基于切刻酶的等温核酸扩增的研究熵检驱测动新分技子术开的关研和究信号放大

摘要

核酸作为重要的遗传信息生物分子，其检测被广泛的应用在食品安全、生物医学检测、环境检测等诸多领域。聚合酶链式反应（PCR）是目前应用最广泛的核酸扩增检测方法之一，然而PCR技术需要专门的热循环仪，限制了其在疾病的即时诊断等领域的应用。因此，发展更灵敏、快速的核酸等温检测方法具有重要意义。本文构建了几种简单、快速的核酸等温扩增检测新方法，分别对DNA和RNA进行了快速、灵敏和特异地检测。
　　本研究建立了一种基于双切口分子信标的等温扩增检测DNA新方法的研究。用该方法对提取的大肠杆菌16S rDNA进行实时荧光检测，当检测靶标的量在100fmol到10amol之间时呈良好的线性，最低检测限为10amol；通过在引物上设计突变碱基进行检测，验证了该方法具有较强的特异性；并用该方法在复杂体系中检测时呈现较强的抗干扰能力。此外，它是一锅式的等温链置换扩增方法，不需要额外的操作步骤，极大的简化了实验步骤，并降低了样品污染的可能性。它的这些优点使该方法在核酸的现场快速检测及即时检测（POCT）中更具有实用性。目前的RNA检测方法中，大部分都需要利用反转录酶将RNA反转录为cDNA后再进行扩增检测。构建了三种无需加反转录酶可直接等温扩增RNA的实验方案，实现了对RNA的快速“一步法”检测。这几种方法都利用了本实验室发现的Bst DNA聚合酶既具有DNA聚合酶活性又具有内在的反转录酶活性的特点；此外，还充分的利用了DNA聚合酶的链置换活性及与切刻酶联用的扩增放大机理，最终实现了信号的多重放大。最优方法对大肠杆菌16SrDNA的检测可达1amol，对大肠杆菌16S rRNA在一定的浓度下也可以进行有效的检测。这些方法均具有在等温、均相条件下可直接检测RNA。在RNA的检测中大大缩短反应时间，简化操作步骤，降低实验成本和操作难度。这些新的等温方法的建立为其他核酸检测提供了新方法与新思路，同时对即时检测也具有重要意义。