树突状细胞诱导的HPV16E6特异性CTL抗HPV16E6肺癌的特异性免疫应答的研究

摘要

肺癌是当今世界上最常见的恶性肿瘤之一，全球肺癌的发病率和死亡率均呈上升趋势。肺癌的病因与发病机制至今不完全明确，吸烟被认为是肺癌的首要致病因素。自1979年Syrj anen[1]首次提出人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)感染可能与肺癌的发生发展有关，越来越多的学者对HPV在肺癌中所起的作用进行了更加深入的研究，研究发现HPV对于促进肺上皮细胞的增生有重要作用同时具有致瘤性。因此，HPV可能是肺癌患者中较普遍存在的特异性肿瘤抗原。
　　肺癌传统治疗方式主要包括手术、放疗和化疗，尽管近年来发展迅速，但晚期肺癌患者的预后仍然很差。因此，研究和开发既具有抗肿瘤作用，同时又能够激发和增强患者免疫功能的治疗方法，成为目前肺癌治疗的新焦点以及未来提高肺癌临床治愈率的希望所在。随着肿瘤分子生物学、肿瘤免疫学及生物工程技术的发展，免疫治疗成为一种极具前景的治疗新途径。树突状细胞(Dendritic cell,DC)是一组起源于造血干细胞，体内分布广泛、具有迁移能力的免疫细胞，因成熟时细胞表面有标志性树突样突起而命名[2]。DC是目前体内功能最强大的抗原递呈细胞(Antigen presenting cell，APC)，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。作为一种专职的APC，DC能摄取、加工和处理抗原，能刺激初始T细胞活化和增殖，激发T细胞免疫，在肿瘤细胞免疫中起着非常重要的作用[3]。研究证实[4]由DC激活的细胞免疫特别是细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic tlymphocyte，CTL)介导的特异性免疫反应，在机体抗肿瘤免疫应答中起主导作用。CTL是一类可直接杀伤带有致敏抗原肽-组织相容性复合体分子(MajorHistocompatibility Complex，MHC)的肿瘤细胞的T细胞亚群，可以高效、连续、特异性的杀伤靶细胞，而不损伤正常组织细胞，是机体重要的抗肿瘤效应细胞[5]。体内外诱导、活化和扩增肿瘤特异性CTL是当前抗肿瘤免疫治疗的研究热点，具有广阔的应用前景。
　　在HPV感染与肿瘤免疫方面，研究者发现，HPV感染能够促进T细胞与HPV16E6蛋白相互作用，继而引起机体产生特异性T细胞反应，在宫颈癌[2]、乳腺癌[3]、大肠癌[4]、头颈部肿瘤[5]方面显示出有效地抗肿瘤效应。由于肺癌细胞免疫原性较弱，或者存在“抗原覆盖”、抗原加工途径缺陷、粘附分及协同刺激分子缺乏等因素，这使得其无法主动诱发机体产生有效的抗肿瘤免疫应答，以至于肺癌免疫治疗效果不理想。特异性T淋巴细胞过继免疫治疗效应快，不依赖患者自身的免疫功能状态，具有特异性杀伤肿瘤细胞作用，而不损伤正常细胞，在抗肿瘤免疫治疗中有重大的临床意义。HPV16 E6蛋白可在与HPV相关的肿瘤细胞中持续表达，因此可被当做免疫治疗的靶向抗原。所以，HPV16E6抗原特异性T细胞过继免疫治疗可能会在HPV16E6阳性肺癌患者身上建立有效的抗肿瘤免疫应答，取得较好的疗效。而在前期的实验研究中，我们已经成功构建了HPV16E6阻性肺癌细胞模型[6]。本课题分为以下三个部分进行研究:
　　第一部分 HPV16E6抗原特异性树突状细胞的培养和鉴定
　　目的:从人外周血分离、诱导、培养HPV16E6抗原特异性的成熟DC并鉴定其形态学、免疫生物学特征。
　　方法:用梯度离心法从健康人外周血分离单个核细胞，联合应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)、肿瘤坏死因子(TNF-a)以及HPV16E6抗原诱导成熟DC，观察DC形态，细胞流式仪分析DC表型。
　　结果:经诱导生成的细胞具有成熟DC的典型树突样突起形态，并且高表达CD80、CD83、CD86、HLA-DR、CD1a等表面分子。
　　结论:人外周血中分离出的单核细胞，可以诱导出HPV16E6抗原特异性的成熟DC。
　　第二部分 HPV16E6抗原特异性CTL体外抗HPV16E6肺癌的实验研究
　　目的:研究HPV16E6抗原特异性DC诱导的CTL体外对HPV16 E6肺癌细胞的杀伤效应。
　　方法:利用HPV16 E6抗原特异性DC，与T细胞共培养，进一步刺激T细胞诱导出HPV16E6抗原特异性CTL;未经致敏的DC诱导出的CTL为非特异性CTL。将HPV16E6抗原特异性CTL和非特异性CTL与肺癌细胞（表达HPV16 E6的H1299+肺癌细胞;不表达HPV16E6的H1299-肺癌细胞）共培养，Cell CountingKit-8(CCK8)试剂盒检测其对肺癌细胞的体外杀伤效应。
　　结果:体外试验中，在10∶1、20∶1、40∶1、80∶1的效靶比下HPV16E6抗原特异性CTL对H1299+肺癌细胞(sCTLH1299+组)的杀伤率分别为(26.48±3.04)％、(36.95±8.46)％、(49.69±11.57)％、(64.76±6.99)％;HPV16E6抗原特异性CTL对HPV16E6阴性的的H1299-肺癌细胞(sCTL H1299-组)的杀伤率分别为(15.07±7.20)％、(18.14±5.29)％、(30.56±6.75)％和（37.37±9.44）％;非特异性CTL对表达HPV16E6的H1299+肺癌细胞（nCTL H1299+组）的杀伤率分别为(19.29±4.11)％、(21.94±4.73)％、(25.65±7.52)％和(39.31±3.68)％。与sCTLH1299-组和sCTLH1299+组相比，sCTL H1299+组有明显的杀伤作用，差异有显著性，P＜0.05。
　　结论:体外试验中，HPV16E6抗原特异性CTL对HPV16E6阳性肺癌细胞有特异性杀伤作用。
　　第三部分 HPV16E6抗原特异性CTL体内抗HPV16E6肺癌的实验研究
　　目的:研究HPV16 E6抗原特异性CTL体内对肺癌的杀伤效应。
　　方法:建立H1299+肺癌荷瘤裸鼠模型，观察并记录肿瘤生长情况。将荷瘤裸鼠随机分为sCTL组(每只裸鼠尾静脉注射sCTL5×106个/0.2ml)、nCTL组(每只裸鼠尾静脉注射nCTL5×106个/0.2ml)和对照组（每只裸鼠尾静脉注射生理盐水0.2ml），观察裸鼠体内肿瘤大小并分别记录，每4天测量体重，并用游标卡尺测量记录肿瘤最长径(a)、最短径(b)，根据公式(V)=(a×b2)/2计算肿瘤体积;实验结束取肿块做HE染色，并在镜下观察对照组和CTL治疗组肿瘤细胞形态的变化，了解各组治疗方式对肿瘤细胞生长情况的影响。
　　结果:在动物实验中，成功建立H1299+肺癌荷瘤裸鼠模型。按实验方案分别对各组治疗后，肿瘤体积sCTL组（0.26±0.11cm3）和nCTL组(0.32±0.107cm3)与对照组（0.44±0.19cm3）出现明显的差别。sCTL组和nCTL组均出现抑瘤效应，肿瘤组织生长受到抑制，sCTL组更显著。对照组肿瘤细胞仍然呈现进行性生长，差异具有显著性(P＜0.05)。肿块标本进行HE染色，镜下示sCTL组及nCTL组瘤组织可见有大量淋巴细胞浸润。
　　结论:体内试验中，HPV16E6特异性CTL对HPV16E6肺癌有特异性杀伤作用。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

第二章 HPV16E6抗原特异性树突状细胞的培养与鉴定

2．1 前言

2．2 实验材料

2．2．1 基本原料

2．2．2 主要试剂

2．2．3 主要仪置

2．2．4 实验试剂的配制

2．3 实验方法

2．3．1 人外周血单核细胞的分离

2．3．2 树突状细胞的培养

2．4 实验结果

2．4．1 DC的形态变化

2．4．2 流式细胞仪检测结果

2．5 讨论

第三章 HPV16E6抗原特异性CTL体外抗HPV16E6阳性肺癌的实验研究

3．1 前言

3．2 实验材料

3．2．1 基本原料

3．2．2 主要试剂

3．2．3 主要仪器

3．3 实验方法

3．3．1 DC刺激淋巴细胞增殖

3．3．2 DC诱导的特异性CTL对肿瘤细胞杀伤作用

3．3．3 统计学分析

3．4 实验结果

3．4．1 DC刺激淋巴细胞增殖

3．4．2 DC诱导的特异性CTL对肿瘤细胞杀伤作用

3．5 讨论

第四章 HPV16E6抗原特异性CTL体内抗HPV16E6阳性肺癌的实验研究

4．1 前言

4．2 实验材料

4．2．1 实验动物及细胞

4．2．2 主要试剂

4．2．3 主要仪器

4．3 动物实验方法

4．3．1 裸曩荷瘤模型的建立

4．3．2 荷瘤裸鼠的分组及处理

4．3．3 肿瘤标本的处理

4．3．4 统计学分析

4．4 实验结果

4．4．1 移植瘤生长情况

4．4．2 肿瘤组织病理观察

4．5 讨论

全文结论

参考文献

综述 肺癌的被动免疫治疗

硕士期间已发表文章

致谢