。本研究中所使用的细胞通过ATCC获得。在注射前的至少10天期间，在每次实验前，解冻TC1，然后，进行体外培养和扩增。

Lewis肺癌(LL2)是通过带有由原始Lewis肺癌的植入所产生的肿瘤的C57BL/6小鼠的肺而建立的细胞系(13)。该细胞系作为用于转运的模型而被广泛使用，并有助于研究癌症治疗的机制(14)。LL2肿瘤细胞系购买自ATCC(CRL-1642)。

根据生产商的方案(Vectalys，Labège，法国)，带有HPV18 E7和GFP基因或仅GFP基因的慢病毒载体转导到这些细胞。基于MHC I类、GFP和E7表达，选择3个克隆。根据其生长轮廓和其被HPV18 E7特异性细胞毒性T CD8⁺淋巴细胞靶向的能力，进行体内预防性选择后，选择一个克隆；进行取用率(take rate)实验，以得到接种的最佳细胞量。在体内选择中，取用率(take rate)和治疗研究的理想时间在Oncodesign(第戎，法国)进行。在注射前的至少10天期间，在每次实验前，解冻LL2，然后，进行体外培养和扩增。

B16-IRES-GFP-OVA(B16-GFP)和B16-MAGEA3-IRES-GFP-OVA(B16-MAGEA3-GFP)细胞被用于重新刺激由被处理的小鼠而获得的离体脾细胞。B16-MAGEA3细胞是由表达MAGE-A3蛋白的Vectalys转导的B16-F10同基因肿瘤细胞。GFP表达通常与MAGE-A3蛋白表达联系在一起。

肿瘤细胞接种

在第0天，将TC-1细胞注射入C57BL/6小鼠(1×10⁶个细胞每只小鼠，并稀释在100μL PBS 1×中，通过右腋下皮下途径)。在一些实验中，在第65天，将稀释于100μLPBS 1×的LL2-GFP或LL2-HPV18 E7-GFP细胞通过左腋下皮下途径注射入小鼠。

疫苗

重组体CyaA-HPV16 E7_Δ30-42(C16-1)和CyaA-HPV18 E7_Δ32-42(C18-1)的构建和纯化。

在EP1576967 B1中已经描述了构建和纯化。两个最终体积的CyaA-HPV16 E7_Δ30-42(C16-1)(图1A)和CyaA-HPV18 E7_Δ32-42(C18-1)(图1B)以1：1的比例在Genticel混合，以便产生名为ProCervix的二价组合物，然后，将其等分，保存在-80℃。

基于gtCyaAd93和gtCyaAd203的疫苗的构建和纯化：

将野生型CyaA的DNA序列(CyaAwt：GeneBank：CAE41066.1)进行了优化并将其合成出(GeneCust)，以在大肠杆菌中表达。该优化的DNA序列被命名为gtCyaA。该序列添加了下列独特限制性位点，以促进抗原序列插入到CyaA催化结构域：Nde I(CATATG)、BamH I(GGATCC)、EcoR I(GAATTC)、EcoR V(GATATC)、PciI(ACATGT)、BCL I(TGATCA)、Age I(ACCGGT)、Xma I(CCCGGG)和NcoⅠ(CCATGG)。

然后，将gtCyaA插入包含pTAC诱导型启动子的pGTPc608质粒(质粒由GTP技术提供，Labège，法国)。

对两个缺失突变体进行了测试：一个为百日咳博德特氏菌CyaA的第228位至第320位的93个氨基酸的缺失；以及百日咳博德特氏菌CyaA的第184位至第386位的203个氨基酸的缺失。第一个93残基的缺失去除了钙调蛋白相互作用的结构域(结构域III)。第二个203残基的缺失去除了结构域II和III。

形成同时缺失了gtCyaA中的93个和203个氨基酸的突变体，同时插入抗原。

每个被表达的蛋白纯化已经通过色谱程序实现；特别是，采用了离子交换亲和色谱和疏水性交换色谱技术。

gtCyaAd93-pep216-CyaCopt和gtCyaAd203-pep216-CyaCopt的构建和纯化

通过DNA2.0(美国)或Genecust(德国)合成所有抗原，并由Solvias(瑞士)进行克隆。gtCyaAd93-pep216-CyaACopt和gtCyaAd203-pep216-CyaACopt的示意图如图3A和3B所示。

分别用每个质粒对BLR菌株进行电穿孔。在经典培养基中培养被转染的细菌，通过添加IPTG诱导生产。

每个被表达的蛋白纯化已经通过色谱程序实现；特别是，采用了离子交换亲和色谱和疏水性交换色谱技术。

CyaAd203-pep105的构建：

CyaAd203-PEP105_opt蛋白是通过腺苷酸环化酶序列的203个氨基酸的缺失而形成的，其含有作为抗原插入的多肽105(PEP105)。在NdeI和BamHI限制性位点，将CyaA的优化序列克隆至先前所描述的pKTRACE质粒。Pep105抗原被合成，并在EcoRI和XmaI限制性位点之间进行该抗原的克隆。纯化方案已在EP1576967 B1中进行了描述。pKTRACE CyaAd203-pep105_opt的示意图如图4所示。

多肽pep105(SEQ ID NO：24)包含从N末端至C末端的下述抗原。一些抗原已被融合，而其它通过连接子被分离。在GVNHQHL序列之前，一个特定连接子(AS二肽)已被引入，以产生一个用于免疫应答校准(以粗体显示)的强的鼠MHC I类限制性表位(限制H-2^b)：

-限制性位点：MGIR

-GFP11：SRDHMVLHEYVNAAGIT

-连接子：GSDR

-MOG_35-55：MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK

-OVA_257-264(来自卵清蛋白的MHC I类限制性肽)：SIINFEKL

-IE_191-110：VRVDMVRHRIKEHMLKKYTQ

-CLA4-TCR H-2Kd HA_512-520：IYSTVASSL

-连接子：SGEK

-OVA_323-339(MHC II类限制性肽)：ISQAVHAAHAEINEAGR

-MELAN-A_26-35：ELAGIGILTV

-HA_307-319：PKYVKQNTLKLAT

-LCMV H2-Db限制性GP_33-41：KAVYNFATC

-限制性位点：SG

-MAGEA3_111-180：

RKVAELVHFLLLKYRAREPVTKAEMLGSVVGNWQYFFPVIFSKA

SSSLQLVFGIELMEVDPIGHLYIFAT

-MAGEA3_244-285：KLLTQHFVQENYLEYRQVPGSDPACYEFLWGPRALVETSYVK

-限制性位点：TG

-HPV16E7(截短的序列)：MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNGPA

GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP

-HPV18E7(截短的序列)：MHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLCHEQLSA

SGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIELVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWCASQQ

-限制性位点：LKGP

疫苗接种

第11天，在肿瘤测量后，经皮内(ID)注射，将疫苗接种至带有可检测实体瘤的小鼠的耳真皮内(两个耳朵都注射)。

佐剂分子

聚ICLC(TLR3激动剂)是由Oncovir(公司，华盛顿州，美国)提供的小瓶，其含有1mL的2mg/mL乳白色无菌溶液。所述聚ICLC置于原始容器中，并储存于+4℃。用于注射的聚ICLC含有2mg/mL聚IC，且其通过溶于0.9％氯化钠溶液的1.5mg/mL聚L-赖氨酸和5mg/mL羧甲基纤维素钠(并用氢氧化钠调pH至7.6-7.8)的溶液来稳定。

肿瘤测量

不同的参数需要考虑在内，以评估小鼠中的肿瘤发展：

○肿瘤大小：用卡尺手动测量肿瘤，每周两次，自肿瘤细胞接种5天后、直到第60天。

然后，以如下公式计算肿瘤体积：体积＝(长度×宽度²)/2。

○小鼠存活：由于伦理原因，将形成了异常重大(极限尺寸：2000mm³)和/或坏死肿瘤、或带有肿瘤诱发的行动不便的小鼠处以安乐死。

○无肿瘤小鼠的数量：这一信息表明何时治疗性疫苗接种已引起整个肿瘤的消退(没有明显肿瘤)。

CD8T细胞记忆细胞毒性反应的测量

用于体内测量CD8⁺T细胞的细胞毒性的方法已被广泛描述^[22，23]。简单地说，对来自空白对照小鼠同基因的脾细胞以不同浓度的CFSE(羧基琥珀酰亚胺酯，分子探针Invitrogen)进行标记，并在体外用相关肽进行脉冲或非脉冲。肽脉冲和非脉冲的靶细胞群都通过静脉注射过继转移至同基因接种疫苗的宿主，并通过流式细胞仪(BDFACSCanto II)测量进入脾脏的肽脉冲靶细胞的损失。根据脉冲靶细胞对非脉冲细胞的百分比比率的降低，估计杀死百分比，并由初始比率校正(见下文)。在注射至不同靶细胞的监测CFSE标记之前，通过流式细胞仪分析细胞制剂，并获得参考值(每个细胞群的真实百分比)，以用于体内杀死百分比的计算。然后，将三种靶细胞群以1：1：1的比例静脉注射至每个接种小鼠内。以如下的公式计算如别处所描述的体内杀死百分比^[24]：

IFN-γ酶联免疫斑点法(enzyme-linked-immunospot，ELIspot)测定

通过用H-2^b限制性肽(HPV16 E7_49-57和HPV18 E7_AS43-49)或HPV45 E7蛋白肽库进行脾细胞的离体再刺激，来评价产生特异性CD8⁺T细胞的IFN-γ频率。这是通过进行IFN-γ酶联免疫斑点法来实现的：

○对小鼠汇集的脾细胞进行酶联免疫斑点法。

简单地说，将从接种疫苗的小鼠中获得的全部脾细胞置于37℃、5％CO₂下，不受刺激或者用1μg/mL的以下描述的每种肽再刺激20小时：

○用HPV16 E7_49-57肽(H-2^b限制性相关表位)，1×10⁶个细胞/孔

○用OVA_257-264(H-2^b限制性无关表位)，1×10⁶个细胞/孔

○用HPV18 E7_AS43-49(H-2^b限制性相关表位)，0.25×10⁶个细胞/孔

○用HPV45 E7肽库，1×10⁶个细胞/孔

对于使用CyaAd203-PEP105_opt的实验，采用以下的额外抗原刺激物：

○#116-2/3肽库(5μg/ml)：#116-2和#116-3的汇集体(每孔1×10⁶细胞)

○#171肽库(3μg/ml)：#171-1、#171-2和#171-3的汇集体(每孔1×10⁶细胞)

○OVA_323-339、MHC-II类限制性肽，使用10μg/ml(每孔1×10⁶细胞)

○LCMV GP_33-41、MHC-I类限制性肽，使用1μg/ml(每孔1×10⁶细胞)

○MOG_35-55、MHC-II类限制性肽，使用10μg/ml(每孔1×10⁶细胞)

○在Genticel产生的His-标记MAGEA3(TAA_002_MAGE-3)的蛋白，使用10μg/ml。

○脾细胞：B16-GFP细胞(表达或不表达MAGEA3)以19：1的比例进行共培养(950000脾细胞：50000 B16细胞)。

使用链霉亲和素-AKP，并通过由BCIP/NBT显示的基于三明治的酶联免疫斑点法来监控IFN-γ分泌。数据由Bioreader5000-PRO S(Biosys)进行分析。

II、结果

A、本发明新载体的诱导针对模型抗原的免疫应答能力的确认

为了确认本发明新载体在输送大的、多表位的抗原能力方面的效率，用441个氨基酸(SEQ ID NO：24)设计了一个模型抗原。

在第0天，小鼠接种CyaAd203-pep105_opt蛋白，并在第7天，使小鼠安乐死，收集脾脏，并分离脾细胞。利用这些细胞，并采用IFN-γ和IL-2的酶联免疫斑点法，测定T细胞介导的应答。接种ProCervix的小鼠被用作诱导HPV16 E7和HPV18 E7特异性T细胞应答的阳性对照，并被用作仅由CyaAd203-PEP105_opt输送的其它抗原的阴性对照。所有接种疫苗都是通过共注射聚ICLC作为佐剂。

A.1.诱导HPV16 E7、HPV18 E7和OVA_257-264特异性IFN-γ应答

图5说明了在HPV16 E7_49-57、HPV18 E7_AS43-49与OVA_257-264I类限制肽以及HPV16E7(#116-2/3)和HPV18 E7(#171-1/2/3)15-聚体肽库的再刺激后所获得的结果。可以得出以下结论：

-以聚ICLC协助的安慰剂接种的小鼠组中，未检测到抗原特异性免疫应答。

-关于以聚ICLC作为佐剂的ProCervix接种疫苗进行接种的小鼠组，无论再刺激，都能获得预期的结果：

-以HPV16E7_49-57和HPV18E7_AS43-49I类限制肽进行体外再刺激，诱导明确的HPV16 E7和HPV18 E7特异性IFN-γ应答；

-以OVA_257-264再刺激，未获得特异性应答；

-以肽库(#116-2/3和#171-1/2/3)获得的HPV16 E7和HPV18 E7特异性IFN-γ应答的强度与以MHC I类限制性肽(HPV16E7_49-57、HPV18 E7_AS43-49)获得的应答水平相接近。

-关于以聚ICLC作为佐剂的CyaAd203-PEP105_opt接种的小鼠，采用HPV16 E7与HPV18 E7肽库(#116-2/3和#171-1/2/3)和用于ProCervix测试的所有MHC I类限制性肽(HPV16E7_49-57、HPV18E7_AS43-49)以及OVA_257-264肽测试HPV16 E7和HPV18 E7特异性IFN-γ应答。

这些结果表明，采用所有这些不同的肽进行的离体再刺激，能再刺激通过CyaAd203-PEP105_opt皮内疫苗接种引发的HPV18 E7、HPV16 E7和OVA_257-264抗原特异性T细胞。

A.2.诱导特异于抗原OVA_323-339、LCMV GP33-41、MOG_35-55和MAGEA3的T细胞介导的IFN-γ应答

图6描述了不同类型的离体再刺激后所获得的结果：

-OVA_323-339，MHC-II类限制性肽

-LCMV GP_33-41，MHC-I类限制性肽

-MOG_35-55，MHC-II类限制性肽

-His-标记的MAGEA3蛋白质。

-B16-MAGEA3-GFP肿瘤细胞被用作APC，并经由MAGE-A3蛋白内源加工所得的MHC I类限制表位的呈递，刺激抗原特异性CD8⁺T细胞。对不表达MAGE-A3蛋白的B16-GFP细胞进行了测试，其作为用于MAGEA3免疫应答特异性的阴性对照。

我们可以观察到，对于所有组，His-标记的MAGE-3蛋白诱导相同的非特异性应答。

对于接种了聚ICLC作为佐剂的安慰剂或聚ICLC作为佐剂的ProCervix的小鼠，没有检测到针对这些抗原的免疫应答。

对于接种了聚ICLC作为佐剂的CyaAd203-PEP105opt的小鼠，在OVA_323-339、GP_33-41和MOG_35-55肽的再刺激后以及经过B16-GFP和B16-MAGEA3-GFP的细胞再次刺激后，检测到抗原特异性IFN-γ分泌型T细胞。

这些结果表明，CyaAd203-PEP105_opt接种疫苗已经引发I-A^b-限制性OVA_323-339、H-2D^b-限制性LCMV GP_33-41和MOG_35-55和GFP11抗原特异性T细胞。

总之，这些结果强调了基于CyaA的疫苗载体高效率，其能在多表位方式中，增加强的抗原特异性CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞。

不幸的是，MAGEA3特异性应答不能被正确地测定，由于用B16-GFP或B16-MAGEA3-GFP这两个细胞系进行离体再刺激后，获得了IFN-γ分泌型T细胞的相似频率。作为嵌入GFP11抗原的CyaAd203-PEP105_opt，针对该疫苗载体的免疫引发GFP特异性T细胞应答，从而引起MAGEA3特异性T细胞应答。

本研究首次强调了203个残基缺失的CyaA疫苗载体的能力，其能在相同接种的小鼠中，诱导针对一些不相关T细胞表位的抗原特异性T细胞应答。此外，这些结果还表明，该203个残基缺失的CyaA疫苗载体诱导CD4⁺和CD8⁺T细胞应答(针对MHC I和MHC II类限制性肽所检测到的特异性应答)的强大能力。

B.HPV抗原的设计

基于患有侵润性细胞癌(ICC)的女性和由HPV感染但具有正常细胞学的女性中的普遍性，从7种最高风险HPV类型(16、18、45、31、33、52和58)中，选择了7个E7序列^[9]，[10]：HPV16 E7变体(gi_30172006；SEQ ID NO：25)、HPV18 E7变体(gi_167996747；SEQ ID NO：26)、HPV31 E7变体(gi_148727610；SEQ ID NO：27)、HPV33 E7变体(gi_257472286；SEQ ID NO：28)、HPV45 E7变体(gi_549287；SEQ ID NO：29)、HPV52 E7变体(gi_237861305；SEQ ID NO：30)以及HPV58变体(gi_19111001；SEQ ID NO：32)。

E7是由以酸性区域分离的两个功能结构域所组成的。这些结构域已被广泛描述^[11-13]。该蛋白的N末端部分包含pRB结合基序(LXCXE)，并且该蛋白的C末端部分包含锌指环。HPV16、18和45的E7蛋白的队列如图7A所示，HPV31、33、52和58的E7蛋白的队列如图7B所示。

两个重组抗原是通过分别融合HPV16、18和45各自的E7序列(带有或不带有酸性区域)所构成的3个序列中的每个而形成。此外，两个重组抗原是通过融合4个由HPV31、33、52和58各自的E7序列(带有或不带有酸性区域)构成的序列而形成的。对于每个E7的酸性区域的是否存在，依据WO2005089792中的合理披露，其遵循以文献指示的规则。的确，CyaA中的酸性序列已被描述为对CyaA的催化结构域的正常转运至细胞溶质是有害的^[8]。因此，此处的带有或不带有该区域的序列允许进行以下的测试：本发明新载体(gtCyaAd93和gtCyaAd203)的输送这些抗原至APC的细胞溶质的能力。

由HPV16、18和45的E7序列构成的抗原已被设计成能产生三价CyaA载体疫苗候选物。这些序列缺失所述酸性区域或不缺失(全长)，并且所述E7序列已被分裂并颠倒，以获得如图8A所示的排列。两个三价候选抗原的序列已被进一步修饰，以引入在WO2005089792中所描述的强的T细胞鼠类表位。该表位是通过在HPV18 E7的序列GVNHQHL的起始部分插入二肽丙氨酸-丝氨酸(AS)而产生，其位于所述蛋白的C末端部分，酸性区域侧面。

由HPV31、33、52和58的E7序列构成的抗原已被设计成产生四价CyaA载体疫苗候选物。对于该三价抗原，这些序列已经缺失所述酸性区域或不缺失，并且所述E7序列已被分裂并颠倒，以获得如图8B所示的排列。

对于每个候选物，进行表位的存在检索，该表位可能会诱导针对人类蛋白的应答。令人惊奇的是，HPV52 E7的野生型序列天然含有一个如下序列：其可为自体免疫表位，B-*2705表位(9聚体，MHC I)。该表位的序列与人类ITPR3(肌醇1,4,5-三磷酸盐受体，3型)的序列具有100％的一致性。为了避免该表位，基于与HPV31、33和58型的E7蛋白的序列同源性，将HPV52 E7的序列修饰为在SEQ ID NO：30的第84位用亮氨酸替换蛋氨酸以及在第86位用蛋氨酸替换亮氨酸(所述修饰的序列为LRTLQQLLM)。HPV52的被修饰全长E7蛋白的序列如SEQ ID NO：31所示。因此，四价抗原序列的新颖性来源于E7蛋白的C末端和N末端的排列，并且，在HPV 52 E7序列中进行所述的2个修饰。

根据如上所述，计算了这些特定抗原的静电荷。这些抗原具有小于-6的酸性电荷，并分别在三价抗原中携带21个半胱氨酸、在四价抗原中携带28个半胱氨酸。这些抗原的特征总结于表2。

表2:各种HPV抗原的特征

C.CyaA的催化结构域中的大片段缺失使得允许插入大而复杂的抗原

三价Pep216和Pep217抗原的DNA以及四价Pep233和Pep234抗原的DNA已被合成，并将其克隆至新gtCyaAd93和gtCyaAd203载体。作为对照，每个E7蛋白被单独插入gtCyaAd93，以观察HPV31、33、45、52和58的E7序列是否是存在问题，因为它们以前从未被插入CyaA蛋白。

表3：本发明嵌合蛋白的特征(BTpr_114的序列如SEQ ID NO：58所示；BTpr_116的序列如SEQ ID NO：61所示；BTpr_115的序列如SEQ ID NO：64所示；BTpr_117的序列如SEQ ID NO：67所示)；插入BTpr_131的E7序列如SEQ ID NO：70所示；插入BTpr_132的E7序列如SEQ ID NO：71所示；插入BTpr_133的E7序列如SEQ ID NO：73所示；插入BTpr_134的E7序列如SEQ ID NO：74所示；插入BTpr_120的E7序列如SEQ ID NO：72所示。

对这些一价、三价和四价抗原的生产和分析型特征进行了评价。

因此，预主(pre-master)细胞库(pre-MCB)被用于每个构建中，并用来检测IPTG参与的目标蛋白诱导(图9)。在诱导后，一价和三价候选物在SDS-PAGE凝胶分析中具有正常图谱，而四价候选物在预期大小处显示出一个浅带。

该图谱已被确认为5升发酵罐中所发酵的每个分子。所产生的嵌合蛋白的特性汇总于表4中。

表4：一价、三价和四价嵌合蛋白的生产和分析型特征

从生产的角度看，不管什么缺失，带有一价和三价抗原的重组体gtCyaAs产生了可接受的产量和纯度(>90％)，而四价候选物具有降低的纯度(目标蛋白的11％)。

当比较带有93个残基缺失的候选物与缺失203个残基的候选物时，考虑整体的纯度，结果显示，后者的产量低于gtCyaAd93(Btpr114和Btpr_115)构建体。这种差异是相当令人惊讶，因为人们期望更短的重组体gtCyaA更容易产生产物。

带有其抗原的这两个载体没有酶活性，强调了缺失足以使载体解毒。

D.带有至少4个E7的GtCyaA的生产具有序列依赖性

我们进一步研究了以四价候选物获得的结果是否取决于CyaA中的E7多肽序列数或者CyaA中的E7多肽序列的特定组配。为了这个目的，对各种构建体进行了测试(表5)。

表5：带有三价和四价HPV抗原的嵌合蛋白

进行了Pre-MCB诱导检测，并令人惊奇地是，在CyaA中的E7序列数并不限制。这与抗原的整体序列性质所相当。此外，当与全长抗原(BTpr_165、166、173和174)相比，Btpr_161、162、169和170显示出目标蛋白的产量较低(表6)。

表6：pre-MCB诱导结果的总结

根据以上实验，我们可以得出这样的结论：gtCyaAd93和gtCyaAd203接受对应于至少4个E7蛋白的等效多肽序列。然而，该序列和所选E7片段的排列可能会对产量和纯度造成影响，从而具有或多或少地有利工业化潜力。

用预MCB观察到的结果的确认

本发明人进一步研究了是否在预MCB水平所获得的结果确认为特定关注的gtCyaAd93载体中的四价构建体。在5L规模中，对表达谱好于BTpr_143或与BTpr_115相当的蛋白进行了检测。下表总结了所获得的结果。

表7：preMCB诱导和5L生产结果汇总

根据上述实验，得出以下结论：

1.除了Btpr_175，所有检测的构建体都改善了整个生产率和纯度。

2.含有gtCyaAd203的重组蛋白中，其生产率和表达谱总是次于含有gtCyaAd93的重组蛋白。

3.gtCyaAd93载体允许生产含4个HPV抗原的重组蛋白，且其产量和纯度高于gtCyaAd203载体。

4.这些结果证实了pre-MCB中获得的观察。

E.含有大量抗原的gtCyaAd93和gtCyaAd203具有免疫原性

E.1BTpr_114、BTpr_115、BTpr_116和BTpr_117的免疫原性

进一步研究了BTpr_114、BTpr_115、BTpr_116和BTpr_117嵌合蛋白的免疫原性。用安慰剂或ProCervix(阳性对照，由CyaA-HPV16 E7+CyaA-HPV18 E7组成)或分别用Btpr_114(gtCyaAd93-PEP216-CyaCopt)、BTpr_115(gtCyaAd93-pep217-CyaCopt)、BTpr_116(gtCyaAd203-pep216-CyaCopt)和BTpr_117(gtCyaAd203-pep217-CyaCopt)对小鼠进行皮内接种。所有组均用聚IC-LC作为佐剂。接种7天后，对小鼠实施安乐死，并用先前鉴定的MHC I类限制性肽再刺激脾细胞。结果如图10所示。

图10表明：

-用10μg ProCervix的免疫诱导产生期望水平的HPV16 E7_49-57和HPV18 E7_AS43-49特异性IFN-γ应答。

-用三价候选疫苗获得的抗原特异性应答等同于ProCervix获得的抗原特异性应答。

-在特异性T细胞应答的频率方面，三价候选物之间没有观察到差异。

-针对HPV16抗原的应答较低归因于以下的事实：HPV16表位弱于HPV18表位，C56LB/6小鼠对HPV18表位非常敏感。

这些观察可得出以下的结论：皮内免疫后，在小鼠中的HPV16 E749-57和HPV18E7AS43-49特异性IFN-γ应答的诱导方面，聚ICLC作为佐剂的gtCyaAd93-PEP216-CyaCopt、gtCyaAd203-PEP216-CyaCopt、gtCyaAd93-PEP217-CyaCopt和gtCyaAd203-PEP217-CyaCopt的有效性如同聚ICLC作为佐剂的ProCervix。

因为在实验时，在小鼠中，没有MHC-I限制性肽被确认为HPV45 E7，用被分成3个子库(#218-1、#218-2和#218-3)的HPV45 E7-肽文库再刺激脾细胞。该实验是首个再刺激，其对发明人是已知的，借助于肽文库进行，而不是对应于一个公知表位的肽。

图11显示，用#218-3肽子库而不是#218-1和#218-2子库进行的离体再刺激，能重新刺激T细胞，其通过gtCyaAd93-PEP216-CyaC_opt、gtCyaAd203-PEP216-CyaC_opt、gtCyaAd93-PEP217-CyaC_opt和gtCyaAd203-PEP217-CyaC_opt接种引发。负责这一免疫应答的肽序列是IELTVESSAEDLRTL。

引人注目的是，在接种ProCervix的组中观察到了类似的应答，该ProCervix不携带HPV45 E7序列。该结果可通过以下来解释：存在于包含在#218-3库和ProCervix疫苗中的HPV16 E7或HPV18 E7序列中的表位之间的交叉反应。

总之，这些结果表明，具有复杂结构(21个半胱氨酸)和酸性电荷的抗原能通过gtCyaAd93和gtCyaAd203进行正确输送，并由抗原呈递细胞(APC)进行加工。这是出乎意料，当考虑Preville等^[5]、Karimova等^[7]和Gmira等^[8]教导的结果时。

此外，在CyaA的催化结构域中进行的缺失可提供关于输送的异源多肽的优点，其是通过降低CyaA特异性T细胞和CyaA特异性B细胞应答的水平(所述缺失导致CyaA的主要MHC I类和II类限制性表位数量的减少)来实现的。

E.2存在于Btpr_163、BTpr_164、BTpr_165、BTpr_166、BTpr_167、BTpr_168、BTpr_173和BTpr_175中的新引导物的免疫原性

在C57BL/6小鼠中，进一步研究了存在于Btpr_163、BTpr_164、BTpr_165、BTpr_166、BTpr_167、BTpr_168、BTpr_173和BTpr_175中的新引导物的免疫原性。

小鼠皮内分别接种安慰剂或每个引导物。所有组均以聚ICLC作为佐剂。

接种7天后，对小鼠实施安乐死，用每个检测的E7抗原肽文库再刺激脾细胞。所有检测引导物具有免疫原性。在C57BL/6小鼠中，未检测针对HPV31、45和58的免疫原性，因为这些工具并不适合(在小鼠的遗传背景不合适)。按照材料和方法中所描述的，在其它品系小鼠中，检测针对这些E7蛋白的免疫原性。

表8：在C57BL/6小鼠中的检测引导物的免疫原性

这些结果表明：

-每个引导物用10μg的免疫可诱导特异性IFN-应答。

-gtCyaAd93和gtCyaAd203能将抗原正确输送至抗原呈递细胞。

-测定了针对HPV16、18、33和52的E7蛋白的特异性免疫应答。

这些结果允许针对六价和七价混合物的免疫应答进行进一步调查研究。

E.3：一个六价候选疫苗的免疫原性。

在C57BL/6小鼠中，评价了两个三价引导物的六价混合物的免疫应答。这些引导物是分别包含HPV16-18-45的E7蛋白和HPV31-52-58 E7蛋白的BTpr_114和BTpr_165。采用如前所述的相同方案。因为在实验时，在小鼠中没有已知的MHCI限制性肽被鉴定为HPV52 E7，用被分成3个子库(221-1、221-2和221-3)的HPV52 E7-肽文库再刺激脾细胞。对于HPV 16E7和HPV 18E7再刺激，肽文库也被使用并分为3个子库(分别为116-1、116-II、116-III和171-I、171-II和171-3)。

其结果如图15所示。

这些结果证实：

-用10μg六价混合物的免疫可诱导HPV16 E7、HPV18 E7和HPV52 T细胞应答，其可通过IFN-γ酶联免疫斑点法测定。

-带有各自抗原的每个gtCyaAd93能将抗原输送至抗原呈递细胞(APC)，并促进针对可测量的HPV类型的抗原特异性T细胞应答。

-在E7特异性T细胞应答频率方面，在单独三价成分和和六价候选疫苗之间并未观察到差异(数据未显示)。

这些观察允许得出以下结论：皮内免疫后，在C57BL/6小鼠中诱导HPV16 E7、HPV18E7和HPV52 E7特异性T细胞应答方面，聚ICLC作为佐剂的Btpr_114和Btpr_165是有效的。

E.4.两个七价候选疫苗的免疫原性

根据生产率和纯度的结果，在C57BL/6小鼠中检测了2个七价组合物：Btpr_165+Btpr_163和Btpr_166+Btpr_164。分别用10μg的每个七价候选疫苗经皮内免疫小鼠。

如图16所示，这些结果表明为：

-HPV16 E7：用#116-2j(c+d)肽子库进行的体外再刺激，能够重新刺激T细胞，其通过用隐含HPV16E7的这两个七价候选疫苗或单独它们的成分进行接种来引发。

-HPV18 E7：用#171-I和#171-II肽子库进行的体外再刺激，能够重新刺激T细胞，其通过用隐含HPV18E7的这两个七价候选疫苗或它们的单独成分进行接种来引发。

-HPV33 E7：

○对于由Btpr_166和Btpr_164构成的七价候选疫苗，用#220-2肽子库进行的体外再刺激，能够重新刺激T细胞，其通过疫苗接种来引发。

○对于由Btpr_165和Btpr_163构成的七价候选疫苗，用#220-1、#220-2和#220-3肽子库进行的体外再刺激，能够重新刺激T细胞，其通过疫苗接种来引发。

-HPV52 E7：用#221-2和#221-3肽子库进行的体外再刺激，能够重新刺激T细胞，其通过用隐含HPV52E7的这两个七价候选疫苗或它们的单独成分进行接种来引发。

总之，生产和免疫原性的这些结果表明：

-带有3和4个HPV E7蛋白的重组gtCyaAd93能以良好的生产率进行生产和纯化；

-重组gtCyaAd203蛋白也可被生产和纯化，但其生产率次于含有相同抗原的gtCyaAd93载体。

-带有3和4个HPV E7蛋白的两个重组gtCyaAd93能将它们的抗原正确地输送至APC。

-在C57BL/6小鼠中，针对每种免疫原性的HPV类型，测定特异性免疫应答。

-用重组gtCyaAd93进行的E7蛋白设计可能会影响针对E7抗原(例如，如说明的HPV33 E7)的免疫应答。

-具有复杂结构(21个半胱氨酸)和酸性电荷的抗原能通过gtCyaAd93进行正确输送，并由抗原呈递细胞(APC)进行加工。这是出乎意料的，特别是考虑来自Gmira等(2001年)和Fayolle等(1998年)的结果时。

F.候选物的细胞毒性效率

F.1三价候选疫苗的CD8介导的细胞毒性效率

为了比较三价候选物在细胞毒性诱导方面的效率，在带有或不带有佐剂的情况下，进行体内杀死检测。收集空白对照小鼠的脾细胞，并分别带有来自HPV16、HPV18和HPV45的E7蛋白的肽文库。

在存在或不存在聚IC-LC情况下，将4组小鼠分别接种安慰剂、gtCyaAd93-pep216-CyaCopt、gtCyaAd93-pep217-CyaCopt和gtCyaAd203-pep217-CyaCopt。

在佐剂的存在下，候选物之间没有观察到差别(数据未示出)。在图12的左侧面版(带有文库#171-1和#171-2)中，在杀灭百分比方面，接种了包含全长抗原(pep217)的嵌合蛋白的小鼠优于接种了包含缺失抗原pep216的嵌合蛋白的小鼠。类似地，在图12的右侧面版(带有肽文库#218-3)中，当与安慰剂相比，在接种了包含pep217的嵌合蛋白的小鼠中的杀灭百分比出众，而在接种了包含pep216的嵌合蛋白的小鼠中未观察到杀死。没有聚LCLC佐剂的情况下，与缺失其酸性结构域的抗原相比，隐含全长抗原的gtCyaA在杀死它们的靶细胞方面更加有效。这是出乎意料的，因全长抗原包含E7酸性结构域，并且根据根据文献的教导，其与缺失该酸性结构域的抗原相比，效率应该较低。

这些结果表明：

-全长抗原可能具有表位(辅助性T细胞表位)，其有利于通过CD8⁺T淋巴细胞的杀死应答；以及

-gtCyaA载体允许带有酸性区域的抗原的输送。

F.2七价候选疫苗的CD8介导的细胞毒性效率

为了比较七价候选疫苗在诱导E7特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)能力方面的效率，在佐剂的存在下，进行体内杀死测定。收集空白对照小鼠的脾细胞，其分别带有来自HPV16和HPV18的E7蛋白的肽文库。

在聚ICLC的存在下，对3组小鼠分别接种安慰剂、BTpr165+BTpr163和BTpr166+BTpr164。

在安慰剂组，未观察到E7特异性杀死。两个七价候选疫苗诱导E7特异性杀死分别带有HPV16 E7肽文库(图17-A)或HPV18 E7肽文库(图17-B)的细胞。

这些结果表明，这两个七价候选物诱导功能性HPV16和HPV18的E7特异性CTL。

G.在带有TC-1肿瘤的小鼠进行肿瘤消退测定

我们对使用TC-1肿瘤细胞模型的以下4个三价候选物的治疗效率进行了进一步研究：

Btpr_114(gtCyaAd93-PEP216-CyaCopt)、BTpr_115(gtCyaAd93-pep217-CyaCopt)、BTpr_116(gtCyaAd203-pep216-CyaCopt)和BTpr_117(gtCyaAd203-pep217-CyaCopt)。

在第0天，所有小鼠接种TC-1细胞(表达HPV16 E7抗原)。第1组不进行治疗。第2组用PBS和聚ICLC治疗，第3组用聚ICLC作为佐剂的ProCervix治疗，第4组用聚ICLC作为佐剂的gtCyaAd93-pep216治疗，第5组用聚IC-LC作为佐剂的gtCyaAd203-pep216治疗，第6组用聚ICLC作为佐剂的gtCyaAd93-pep217治疗以及第7组用聚ICLC协助的gtCyaAd203-pep217治疗。每组由10只小鼠构成。

图13显示所有小鼠形成了肿瘤。然而，用嵌入HPV16 E7抗原的CyaA候选疫苗和佐剂聚ICLC进行接种的小鼠在第65天表现出强的肿瘤清除率：以ProCervix+聚ICLC(第3组)治疗的10只小鼠中，9只清除了肿瘤；以gtCyaAd93-pep216+聚ICLC(第4组)治疗的10只小鼠中，9只消退了肿瘤；以gtCyaAd203-pep216+聚ICLC(第5组)接种的10只小鼠中，8只消退了肿瘤；以gtCyaAd93-pep217+聚ICLC(第6组)治疗的10只小鼠中，9只消退了肿瘤；以gtCyaAd203-pep217+聚ICLC(第7组)接种的10只小鼠中，9只消退了肿瘤。在未治疗或以安慰剂+聚ICLC治疗的10只小鼠中，分别有0只、1只消退了肿瘤。因此，仅用包含HPV16 E7抗原的候选疫苗接种的小鼠能显著消退肿瘤。这四个候选疫苗之间，在它们的消退肿瘤能力方面，未观察到差别。

这些结果表明，施用本发明的嵌合蛋白，如Btpr_114(gtCyaAd93-PEP216-CyaCopt)、BTpr_115(gtCyaAd93-pep217-CyaCopt)、BTpr_116(gtCyaAd203-pep216-CyaCopt)和BTpr_117(gtCyaAd203-pep217-CyaCopt)，能有效地消退诱发致癌性疾病的肿瘤。

H.三价候选物的治疗和预防功效

进一步评价了随着表达不同抗原的第一肿瘤的消除、接种小鼠能防止肿瘤的发展和生长的能力。将表达HPV18 E7抗原的LL2肿瘤细胞和对照细胞系LL2-GFP接种至存活的接种小鼠的腋下，该小鼠具有先前完全消退的TC-1移植瘤(表达HPV16 E7抗原)。

每组存活小鼠被分成2个子组，该子组接种LL2-HPV18 E7细胞或LL2-GFP细胞。结果如图14所示。

用嵌入HPV18 E7抗原的gtCyaA候选疫苗和佐剂聚ICLC进行接种的小鼠表现出针对LL2-HPV18 E7细胞系生长的强保护作用(在第3b、4b、5b、6b和7b组中，无小鼠发展成肿瘤)，而不是针对LL2-GFP细胞系的生长(在第3a、4a、5a、6a和7a组中，所有小鼠发展成肿瘤)。

总之，这些结果突出显示了，用三价候选物接种消除了TC-1肿瘤的小鼠能保护小鼠免于LL2-HPV18E7肿瘤，其表明所述接种小鼠已形成了针对HPV16E7抗原的治疗性的抗原特异性T细胞应答，并且也形成了针对HPV18 E7抗原的保护性的抗原特异性T细胞应答。

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