一种基于切刻酶的双链核酸等温扩增检测新方法

摘要

本发明涉及对双链核酸进行等温扩增及检测的方法，属于核酸检测领域。更具体的，涉及在切刻内切酶和聚合酶的联合作用下从双链核酸靶标扩增出单链靶标，并应用两条扩增引物和一条置换引物在等温条件下高效特异性扩增目标核酸的方法。本发明中通过对一条扩增引物与扩增模板退火区域的选择，实现了仅用三条引物就可完成对靶标核酸的高效特异扩增。并且模板的3’端与该引物完全互补，在提高了特异性的同时避免了传统技术中存在置换引物占据扩增引物互补位置而引起的阻滞扩增的问题。扩增引物还可以设计为分子信标的形式，只有被正确扩增的靶标序列才会与该种形式的引物退火并产生后续荧光信号，具有更好的特异性。

说明书

技术领域

本发明涉及对核酸等温扩增及检测技术，属于核酸检测领域。更具体的，涉及在切刻内切酶和聚合酶的联合作用下，应用两条扩增引物和一条置换引物在等温条件下高效特异性扩增目标核酸的方法。 

本发明还涉及了对致病微生物核酸检测方面的应用。 

背景技术

近几十年来，随着聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)发明应用，极大的推动了双链核酸体外扩增和体外检测等领域的发展。因其高的灵敏度和较好的特异性从而在核酸扩增及分子检测领域得到广泛应用，是目前最常用的核酸扩增检测技术。该技术包括三个经典的步骤：即1)高温变性；2)低温复性；3)适温延伸。很明显，该技术是一个温度变化循环的的过程，需要特定的热循环仪实现精密的温度控制需要。同时，在温度变化过程中，反应体系可能会暴露于易于发生非特异性扩增的温度下，这是PCR及其衍生技术中，非特异性扩增产生的重要诱因之一。同时，人们认为复性的特异性直接影响扩增的特异性，因此，该技术通常需要优化复性温度以提高特异性，工作较为繁琐复杂。并且由于该类技术反应一般需要较长时间，满足不了即时检测领域对快速的要求。 

为克服以PCR技术为代表的核酸变温扩增技术的诸多弊端，人们开发了一系列等温扩增技术。其中，环介导等温扩增技术(Loop Mediated Isothermal Amplification，LAMP)是目前最为广泛应用的等温扩增技术。该技术是2000年日本学者Notomi等建立的体外扩增特异DNA片段的分子生物学技术，它由四条特异性引物识别双链靶标的六个区域，通过引物的延伸置换以及自身的碱基互补配对形成类似哑铃状的DNA结构，LAMP反应以此结构为起始结构，进行生长扩增和再循环，使得靶序列交替重复产生，最终形成具有很多环的花椰菜状的结构。LAMP技术的灵敏性和特异性都很高，并且反应一般可在20～60分钟内完成，速度较快。但是该技术所用引物众多，设计复杂，需要专门的设计软件；尽管该技术的扩增是在等温条件下进行的，但是双链靶标仍需要初始变性的步骤。 

依赖解旋酶恒温扩增技术(Helicase Dependent Isothermal DNA Amplification,HDA)是New England Biolabs公司的研究人员模拟体内DNA的复制机制发明的一种新的体外恒温核酸扩增技术。该技术采用解旋酶打开双链核酸，代替了PCR技术中采用热变性解链的方式，使得反应可以在等温条件下进行。但是该反应需要额外添加单链DNA结合蛋白(Single-stranded DNA-binding protein，SSB)增加了反应体系的复杂程度。 

链置换扩增(Strand Displacement Amplification,SDA)也是一种有效的扩增检测双链核酸的方法，由沃克(Walker)等人于1992年开发。该技术使用两组引物(两条扩增引物和两条置换引物)、限制性内切酶和具有链置换能力的DNA聚合酶以及修饰的碱基。置换引物置换首先延长的扩增引物产生下一步反应的单链。扩增引物与此单链互补并延伸，扩增引物中含有内切酶的识别位点，在采用硫代的特定碱基，使得内切酶仅能切割双链中的一条链产生切口，聚合酶在切口处合成新的链并将原先的链置换下来同时补平酶切位点，被置换的链又与扩增引物互补而开启循环扩增。该技术在专利US5270184A和US5455166A中有详细介绍。 BD公司(Becton,Dickinson and Company)应用该技术已经开发出一系列分子诊断产品。但是该技术需要四条引物的参与，体系复杂容易引起非特异性反应的发生，仍需要初始热变性的步骤，并且必须有修饰的碱基参与，增加了实验成本降低了反应效率。随着一系列切刻内切酶被开发出来，内切酶加修饰碱基所起的作用被切刻内切酶所代替，采用切刻酶和聚合酶的联合作用从双链核酸靶标上扩增出单链靶标，然后采用四条引物引发指数扩增。该过程在美国公开的专利US2008096257A1和US2009092967A1有详细介绍。但是该种技术方案容易引起非特异性反应的四条引物设计及反应效率等问题依然存在，所述的方法中，存在置换引物B2较扩增引物P2先延伸的可能性，这实质上相当于占据了扩增引物P2的模板阻滞了其与模板的退火和延伸的效率，增加反应体系的复杂性，降低了扩增效率。 

为了改善专利US2008096257A1和US2009092967A1所述技术存在的缺点，比如反应体系复杂容易引起非特异性扩增，置换引物占据模板阻滞扩增降低扩增效率等问题，本发明提供了一种简便高效的核酸等温扩增检测方法，该方法仅用三条引物就可实现靶标核酸的高效特异扩增，体系简单；扩增引物P2与单链模板退火区域紧邻切点的设计使得反应具有更好的特异性，并且模板的3’端与该引物完全互补，使得扩增出的模板可以被引物高效利用，反应效率更高；可依据反应温度选用不同的切刻内切酶，适用温度范围广，符合现场快速检测的需求。 

发明内容

本发明将切刻内切酶聚合酶联合作用于待检靶标核酸，在等温条件下下实现靶标核酸的快速扩增。 

一种在等温条件下扩增检测双链核酸靶标的方法，所述方法包括： 

a)保温双链核酸靶标、切刻内切酶和聚合酶、两条扩增引物和一条置换引物、以及扩增反应所必须的物质如dNTPs和缓冲液等。保温时间可为任意时间，但为了较好的反应效率及特异性，优选时间为优选30分钟到1小时。 

b)切刻内切酶识别双链核酸靶标上其识别位点，在切刻内切酶和聚合酶的共同作用下循环产生单链或者5’端游离的悬垂片段，下述均称为单链靶标； 

c)扩增引物P1和置换引物B1先后与步骤b)中所述单链靶标退火，并在聚合酶的作用下进行合成和链置换合成，产生游离的由扩增引物P1延伸形成的产物，称为单链模板，称之为单链模板； 

d)扩增引物P2与c)中单链模板退火，两者在聚合酶或者切刻内切酶与聚合酶的共同作用下互相以对方为模板延伸成为完整的双链核酸分子，称为双链模板。需要注意到，本步骤中扩增引物P2与单链模板的3’端退火后聚合酶能以单链模板3’端为起点合成DNA。并且此步骤中扩增引物P2除通常意义上的线状分子外，还包括分子信标的形式。 

e)切刻内切酶和聚合酶联合作用于步骤d)中产生的双链模板，循环扩增出可与扩增引物P1或P2互补的单链。该单链与扩增引物P1或P2退火，并在聚合酶或者聚合酶与切刻内切酶的共同作用下延伸成为双链核酸分子。 

f)切刻内切酶聚合酶联合作用于步骤e)中产生的双链核酸分子，循环扩增循环扩增出可与扩增引物P2或P1互补的单链。该单链与扩增引物P1或P2退火后又产生步骤e)所述的双链核酸分子。 

g)重复步骤e)和步骤f)，以指数形式产生核酸分子。 

所述扩增引物P1、扩增引物P2和置换引物B1其特征如下： 

a)扩增引物P1可为线状或茎环状分子，按照3’到5’的顺序可以分为：3’端与模板退火区域、切刻内切酶识别序列区域、以及5’端稳定序列区域。需要注意到，当扩增引物P1为茎环状分子时，所述切刻内切酶识别序列区域和5’端稳定序列区域应当包含形成茎环茎环结构的茎区和环区；本领域的研究人员应当明白如何分配上述碱基区域以得到预期的效果； 

b)扩增引物P2可为线状、茎环状或分子信标形式，可将其分为与单链模板退火区域、切刻内切酶识别序列区域以及稳定序列区域四个部分。根据扩增引物P2的形状不同确定上述各部分的组成，本领域的研究人员应当明白如何合理的进行各区域碱基的分配以达到预期的实验效果； 

c)所述稳定序列区域，是指当切刻内切酶产生切口后，位于切口上游的碱基序列。该部分的作用是为聚合酶提供可以结合的3’端，因此，切刻反应后该上游碱基在反应温度不会解离，为保证切刻内切酶产生切口后5’端稳定区域仍然以双链形式存在，该区域的Tm(解链温度)值应不低于反应温度。考虑到增加该区域碱基个数虽可增加Tm值，但会增加链的复杂程度，故优选的，该区域Tm值比反应温度稍高可以达到更佳效果，因此需要根据反应温度确定该区域碱基个数。 

d)同样的，根据反应温度确定扩增引物P1和P2的3’端退火区域碱基个数，该退火区域的Tm比反应温度高可达到更好效果。优选的，该区域的Tm值比反应温度高3～5℃。为保证扩增引物P1较置换引物B1先延伸，置换引物B1的Tm值低于扩增引物P1的3’端退火区域的Tm值可使反应更加高效。优选的，置换引物B1的Tm值比反应温度低2～3℃。 

同样的，为进一步提高扩增引物P1利用效率，调控扩增引物P1与置换引物B1的用量比例。 

两扩增引物切刻内切酶识别序列可不同，也可与双链靶标不同，即体系可采用三种不同的切刻内切酶。但是优选的，保持上述三处识别序列相同，即仅采用一种切刻内切酶。 

优化地，所述等温条件下对靶标核酸扩增检测的方法，所述核酸模板为DNA或RNA。 

加入核酸检测试剂可表征系统的信号变化。优化地，核酸检测试剂包括包括荧光检测试剂、电化学检测试剂、化学发光检测试剂、比色检测试剂等。 

所述的荧光检测试剂一般包括能嵌插入DNA发光的试剂，如溴化乙锭、SYBR Green I、GoodView等，也包括标记有荧光基团的分子信标等。 

所述的荧光检测可以利用能保持恒定温度和荧光扫描的仪器进行检测，也可以利用现有的PCR仪在恒定温度下进行反应，如采用伯乐CFX96荧光定量PCR仪器。 

所述的电化学检测试剂包括利用电化学手段进行寡核苷酸的检测，如辣根过氧化物酶电化学体系，三联吡啶钌电化学体系等。 

所述的比色检测试剂包括纳米金比色、钙黄绿素比色、ABTS比色等能发生颜色变化的试剂。 

所述的化学反光检测试剂包括鲁米诺及其衍生物-过氧化氢体系、吖啶脂类-过氧化氢体系、钌联吡啶+TPA体系等。 

本文中所用术语“切刻内切酶”，是可以识别双链DNA的特异序列，并在识别位点或其周围，在其中一条DNA链水解磷酸二酯键，产生3’羟基末端和5’磷酸末端，如Nb.BsrDI、Nb.BsmI、Nt.AlwI、Nb.BbvCI、Nb.BtsI、Nt.BsmAI、Nt.BbvCI、Nt.BstNBI、Nt.BspQI、Nt.CviPII或者其他类似的具有切刻功能的酶。 

本文中所用术语“聚合酶”为具有链置换活性的聚合酶，即该酶具有链置换的活性并且确实5’→3’外切酶活性，说的更确切些，该聚合酶可在作为模板的核酸序列基础上进行DNA复制并置换DNA链以释放退火到模板链上的互补链。如9°NmTmDNA聚合酶、Bst DNA聚合酶，大片段、Deep VentR DNA聚合酶、Bsu DNA聚合酶，大片段、Deep Vent(exo-)DNA聚合酶DNA聚合酶I，(Klenow)大片段、Klenow片段3’-5’exo-、、phi29DNA聚合酶、M-MuLV反转录酶、DNA聚合酶、VentR(exo-)DNA聚合酶或其他类似功能的聚合酶中的一种。 

本文中所用术语“退火”指的是通过根据沃森-克里克定律的碱基配对，形成双链结构的核酸。 

本文所用术语“引物”是指一种自然产生或人工合成的寡核苷酸，所述寡核苷酸当被置于诱发与一条核酸链互补的一种引物延伸产物合成的条件下时，能够作为合成的起始点，其中所述条件即有核苷酸和一种聚合反应试剂如DNA聚合酶的存在，以及适当的温度和缓冲条件。 

文所用术语“与……互补”是指一个核苷酸能与另一个特定的核苷酸碱基配对。即腺苷与尿苷或胸苷互补，鸟苷与胞苷互补。根据本说明书的目的应当认为，尽管在某些情况下胸苷与鸟苷可以碱基配对，亦不应将它们视为互补的。 

本文所用术语“双链”是指一条寡-多聚核苷酸与互补的寡-多聚核苷酸杂交。 

本文所用术语“扩增”是指在核酸序列的混合物中令一种特定核酸序列的浓度升高的任何扩增过程。 

本文中所用术语“核酸”，本发明核酸通常既包括DNA又包括RNA。然而，功能为合成互补链的模板的，来自天然DNA或RNA的其核苷酸被人工衍生物所替代的核酸或修饰核苷酸也包括在本发明的核酸范围内，通常本发明的核酸被包括于生物样品中，生物样品包括动物，植物或微生物的组织，细胞，培养物和分泌物，或它们的提取物。本发明的生物样品包括细胞内寄生物基因组DNA或RNA例如病毒或支原体，本发明的核酸一般由包含在所述生物样品的核酸衍生而来。例如由mRNA合成cDNA，基于生物样品衍生来的核酸而扩增的核酸，是本发明的核酸的典型实例。 

本文中所用术语“核酸”、“DNA”以及类似术语还包括核酸类似物，即具有磷酸二酯主链以外的类似物。举例来说，本领域已知并且在主链上具有肽键而非磷酸二酯键的所谓“肽核酸”，被认为在本发明的范围内。 

本文所述茎环状核酸分子，是指一种寡核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该寡核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区 域。发卡结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的寡核苷酸序列后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成发卡结构。 

本文所述“分子信标”，是指在茎环结构的核酸链上标记荧光基团和淬灭基团，分子信标通过控制荧光基团和淬灭基团之间的距离实现荧光信号的产生和消失。该种控制距离的效果一般通过茎环结构的“打开”形成单链和“闭合”形成茎环实现。所述“荧光基团”是指可以吸收一定波长的光，同时发射出另外一种波长的光的物质，所述“淬灭基团”是指能够吸收一定波长的光的物质。 

本文中，应用本方案实现对副溶血性弧菌的检测，提取副溶血性弧菌基因组DNA后，按照前述流程进行检测，具体操作见实施案例。 

本发明的有益效果主要体现在以下几个方面： 

1、本发明技术方案应用切刻内切酶和聚合酶的联合作用从双链核酸靶标扩增出单链靶标，进而应用两条扩增引物和一条置换引物实现对靶标核酸的指数扩增。整个过程是在等温条件下进行的，等温是指技术方案中每个步骤都是在基本恒定的温度下进行，本发明在核酸合成乃至检测全过程无需对温度进行上下调节。相比需要依赖于热循环仪进行精确温度调控的传统变温扩增检测技术而言，本发明仅仅通过简单的恒温设备就可以达到目的，操作简单易行；反应耗费时间短，更适合即时检测。 

2、本发明采用三条引物就可实现对靶标核酸的指数扩增，并且扩增反应更加高效，同时扩增引物P2与单链模板退火区域紧邻切点的设计使得反应具有更好的特异性。比起传统链置换扩增反应中需要初始热变性的步骤、修饰的碱基、以及四条引物链的设计存在的扩增效率不高和容易引发非特异性扩增等问题，本发明在简化操作的基础上提高了扩增效率，降低了检测成本。 

3、本发明可将扩增引物设计成分子信标的形式，只有被正确扩增的靶标序列才会与该种形式的引物退火并产生后续荧光信号。比起传统技术中需要在四条引物链的基础上再额外添加一条分子信标链的复杂设计，本发明简化了反应体系，并进一步提高了整个反应进程的特异性。 

附图说明

图1为双链核酸靶标幂指数扩增实验原理图； 

图2为采用分子信标的实验原理图； 

图3为本发明涉及的实施例1检测结果的荧光信号图； 

图4为本发明涉及的实施例2检测结果的荧光信号图； 

图5为本发明涉及的实施例3检测结果的荧光信号图； 

图6为本发明涉及的实施例4检测结果的荧光信号图； 

序列表独立文本： 

SEQ ID NO.1(5’-3’)：大肠杆菌PBS质粒； 

SEQ ID NO.2(5’-3’)：PBS质粒扩增引物PBS-P1； 

SEQ ID NO.3(5’-3’)：PBS质粒置换引物PBS-B1； 

SEQ ID NO.4(5’-3’)：PBS质粒扩增引物PBS-P2； 

SEQ ID NO.5(5’-3’)：副溶血性弧菌(VP)基因组； 

SEQ ID NO.6(5’-3’)：VP扩增引物VP-P1； 

SEQ ID NO.7(5’-3’)：VP置换引物VP-B1； 

SEQ ID NO.8(5’-3’)：VP扩增引物VP-P2； 

SEQ ID NO.9(5’-3’)：VP信标扩增引物VP-XBP2 

具体实施方式

下面通过实施例并结合附图作进一步说明。 

实施例1：验证方法的可行性及其原理的正确性。本实施例是利用PBS质粒作为靶标核酸，利用三引物进行指数扩增的恒温检测，通过荧光信号验证方法的可行性和原理的正确性。向该等温扩增系统加入不同浓度的的靶标大肠杆菌PBS质粒(即SEQ ID NO.1包含被扩增的序列为5’-CATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATC-3’)1μL和作为阴性对照组加入二次蒸馏水1μL，10×Thermpol(200mM Tris-HCl，100mM KCl，100mM(NH₄)₂SO₄，20mM MgSO₄，1％Triton X-100pH8.8@25℃)1μL，0.1μL Bst DNA聚合酶、大片段，0.5μL Nt.BsrDI切刻内切酶，0.6μL(2.5mM)dNTPs，1μL(8×10^-6M)PBS扩增引物PBS-P1(即SEQ ID NO.2序列为5’-CGCTACCCATACATACTGTTCCATTGC GCCATACCAAACGACGAG-3’)，1μL(3×10^-7M)PBS置换引物PBS-B1(即SEQ ID NO.3序列为5’-GGAACCGGAGCTGAATG-3’)，1μL(8×10^-6M)PBS扩增引物PBS-P2(即SEQ ID NO.4序列为5’-CGCTACGGTTCTATAGTGTTCCATTGC TACAGGCATCGTGGTGTC-3’)，0.25μL SyBrGreen I(20×)，用二次蒸馏水补足10μL体系。利用伯乐CFX96^TM实时荧光定量PCR仪每分钟检测一次荧光信号，65℃反应60分钟。结果如图3所示。所示图中，按照时间的前后，不同浓度的PBS质粒依次给出荧光信号值。 

实施例2：验证方法的特异性 

向该等温扩增系统加入的靶标大肠杆菌PBS质粒(即SEQ ID NO.1包含被扩增的序列为5’-CATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATC-3”)100zmol，再分别加入不同含量的大肠杆菌基因组(分别为0zmol、10zmol、100zmol、1amol)，10×Thermpol(200mM Tris-HCl，100mM KCl，100mM(NH₄)₂SO₄，20mM MgSO₄，1％Triton X-100pH8.8@25℃)1μL，0.1μL Bst DNA聚合酶、大片段，0.5μL Nt.BsrDI切刻内切酶，0.6μL(2.5mM)dNTPs，1μL(8×10^-6M)PBS扩增引物PBS-P1(即SEQ ID NO.2序列为5’-CGCTACCCATACATACTGTTCCATTGCGCCATACCAAACGACGAG-3’)，1μL(3×10^-7M)PBS置换引物PBS-B1(即SEQ ID NO.3序列为5’-GGAACCGGAGCTGAATG-3’)，1μL(8×10^-6M)PBS扩增引物PBS-P2(即SEQ ID NO.4序列为 5’-CGCTACGGTTCTATAGTGTTCCATTGC TACAGGCATCGTGGTGTC-3’)，0.25μL SyBrGreen I(20×)，用二次蒸馏水补足10μL体系。利用伯乐CFX96^TM实时荧光定量PCR仪每分钟检测一次荧光信号，65℃反应60分钟。结果如图4所示。所示图中，加入不同量的大肠杆菌基因组后检测荧光信号，荧光信号的起峰时间基本不变。 

实施例3：利用本方法检测副溶血性弧菌 

将提取的副溶血性弧菌基因组DNA测出浓度后进行梯度稀释，向该等温扩增系统加入不同浓度的副溶血性弧菌基因组DNA(即SEQ ID NO.5包含被扩增的序列为5’-ACATTGCGTATTTTCGCAGGTCAAAATGATCCAACAGACATCTGCAAATAAAGGAGGCCAGCATGAAGATTAAAGTAGCATCTGCGGTTTTGGCCGT ATCTA-3”)1μL和作为阴性对照组加入二次蒸馏水1μL，10×Thermpol(200mMTris-HCl，100mM KCl，100mM(NH₄)₂SO₄，20mM MgSO₄，1％Triton X-100pH8.8@25℃)1μL，0.1μL Bst DNA聚合酶、大片段，0.5μL Nt.BsrDI切刻内切酶，0.6μL(2.5mM)dNTPs，1μL(8×10^-6M)副溶血性弧菌扩增引物VP-P1(即SEQ ID NO.6序列为5’-ATCACGTCAGTCTACTCGTAGCATTGCCCTTTATTTGCAGATGTCTGTTG-3’)，1μL(3×10^-7M)副溶血性弧菌置换引物VP-B1(即SEQ ID NO.7序列为5’-CGGCCAAAACCGCAG-3’)，1μL(8×10^-6M)副溶血性弧菌扩增引物VP-P2(即SEQ ID NO.8序列为5’-ATGGTGTGCTACTACTCGTCTCATTGCGTATTTTCGCAGGTCAAAATG-3’)，0.25μL SyBr Green I(20×)，用二次蒸馏水补足10μL体系。利用伯乐CFX96^TM实时荧光定量PCR仪每分钟检测一次荧光信号，65℃反应60分钟。结果如图5所示。所示图中，按照时间的前后，不同浓度的副溶血性弧菌基因组DNA依次给出荧光信号值。 

实施案例4：将扩增引物P2设计成分子信标后检测副溶血性弧菌 

向该等温扩增系统加入10zmol的副溶血性弧菌基因组DNA(即SEQ ID NO.5包含被扩增的序列为5’-ACATTGCGTATTTTCGCAGGTCAAAATGATCCAACAGACATCTGCAAATAAAGGAGGCCAGCATGAAGATTAAAGTAGCATCTGCGGTTTTGGCCGT ATCTA-3’)和作为阴性对照组加入二次蒸馏水1μL，10×Thermpol((200mM Tris-HCl，100mM KCl，100mM(NH4)2SO4，20mM MgSO4，1％Triton X-100pH8.8@25℃)1μL，0.1μL Bst DNA聚合酶、大片段，0.5μL Nt.BsrDI切刻内切酶，0.6μL(2.5mM)dNTPs，1μL(8×10^-6M)副溶血性弧菌扩增引物VP-P1(即SEQ ID NO.6序列为5’-ATCACGTCAGTCTACTCGTAGCATTGCCCTTTATTTGCAGATGTCTGTTG-3’)，1μL(3×10^-7M)副溶血性弧菌置换引物VP-B1(即SEQ ID NO.7序列为5’-CGGCCAAAACCGCAG-3’)，1μL(8×10^-6M)副溶血性弧菌信标扩增引物VP-XBP2(即SEQID NO.9序列为5’-GGAAGGCATTTTGAGACTCGCATTGCGTATTTTCGCAGGTCAAAATGCCTTCC-3’)，用二次蒸馏水补足10μL体系。利用伯乐CFX96^TM实时荧光定量PCR仪每分钟检测一次荧光信号，65℃反应60分钟。结果如图6所示。所示图中，相同浓度的靶标的荧光信号值较采用SyBr Green I作为信号表征物质更加高，特异性更好。 

序列表