一种基于DNA自组装和G四聚体的分子检测方法及检测试剂盒

摘要

本发明公开一种基于DNA自组装和G四聚体的分子检测方法及检测试剂盒。分子与核酸适体相互作用，启动DNA自组装介导的链置换反应，不断打开茎环结构DNA，并激活封闭的G四聚体序列，从而可以产生大量的具有活性的G四聚体结构。G四聚体与hemin结合后具有HRP催化活性，可催化氧化TMB，产生蓝色底物，使结果肉眼可见，分子的浓度与蓝色深浅直接相关。本发明操作简单，无需工具酶的使用，可在室温下完成整个反应，具有较高的灵敏度，对双酚A的检测限为1 pg/mL，反应具有很好的特异性，检测结果肉眼可见，无需检测仪器，可用于分子，特别是双酚A的现场快速分析。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于核酶的分子检测方法，特别涉及基于DNA自组装和G四聚体的分子检测方法及基于该方法的检测试剂盒。

背景技术

环境中存在多种对人体有害的分子，快速、低成本地检测出这些有害小分子具有非常实际的意义。

双酚A（Bisphenol A，BPA），化学名为2,2-二（4-羟基苯基）丙烷，主要用于合成环氧树脂，聚碳酸酯等多种高分子材料，被广泛用于生产各种塑料制品。双酚A主要通过食品包装材料、饮水杯、供水管、奶瓶以及塑料薄膜等渗入食品而进入体内，并能在生物体内富集，并且不易被降解。即使极低的浓度的双酚A也会对内分泌系统、免疫系统、生殖系统产生一系列的不良影响。传统的双酚A检测技术主要有高效液相色谱法等一些仪器分析方法，这些技术需要繁琐的样品前处理和昂贵的仪器，检测成本高、费时耗力，难以用于大批量样本的实地现场快速检测。

另外，也有以抗体来检测双酚A的技术，但是抗体的制备过程麻烦，保存条件苛刻，而且需要多次洗涤与分离过程，因而限制了它们的广泛应用。

G四聚体序列是由富含G碱基的一段单链DNA组成，在缓冲体系和hemin（氯高铁血红素）存在的情况下，可折叠成G四聚体二级结构。G四聚体具有类似HRP（辣根过氧化物酶）的催化活性，可催化氧化TMB（四甲基联苯胺）产生蓝色底物，使反应溶液肉眼可见。以G四聚体来检测双酚A具有操作简单，方便现场快速分析等优点。但是基于G四聚体的比色法检测灵敏度低，需要进一步提高灵敏度。传统的信号放大技术主要是PCR以及一系列依赖工具酶的信号扩增技术，但是酶的使用不仅增加了成本和操作步骤，而且酶的存储也比较麻烦，因此需要研发一种无需工具酶信号扩增技术来提高检测灵敏度。

核酸适体（aptamer，源于拉丁语）指的是经体外筛选技术SELEX(指数富集配体系统进化)筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段。它是一系列单链核酸分子，与特异靶分子相结合，特异性如同抗体一样，对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于DNA自组装和G四聚体的分子检测方法及检测试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

一种基于DNA自组装和G四聚体的检测试剂盒，包括TMB显色缓冲液、氯高铁血红素、DNA杂交缓冲液，还包括如下核酸序列：

DNA1：将待测分子核酸适体的一端适当延伸，形成DNA1，延伸的核酸序列中，靠近待测分子核酸适体的核酸序列依次记为1*、2*和3*区；

DNA2：DNA2至少与DNA1的1*区域和待测分子核酸适体的部分核酸互补配对；

DNA3：具有茎环结构，其核酸序列依次为1、2、3、4*、3*、2*、5*和6*区，2、3和2*、3*互补配对形成茎结构，环为4*区，1、2、3分别和DNA1的1*、2*和3*区互补配对；

DNA4：具有茎环结构，其核酸序列依次为3、4、3*、2*和4*区，4和4*区形成茎结构，环为3*和2*区，3、4、3*、2*区分别和DNA3的3*、4*、3、2区互补配对；

DNA5：依次为5*、6*和G四聚体封闭区，5*、6*区与DNA3的5*和6*区相同；

DNA6：依次为G四聚体、6、5、和2区，6、5、和2区分别和DNA3的6*、5*和2*互补配对。

作为上述检测试剂盒的进一步改进，DNA2至少与待测分子核酸适体的8个碱基互补配对。

作为上述检测试剂盒的进一步改进，1～6、1*～6*区中，每个区至少含有6个碱基。

作为上述检测试剂盒的进一步改进，DNA5的G四聚体封闭区至少与DNA6的G四聚体中的6个碱基互补配对。

作为上述检测试剂盒的进一步改进，对1～6、1*～6*区核酸序列中的至少一个核苷酸进行修饰，以在不改变碱基配对原则的情况下提高核酸序列之间的亲和力。

一种双酚A的检测试剂盒，包括TMB显色缓冲液、氯高铁血红素、DNA杂交缓冲液，还包括如下核酸序列：

DNA1：5'-CGACATCT（3*）AACCTAGC（2*）TCACTGAC（1*）CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3'（SEQ ID NO：1）；

DNA2：5'-TAAGCTGGAAGCGTCAGTGA-3'（SEQ ID NO：2）；

DNA3：5'-GTCAGTGA（1）GCTAGGTT（2）AGATGTCG（3）CCATGTGTAGA（4*）CGACATCT（3*）AACCTAGC（2*）CCTTGTCA（5*）TAGAGCAC（6*）-3'（SEQ ID NO：3）；

DNA4：5'-AGATGTCG（3）TCTACACATGG（4）CGACATCT（3*）AACCTAGC（2*）CCATGTGTAGA（4*）-3'（SEQ ID NO：4）；

DNA5：5'-CCTTGTCA（5*）TAGAGCAC（6*）TCCCTC（G四聚体封闭区）-3'（SEQ ID NO：5）；

DNA6：5'-CTGGGAGGGAGGGAGGGA（G四聚体序列）GTGCTCTA（6）TGACAAGG（5）GCTAGGTT（2）-3'（SEQ ID NO：6）。

一种分子的检测方法，包括如下步骤：

1)      将过量DNA5和DNA6于DNA杂交缓冲液中混合反应，形成DNA5-DNA6复合物；

2)      将DNA1和过量DNA2于DNA杂交缓冲液中混合反应，形成DNA1-DNA2复合体；

3)      将DNA1-DNA2复合体内加入待测样品、DNA3和DNA4，混合反应完全，得到DNA3-DNA4复合物；

4)      将DNA3-DNA4复合物、DNA5-DNA6复合物、氯高铁血红素、TMB显色缓冲液混合，如反应体系产生蓝色底物，说明待测样品含有待测分子；

其中，DNA1～DNA 6的序列组成如上所示。

作为上述分子检测方法的进一步改进，DNA杂交缓冲液为Tris-HCl缓冲液，含有200 mM NaCl以及50 mM KCl。

作为上述分子检测方法的进一步改进，TMB显色缓冲液，含有26.6 mM柠檬酸，51.4 mM磷酸氢二钠，25 mMKCl，10 mL 0.5%的TMB，20 mL 30%的H₂O₂，pH=5.0。

本发明的有益效果是：

1)      本发明的检测方法及检测试剂盒具有较高的灵敏度，对双酚A的检测限为1 pg/mL，检测结果肉眼可见，适于现场快速分析。

2)      本发明所述的分子检测方法应用核酸适体实现待测分子的捕捉，具有很好的特异性，其他常见的干扰物对检测不产生影响。

3)      以G四聚体作为信号报告分子，结合DNA自组装介导的信号放大技术，可产生大量的具有催化活性的G四聚体，整个操作简单，经济便宜，不需要使用任何检测仪器，不需要专业技术人员，无须培训即可推广使用。

附图说明

图1 是DNA1-DNA2复合体在双酚A作用下脱离的原理示意图；

图2是DNA3-DNA4复合体形成的原理示意图；

图3是显色反应阶段的原理示意图；

图4是不同浓度的双酚A检测的结果图；

图5是特异性实验结果图。

具体实施方式

一种基于DNA自组装和G四聚体的检测试剂盒，包括TMB显色缓冲液、氯高铁血红素、DNA杂交缓冲液，还包括如下核酸序列：

DNA1：将待测分子核酸适体的一端适当延伸，形成DNA1，延伸的核酸序列中，靠近待测分子核酸适体的核酸序列依次记为1*、2*和3*区；

DNA2：DNA2至少与DNA1的1*区域和待测分子核酸适体的部分核酸互补配对；

DNA3：具有茎环结构，其核酸序列依次为1、2、3、4*、3*、2*、5*和6*区，2、3和2*、3*互补配对形成茎结构，环为4*区，1、2、3分别和DNA1的1*、2*和3*区互补配对；

DNA4：具有茎环结构，其核酸序列依次为3、4、3*、2*和4*区，4和4*区形成茎结构，环为3*和2*区，3、4、3*、2*区分别和DNA3的3*、4*、3、2区互补配对；

DNA5：依次为5*、6*和G四聚体封闭区，5*、6*区与DNA3的5*和6*区相同；

DNA6：依次为G四聚体、6、5、和2区，6、5、和2区分别和DNA3的6*、5*和2*互补配对。

作为上述检测试剂盒的进一步改进，DNA2至少与待测分子核酸适体的8个碱基互补配对，以确保DNA1-DNA2复合物的稳定性。同时DNA2与待测分子核酸适体的碱基互补配对数也不宜过多，一般不超过20个碱基互补配对，以免影响待测分子与DNA1中的核酸适体竞争性结合从而把DNA2置换下来。

作为上述检测试剂盒的进一步改进，1～6、1*～6*区中，每个区至少含有6个碱基，以确保对应区域结合的稳定性。优选的，为6～20个，更佳为6～15个、6～10个。

作为上述检测试剂盒的进一步改进，DNA5的G四聚体封闭区至少与DNA6的G四聚体中的6个碱基互补配对，封闭后的G四聚体没有催化活性。

作为上述检测试剂盒的进一步改进，对1～6、1*～6*区核酸序列中的至少一个核苷酸进行修饰，以在不改变碱基配对原则的情况下提高核酸序列之间的亲和力。如通过锁核酸修饰以提高碱基之间的亲和力，使用较短的序列实现本发明的技术方案。

下面结合附图，以双酚A的检测为例，进一步说明本发明的检测原理：

DNA1-DNA2复合体的形成：双酚A的核酸适体的一端适当延伸，形成DNA1，靠近核酸适体一端包含3个区域，分别是1*，2*，3*。DNA2与部分DNA1互补。将DNA1和DNA2在缓冲体系中反应一段时间，形成DNA1-DNA2复合物。在DNA1-DNA2复合物中，DNA1中的1*区域被DNA2封闭。当DNA1-DNA2反应体系中存在双酚A时，双酚A将与核酸适体相互作用，从而把DNA2置换下来，使DNA1中的1*区域暴露出来（原理如图1所示）。如无双酚A存在，DNA1-DNA2复合物稳定存在，DNA1中的1*区域无法暴露。

DNA3-DNA4复合体的形成与放大：DNA1中暴露的1*区域可作为DNA支点，将会与DNA3中的1区域互补结合，启动DNA自组装链置换反应，介导DNA1中的2*、3*区域与DNA3中的2、3区域结合，形成更长的双链DNA（1-1*、2-2*、3-3*），从而打开颈环结构的DNA3，使DNA3中的3*区域暴露（原理图2反应a所示）。DNA4中的3区域从而能与暴露的DNA3中的3*区域结合，启动DNA自组装链置换反应，介导DNA4的4、3*、2*区域与DNA3的4*、3、2区域结合，形成更长的双链DNA（3*-3、4*-4、3-3*、2-2*），从而把颈环结构的DNA4也打开（原理图2反应b所示）。形成的复合物DNA1-DNA2-DNA3本身不稳定，DNA1链会自动脱离，从而循环进入下一轮的DNA自组装信号扩增（原理图2反应c所示），从而不断形成DNA3-DNA4复合物。在DNA3-DNA4复合物中2*区域是暴露的。如无双酚A存在，则DNA1中的1*区域不会启动DNA3的自组装链置换反应，无法形成DNA3-DNA4复合体，反应终止。

显色反应：将DNA5和DNA6在缓冲液中反应一段时间，出现DNA5-DNA6复合物。其中DNA6的5'端是一段G四聚体序列，部分G四聚体序列被DNA5的G四聚体封闭区封闭，此时的G四聚体没有催化活性（如原理图3所示）。将DNA3-DNA4加入到DNA5-DNA6复合物中，DNA3中暴露的2*区域将会与DNA6中的2区域杂交，启动链置换反应，从而把DNA5置换下来，形成DNA3-DNA4-DNA6复合物，在该复合物中，封闭的G四聚体序列被暴露出来，形成具有活性的G四聚体序列。G四聚体序列再与hemin（氯高铁血红素）相互作用，能够催化氧化TMB-H₂O₂（四甲基联苯胺-双氧水）检测体系，产生蓝色的底物，结果肉眼可见，从而达到检测双酚A的目的。

下面结合实施例，进一步说明本发明的技术方案。

双酚A检测试剂盒：

试剂盒包括如下成分：

（1）检测用DNA序列：DNA1～DNA6的序列分别如下：

DNA1：5'-CGACATCT（3*）AACCTAGC（2*）TCACTGAC（1*）CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3'（SEQ ID NO：1）；

DNA2：5'-TAAGCTGGAAGCGTCAGTGA-3' （SEQ ID NO：2）；

DNA3：5'-GTCAGTGA（1）GCTAGGTT（2）AGATGTCG（3）CCATGTGTAGA（4*）CGACATCT（3*）AACCTAGC（2*）CCTTGTCA（5*）TAGAGCAC（6*）-3'（SEQ ID NO：3）；

DNA4：5'-AGATGTCG（3）TCTACACATGG（4）CGACATCT（3*）AACCTAGC（2*）CCATGTGTAGA（4*）-3'（SEQ ID NO：4）；

DNA5：5'-CCTTGTCA（5*）TAGAGCAC（6*）TCCCTC（G四聚体封闭区）-3'（SEQ ID NO：5）；

DNA6：5'-CTGGGAGGGAGGGAGGGA（G四聚体序列）GTGCTCTA（6）TGACAAGG（5）GCTAGGTT（2）-3'（SEQ ID NO：6）；

（2）DNA杂交缓冲液：Tris-HCl缓冲液，含有200 mM NaCl以及50 mM KCl；

（3）氯高铁血红素；

（4）TMB显色缓冲液：含有26.6 mM柠檬酸，51.4 mM磷酸氢二钠，25 mM KCl，10 mL 0.5%的TMB，20 mL 30%的H₂O₂，pH=5.0。

实施例1：

所使用的试剂如上述双酚A检测试剂盒所述，具体检测方法如下：

1)      先用Tris-HCl缓冲液（20 mM，pH为7.4，含有200 mM NaCl以及50 mM KCl）分别溶解DNA1、DNA2、DNA3、DNA4、DNA5、DNA6；

2)      100 nM的DNA1与400 nM的DNA2混合，室温反应20分钟，形成DNA1-DNA2混合物；其中DNA2过量就是为了保证封闭全部DNA1；

3)      把不同浓度的双酚A加入到DNA1-DNA2混合物中，室温反应45分钟；

4)      再加入1 mM的DNA3和DNA4，室温反应1个小时；

5)      将1.2 mM的DNA5与1 mM的DNA6混合，室温反应30分钟，形成DNA5-DNA6混合物；其中DNA5过量就是为了保证封闭全部DNA6。然后再加入到步骤（3）中的反应液中，室温反应30分钟；

6)      加入0.3 mM 的hemin（氯高铁血红素），室温反应30分钟；

7)      取出50 mL反应液，加入到950 mL显色缓冲液中（含有26.6 mM柠檬酸，51.4 mM磷酸氢二钠，25 mM KCl，10 mL 0.5%的TMB，20 mL 30%的H₂O₂，pH=5.0），室温反应15分钟，即可观察颜色变化。

最低检测限的确定：

配制双酚A标准溶液，浓度分别为1 pg/mL，10 pg/mL，100 pg/mL，1 ng/mL和10 ng/mL，室温保存。

将不同浓度的双酚A溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后观察实验结果，如图4所示，1 pg/mL的双酚A可产生明显的蓝色变化，说明其检测限为1 pg/mL。随着双酚A浓度的增加，颜色也增加，并逐渐趋于饱和。

特异性实验：

配制浓度为10 ng/mL的不同干扰物标准溶液，分别是雌三醇、17b-雌二醇、孕酮、西维因、洁霉素、丝裂霉素。

将10 ng/mL的不同干扰物标准溶液和100 pg/mL双酚A标准溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后观察颜色变化，如图5所示，10 ng/mL的雌三醇、17b-雌二醇、孕酮、西维因、洁霉素、丝裂霉素没有产生颜色变化，对检测不产生影响。只有当加入双酚A后才会产生蓝色，这证明该方法对双酚A的检测具有很好的特异性。

<110>  广东省生态环境与土壤研究所

 

<120>  一种基于DNA自组装和G四聚体的分子检测方法及检测试剂盒

 

<130> 

 

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<170>  PatentIn version 3.5

 

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<212>  DNA

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cgacatctaa cctagctcac tgacccggtg ggtggtcagg tgggatagcg ttccgcgtat       60

 

ggcccagcgc atcacgggtt cgcacca                                           87

 

 

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<212>  DNA

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<212>  DNA

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<212>  DNA

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