一种核苷酸序列及其在提高菌株耐酸性中的应用

摘要

本发明公开了一种核苷酸序列，该核苷酸为全局转录调控因子的基因序列，本发明还公开了该核苷酸序列在提高菌株耐酸性中的应用。

说明书

技术领域

   本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种核苷酸序列及其在提高菌株耐酸性中的应用。

背景技术

细胞对酸胁迫的抗性差是传统发酵工业节能减排的关键共性问题。有机酸、氨基酸产业作为我国发酵产业的重要组成部分，其目的产物导致了不利于细胞生长与维持正常代谢活性的酸性微环境，并严重影响了生产条件稳定性的维持。迄今为止，绝大多数工业微生物的耐酸研究都集中在大规模的诱变和筛选，研究周期长、工作量大，且属于暗箱操作，不能根据目标表型获得相应的基因型，即不清楚突变发生的位置和机理。因此，研究微生物酸耐受性机制，提高微生物对酸耐受性十分重要。目前研究表明，工业微生物的耐酸机制同时涉及有机酸的跨膜运输、体内协同转运、以及与能量因子偶联等多种作用形式，是个复杂的科学问题。

大肠杆菌基因组共含有4000多个基因，这些基因的转录特异性受到两步调控：第一步就是RNA聚合酶σ因子的转录识别，第二步是约240-260个其他特异性转录因子的识别。在大肠杆菌的不同生长环境中，其RNA聚合酶是通过转录特异基因的选择性σ因子改变基因组的转录来调控整个生长过程。目前大肠杆菌中发现的σ因子有7种，分别为：σ^D（σ⁷⁰）、σ^N（σ⁵⁴）、σ^S（σ³⁸）、σ^H（σ³²）、σ^F（σ²⁸）、σ^E（σ²⁴）和σ^fecI。其中，σ^D是最主要的σ因子，负责与细胞生长相关的1000多个基因的转录控制，是提高大肠杆菌耐酸性的最佳对象。

随机片段交换法是一种新的突变文库构建方法，它汇集了多种DNA序列的突变形式，各种形式可以单独发生，也可以同时发生。2006年，Fujii等利用此方法对TEM-1型β-内酰胺酶进行进化，经过三轮突变，使其对头孢他啶（ceftazidime）的最小抑制浓度提高了5000倍。因此，将随机片段交换法替代易错PCR构建基因突变文库方法，不仅可以简化实验操作步骤，同时又能增强突变文库的多样性，将大大提高工业微生物耐酸表型定向筛选的效率。

发明内容

本发明的目的是通过突变全局转录调控因子σ^D，筛选得到能够提高大肠杆菌耐酸性的突变菌株，并获得该转录调控因子的多核苷酸序列。

为了达到本发明的技术目的，发明人以携带rpoD基因(gene ID 947567)完整序列（含上游天然启动子区域和下游终止子区域）的大肠杆菌E. coli DH5 alpha基因组为模板，构建rpoD基因的突变文库。将以随机片段交换法获得的rpoD突变基因为目的片段，以低拷贝表达质粒pKSC为载体，通过T4DNA连接酶连接，得到带有rpoD突变基因的重组质粒，经热激法转化E. coli DH5 alpha感受态细胞，涂布含有30 μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃培养过夜。洗脱单菌落，利用平板试管交替筛选的模式，最后筛选得到显著提高大肠杆菌酸耐酸性的trpoD。

在本发明中的大肠杆菌基因工程菌中的σ^D突变基因trpoD携带12个突变位点，分别为Pro60Ser, Thr95Ile, Phe221Leu, Ile249Phe, Ile287Val, Ile511Val, His518Leu, Glu538Val, Ala542Val, Asp566Asn, Glu605Gly, Leu607Gln，其中，碱基序列1-194位为天然启动子区域，2051-2075位为终止密码子区域；携带该sigma D突变基因trpoD的大肠杆菌E.coli DH5 alpha无需添加IPTG诱导表达，且能耐低pH，而普通大肠杆菌在低pH条件下就停止生长。

基于此，本发明提供的技术方案包括：

一种多核苷酸，包含由SEQ ID NO：1代表的核苷酸序列，或由SEQ ID NO：1代表的核苷酸序列中第1至1842位的核苷酸残基组成的核苷酸序列。

来源于大肠杆菌的如权1所述的多核甘酸。

一种蛋白质，包含由SEQ ID NO：2代表的全长氨基酸序列，或由SEQ ID NO：2代表的全长氨基酸序列中第1至614位氨基酸残基组成的氨基酸序列。

本发明所述的蛋白质其含有，Pro60Ser, Thr95Ile, Phe221Leu, Ile249Phe, Ile287Val, Ile511Val, His518Leu, Glu538Val, Ala542Val, Asp566Asn, Glu605Gly, Leu607Gln，12个突变位点。

含有如权利要求1所述多核苷酸序列，或如权利要求2或3所述蛋白质的多核苷酸序列表达载体。

含有如权利要求5所述表达载体的菌株；该菌株优选为大肠杆菌。

本发明所述的多核苷酸在提高菌株耐酸性中的应用。

构建耐酸性菌株的方法，包含如下步骤：

（1）以携带rpoD基因完整序列的大肠杆菌E. coli DH5 alpha基因组为模板进行随机突变，获得rpoD突变基因；

（2）以rpoD突变基因为目的片段，以低拷贝质粒pKSC为表达载体，构建σ^D基因突变库；

（3）将载体转入大肠杆菌，并进行高通量筛选，以低pH为筛选压力，进行液体和琼脂平板交替筛选。

通过本发明的技术方案，可以带来以下有益技术效果：

（1）通过对全局转录调控因子σ^D连续突变，显著提高了大肠杆菌对低pH的耐受性，为解决大肠杆菌等工业微生物细胞对酸胁迫响应调控过程提供了方法，使人们能更有效地控制和设计微生物细胞抗逆元器件，有助于提高工业微生物的应用效益。

（2）提供了新的抗酸性多核苷酸序列，该序列可用于提高工业微生物的耐酸性。

附图说明

图1  携带sigma D突变基因trpoD的质粒pKSC电泳图。

图2  大肠杆菌E. coli DH5 alpha-pKSC-trpoD和大肠杆菌E. coli DH5 alpha-pKSC-rpoD在pH4.0时的耐酸情况。

图3 大肠杆菌E. coli DH5 alpha-pKSC-trpoD和大肠杆菌E. coli DH5 alpha-pKSC-rpoD在pH3.5时的耐酸情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。所列的实施例仅作阐示

实施例1本实施例说明利用随机片段交换法定向突变出发菌株大肠杆菌E. coli DH5 alpha中编码sigma D的基因rpoD，并构建σ^D突变基因文库的方法。

（1）利用LB培养基，于37℃，有氧条件下过夜活化大肠杆菌E. coli DH5 alpha，利用Takara细菌基因组抽提试剂盒提取基因组。

（2）以大肠杆菌E. coli DH5 alpha基因组为模板，PCR扩增rpoD基因片段，所用引物，单下划线同源片段：

rpoD-F: CCGAATTCTGATTTAACGGCTTAAGTGCCGAAG；

rpoD-R: TACGGCTTGCCGGGTGCGGCGTAAC。

    PCR反应条件：94℃变性4 min，经94℃30 sec，56℃30 sec，72℃1 min，30个循环，再经过72℃延伸10 min，降温至16℃。获得的PCR产物经电泳分析确认。

（3）对目的基因rpoD进行纯化；用DNase I消化，获得一系列大小在100-300 bp之间的DNA碎片，再用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）在小片段的3'端随机添加/删除5个左右的核苷酸；以带3'尾巴的短片段互为引物进行PCR重新组装，加入两端引物扩增出全长突变基因rpoD。获得的PCR产物经电泳分析确认。

（4）对随机片段交换法获得的突变基因片段进行纯化；以低拷贝质粒pKSC为表达载体，经过HindIII和EcoRI限制性内切酶消化，通过T4DNA连接酶16℃金属浴连接过夜，构建σ^D突变基因文库。其中附图1为携带σ^D突变基因trpoD的质粒pKSC电泳图。其中pKSC表达质粒的构建参见文献Chong H, Geng H, Zhang H, et al. Enhancing E. coli isobutanol tolerance through engineering its global transcription factor cAMP receptor protein (CRP)[J]. Biotechnology and bioengineering, 2014, 111(4): 700-708.。

（5）热激法转化σ^D突变基因（含有卡那霉素基因）至大肠杆菌E. coli DH5 alpha感受态，并涂布于带有卡那霉素的LB平板筛选阳性重组子，通过PCR鉴定，获得含有σ^D突变基因的菌株大肠杆菌E. coli DH5 alpha。

 实施例2  本实施例说明以低pH为筛选压力，利用液体和琼脂平板交替筛选的方式获得耐酸性显著提高的大肠杆菌基因工程菌的方法。

（1）利用LB培养基，于37℃，有氧条件下培养含有σ^D突变基因的菌株大肠杆菌E. coli DH5 alpha至OD₆₀₀=0.2，以菌株大肠杆菌E. coli DH5 alpha-pKSC-rpoD为对照组，加入8 mol/L稀盐酸，培养基pH分别调至4.5，5，6，7，37℃培养24 h后，将菌液稀释10⁶后，吸取700 μL菌液涂布于LB/Kana平板上，37℃培养至单菌落产生。

（2）以pH4.5为初筛起点，挑取平板上的100个单菌落。将菌株接种至10 mL试管中，检测100株菌株的OD₆₀₀值，其中101号为对照菌株（WT）。当菌株生长到OD₆₀₀为0.2时，试管中pH调至4.5，37℃培养12 h，其中有10株菌株生长OD₆₀₀=0.6~0.8。挑取该10株突变菌株进行进一步筛选。

（3）将10株突变菌株接种至10 mL试管中，检测10株菌株的OD₆₀₀值，其中11号为对照菌株（WT）。当菌株生长到OD₆₀₀为0.2时，试管中pH调至4，37℃培养12h。根据培养结果显示，G1生长情况最好，OD₆₀₀=0.868，而对照菌株停止生长。

（4）提取G1携带σ^D突变基因的质粒pKSC，导入大肠杆菌E. coli DH5 alpha感受态，并涂布于带有卡那霉素的LB平板筛选阳性重组子，通过PCR鉴定，获得含有σ^D突变基因trpoD的菌株大肠杆菌E. coli DH5 alpha。

实施例3 本实例说明新构建的大肠杆菌基因工程菌株E. coli DH5 alpha-pKSC-trpoD和携带野生型σ^D基因rpoD的大肠杆菌基因工程菌株E .coli DH5 alpha-pKSC-rpoD氨基酸序列和耐低pH能力的对比。

（1）利用LB培养基，于37℃，有氧条件下过夜培养大肠杆菌E. coli DH5 alpha-pKSC-trpoD。收集菌体，提取质粒，送至南京金斯瑞生物科技公司进行测序。

（2）根据测序结果，以携带野生型σ^D基因rpoD的大肠杆菌E. coli DH5 alpha-pKSC-rpoD为对照，大肠杆菌E. coli DH5 alpha-pKSC-trpoD共有12个突变位点，分别为Pro60Ser, Thr95Ile, Phe221Leu, Ile249Phe, Ile287Val, Ile511Val, His518Leu, Glu538Val, Ala542Val, Asp566Asn, Glu605Gly, Leu607Gln，其中，突变位点主要集中于rpoD片段的Region 4区域，影响RNA聚合酶的启动子区域识别。

（3）以携带野生型σ^D基因rpoD的大肠杆菌E. coli DH5 alpha-pKSC-rpoD为对照，将突变菌株大肠杆菌E. coli DH5 alpha-pKSC-trpoD大肠杆菌E. coli DH5 alpha-pKSC-rpoD接种至10mL试管中。当菌株生长到OD₆₀₀为0.2时，试管中pH调至3.5，4，37℃培养10h，见图3。

序列表 

<110>  南京工业大学

 

<120>  一种核苷酸序列及其在提高菌株耐酸性中的应用

 

<130>  xb15040801

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1842

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  sigma D突变基因trpoD的基因序列

 

 

<220>

<221>  CDS

<222>  (1)..(1842)

 

<400>  1

atg gag caa aac ccg cag tca cag ctg aaa ctt ctt gtc acc cgt ggt       48

Met Glu Gln Asn Pro Gln Ser Gln Leu Lys Leu Leu Val Thr Arg Gly        

1               5                   10                  15             

 

aag gag caa ggc tat ctg acc tat gcc gag gtc aat gac cat ctg ccg       96

Lys Glu Gln Gly Tyr Leu Thr Tyr Ala Glu Val Asn Asp His Leu Pro        

            20                  25                  30                 

 

gaa gat atc gtc gat tca gat cag atc gaa gac atc atc caa atg atc      144

Glu Asp Ile Val Asp Ser Asp Gln Ile Glu Asp Ile Ile Gln Met Ile        

        35                  40                  45                     

 

aac gac atg ggc att cag gtg atg gaa gaa gca tcg gat gcc gat gat      192

Asn Asp Met Gly Ile Gln Val Met Glu Glu Ala Ser Asp Ala Asp Asp        

    50                  55                  60                         

 

ctg atg ctg act gaa aac acc gcg gac gaa gat gct gcc gaa gcc gcc      240

Leu Met Leu Thr Glu Asn Thr Ala Asp Glu Asp Ala Ala Glu Ala Ala        

65                  70                  75                  80         

 

gcg cag gtg ctt tcc agc gtg gaa tct gaa atc ggg cgc acg att gac      288

Ala Gln Val Leu Ser Ser Val Glu Ser Glu Ile Gly Arg Thr Ile Asp         

                85                  90                  95             

 

ccg gta cgc atg tac atg cgt gaa atg ggc acc gtt gaa ctg ttg acc      336

Pro Val Arg Met Tyr Met Arg Glu Met Gly Thr Val Glu Leu Leu Thr        

            100                 105                 110                

 

cgc gaa ggc gaa att gac atc gct aag cgt att gaa gac ggg atc aac      384

Arg Glu Gly Glu Ile Asp Ile Ala Lys Arg Ile Glu Asp Gly Ile Asn        

        115                 120                 125                     

 

cag gtt caa tgc tcc gtt gct gaa tat ccg gaa gcg atc acc tat ctg      432

Gln Val Gln Cys Ser Val Ala Glu Tyr Pro Glu Ala Ile Thr Tyr Leu        

    130                 135                 140                        

 

ctg gaa cag tac gat cgt gtt gaa gca gaa gaa gcg cgt ctg tcc gat      480

Leu Glu Gln Tyr Asp Arg Val Glu Ala Glu Glu Ala Arg Leu Ser Asp        

145                 150                 155                 160        

 

ctg atc acc ggc ttt gtt gac ccg aac gca gaa gaa gat ctg gca cct      528

Leu Ile Thr Gly Phe Val Asp Pro Asn Ala Glu Glu Asp Leu Ala Pro        

                165                 170                 175            

 

acc gcc act cac gtc ggt tct gag ctt tcc cag gaa gat ctg gac gat      576

Thr Ala Thr His Val Gly Ser Glu Leu Ser Gln Glu Asp Leu Asp Asp        

            180                 185                 190                

 

gac gaa gat gaa gac gaa gaa gat ggc gat gac ggc agc gcc gat gat      624

Asp Glu Asp Glu Asp Glu Glu Asp Gly Asp Asp Gly Ser Ala Asp Asp        

        195                 200                 205                    

 

gac aac agc atc gac ccg gaa ctg gct cgc gaa aaa tta gcg gaa cta      672

Asp Asn Ser Ile Asp Pro Glu Leu Ala Arg Glu Lys Leu Ala Glu Leu         

    210                 215                 220                        

 

cgc gct cag tac gtt gta acg cgt gac acc atc aaa gcg aaa ggt cgc      720

Arg Ala Gln Tyr Val Val Thr Arg Asp Thr Ile Lys Ala Lys Gly Arg        

225                 230                 235                 240        

 

agt cac gct acc gct cag gaa gag ttc ctg aaa ctg tct gaa gta ttc      768

Ser His Ala Thr Ala Gln Glu Glu Phe Leu Lys Leu Ser Glu Val Phe        

                245                 250                 255            

 

aaa cag ttc cgc ctg gtg ccg aag cag ttt gac tac ctg gtc aac agc      816

Lys Gln Phe Arg Leu Val Pro Lys Gln Phe Asp Tyr Leu Val Asn Ser        

            260                 265                 270                

 

atg cgc gtc atg atg gac cgc gtt cgt acg caa gaa cgt ctg gtc atg      864

Met Arg Val Met Met Asp Arg Val Arg Thr Gln Glu Arg Leu Val Met        

        275                 280                 285                    

 

aag ctc tgc gtt gag cag tgc aaa atg ccg aag aaa aac ttc att acc      912

Lys Leu Cys Val Glu Gln Cys Lys Met Pro Lys Lys Asn Phe Ile Thr        

    290                 295                 300                        

 

ctg ttt acc ggc aac gaa acc agc gat acc tgg ttc aac gcg gca att      960

Leu Phe Thr Gly Asn Glu Thr Ser Asp Thr Trp Phe Asn Ala Ala Ile        

305                 310                 315                 320        

 

gcg atg aac aag ccg tgg tcg gaa aaa ctg cac gat gtc tct gaa gaa     1008

Ala Met Asn Lys Pro Trp Ser Glu Lys Leu His Asp Val Ser Glu Glu        

                325                 330                 335            

 

gtg cat cgc gcc ctg caa aaa ctg cag cag att gaa gaa gaa acc ggc     1056

Val His Arg Ala Leu Gln Lys Leu Gln Gln Ile Glu Glu Glu Thr Gly        

            340                 345                 350                

 

ctg acc atc gag cag gtt aaa gat atc aac cgt cgt atg tcc atc ggt     1104

Leu Thr Ile Glu Gln Val Lys Asp Ile Asn Arg Arg Met Ser Ile Gly         

        355                 360                 365                    

 

gaa gcg aaa gcc cgc cgt gcg aag aaa gag atg gtt gaa gcg aac tta     1152

Glu Ala Lys Ala Arg Arg Ala Lys Lys Glu Met Val Glu Ala Asn Leu        

    370                 375                 380                        

 

cgt ctg gtt att tct atc gct aag aaa tac acc aac cgt ggc ttg cag     1200

Arg Leu Val Ile Ser Ile Ala Lys Lys Tyr Thr Asn Arg Gly Leu Gln        

385                 390                 395                 400        

 

ttc ctt gac ctg att cag gaa ggc aac atc ggt ctg atg aaa gcg gtt     1248

Phe Leu Asp Leu Ile Gln Glu Gly Asn Ile Gly Leu Met Lys Ala Val        

                405                 410                 415            

 

gat aaa ttc gaa tac cgc cgt ggt tac aag ttc tcc acc tac gca acc     1296

Asp Lys Phe Glu Tyr Arg Arg Gly Tyr Lys Phe Ser Thr Tyr Ala Thr        

            420                 425                 430                

 

tgg tgg atc cgt cag gcg atc acc cgc tct atc gcg gat cag gcg cgc     1344

Trp Trp Ile Arg Gln Ala Ile Thr Arg Ser Ile Ala Asp Gln Ala Arg        

        435                 440                 445                    

 

acc atc cgt att ccg gtg cat atg att gag acc atc aac aag ctc aac     1392

Thr Ile Arg Ile Pro Val His Met Ile Glu Thr Ile Asn Lys Leu Asn        

    450                 455                 460                        

 

cgt att tct cgc cag atg ctg caa gag atg ggc cgt gaa ccg acg ccg     1440

Arg Ile Ser Arg Gln Met Leu Gln Glu Met Gly Arg Glu Pro Thr Pro        

465                 470                 475                 480        

 

gaa gaa ctg gct gaa cgt atg ctg atg ccg gaa gac aag atc cgc aaa     1488

Glu Glu Leu Ala Glu Arg Met Leu Met Pro Glu Asp Lys Ile Arg Lys        

                485                 490                 495            

 

gtg ctg aag atc gcc aaa gag cca atc tcc atg gaa acg ccg gtc ggt     1536

Val Leu Lys Ile Ala Lys Glu Pro Ile Ser Met Glu Thr Pro Val Gly        

            500                 505                 510                

 

gat gat gaa gat tcg ttg ctg ggg gat ttc atc gag gat acc acc ctc     1584

Asp Asp Glu Asp Ser Leu Leu Gly Asp Phe Ile Glu Asp Thr Thr Leu        

        515                 520                 525                    

 

gag ctg ccg ctg gat tct gcg acc acc gta agc ctg cgt gtg gca acg     1632

Glu Leu Pro Leu Asp Ser Ala Thr Thr Val Ser Leu Arg Val Ala Thr        

    530                 535                 540                        

 

cac gac gtg ctg gct ggc ctg acc gcg cgt gaa gca aaa gtt ctg cgt     1680

His Asp Val Leu Ala Gly Leu Thr Ala Arg Glu Ala Lys Val Leu Arg        

545                 550                 555                 560         

 

atg cgt ttc ggt atc aat atg aac acc gac tac acg ctg gaa gaa gtg     1728

Met Arg Phe Gly Ile Asn Met Asn Thr Asp Tyr Thr Leu Glu Glu Val        

                565                 570                 575            

 

ggt aaa cag ttc gac gtt acc cgc gaa cga atc cgt cag atc gaa gcg     1776

Gly Lys Gln Phe Asp Val Thr Arg Glu Arg Ile Arg Gln Ile Glu Ala        

            580                 585                 590                

 

aag gcg ctg cgc aaa ctg cgt cac ccg agc tgt tct gga gtg cag cgt     1824

Lys Ala Leu Arg Lys Leu Arg His Pro Ser Cys Ser Gly Val Gln Arg        

        595                 600                 605                    

 

agc ttc ctg gac gat taa                                             1842

Ser Phe Leu Asp Asp                                                    

    610                                                                

 

 

<210>  2

<211>  613

<212>  PRT

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  Synthetic Construct

 

<400>  2

 

Met Glu Gln Asn Pro Gln Ser Gln Leu Lys Leu Leu Val Thr Arg Gly

1               5                   10                  15     

 

 

Lys Glu Gln Gly Tyr Leu Thr Tyr Ala Glu Val Asn Asp His Leu Pro

            20                  25                  30         

 

 

Glu Asp Ile Val Asp Ser Asp Gln Ile Glu Asp Ile Ile Gln Met Ile

        35                  40                  45             

 

 

Asn Asp Met Gly Ile Gln Val Met Glu Glu Ala Ser Asp Ala Asp Asp

    50                  55                  60                 

 

 

Leu Met Leu Thr Glu Asn Thr Ala Asp Glu Asp Ala Ala Glu Ala Ala

65                  70                  75                  80 

 

 

Ala Gln Val Leu Ser Ser Val Glu Ser Glu Ile Gly Arg Thr Ile Asp

                85                  90                  95     

 

 

Pro Val Arg Met Tyr Met Arg Glu Met Gly Thr Val Glu Leu Leu Thr

            100                 105                 110        

 

 

Arg Glu Gly Glu Ile Asp Ile Ala Lys Arg Ile Glu Asp Gly Ile Asn

        115                 120                 125            

 

 

Gln Val Gln Cys Ser Val Ala Glu Tyr Pro Glu Ala Ile Thr Tyr Leu

    130                 135                 140                

 

 

Leu Glu Gln Tyr Asp Arg Val Glu Ala Glu Glu Ala Arg Leu Ser Asp

145                 150                 155                 160

 

 

Leu Ile Thr Gly Phe Val Asp Pro Asn Ala Glu Glu Asp Leu Ala Pro

                165                 170                 175    

 

 

Thr Ala Thr His Val Gly Ser Glu Leu Ser Gln Glu Asp Leu Asp Asp

            180                 185                 190        

 

 

Asp Glu Asp Glu Asp Glu Glu Asp Gly Asp Asp Gly Ser Ala Asp Asp

        195                 200                 205            

 

 

Asp Asn Ser Ile Asp Pro Glu Leu Ala Arg Glu Lys Leu Ala Glu Leu

    210                 215                 220                

 

 

Arg Ala Gln Tyr Val Val Thr Arg Asp Thr Ile Lys Ala Lys Gly Arg

225                 230                 235                 240

 

 

Ser His Ala Thr Ala Gln Glu Glu Phe Leu Lys Leu Ser Glu Val Phe

                245                 250                 255    

 

 

Lys Gln Phe Arg Leu Val Pro Lys Gln Phe Asp Tyr Leu Val Asn Ser

            260                 265                 270        

 

 

Met Arg Val Met Met Asp Arg Val Arg Thr Gln Glu Arg Leu Val Met

        275                 280                 285            

 

 

Lys Leu Cys Val Glu Gln Cys Lys Met Pro Lys Lys Asn Phe Ile Thr

    290                 295                 300                

 

 

Leu Phe Thr Gly Asn Glu Thr Ser Asp Thr Trp Phe Asn Ala Ala Ile

305                 310                 315                 320

 

 

Ala Met Asn Lys Pro Trp Ser Glu Lys Leu His Asp Val Ser Glu Glu

                325                 330                 335    

 

 

Val His Arg Ala Leu Gln Lys Leu Gln Gln Ile Glu Glu Glu Thr Gly

            340                 345                 350        

 

 

Leu Thr Ile Glu Gln Val Lys Asp Ile Asn Arg Arg Met Ser Ile Gly

        355                 360                 365            

 

 

Glu Ala Lys Ala Arg Arg Ala Lys Lys Glu Met Val Glu Ala Asn Leu

    370                 375                 380                

 

 

Arg Leu Val Ile Ser Ile Ala Lys Lys Tyr Thr Asn Arg Gly Leu Gln

385                 390                 395                 400

 

 

Phe Leu Asp Leu Ile Gln Glu Gly Asn Ile Gly Leu Met Lys Ala Val

                405                 410                 415    

 

 

Asp Lys Phe Glu Tyr Arg Arg Gly Tyr Lys Phe Ser Thr Tyr Ala Thr

            420                 425                 430        

 

 

Trp Trp Ile Arg Gln Ala Ile Thr Arg Ser Ile Ala Asp Gln Ala Arg

        435                 440                 445            

 

 

Thr Ile Arg Ile Pro Val His Met Ile Glu Thr Ile Asn Lys Leu Asn

    450                 455                 460                

 

 

Arg Ile Ser Arg Gln Met Leu Gln Glu Met Gly Arg Glu Pro Thr Pro

465                 470                 475                 480

 

 

Glu Glu Leu Ala Glu Arg Met Leu Met Pro Glu Asp Lys Ile Arg Lys

                485                 490                 495    

 

 

Val Leu Lys Ile Ala Lys Glu Pro Ile Ser Met Glu Thr Pro Val Gly

            500                 505                 510        

 

 

Asp Asp Glu Asp Ser Leu Leu Gly Asp Phe Ile Glu Asp Thr Thr Leu

        515                 520                 525            

 

 

Glu Leu Pro Leu Asp Ser Ala Thr Thr Val Ser Leu Arg Val Ala Thr

    530                 535                 540                 

 

 

His Asp Val Leu Ala Gly Leu Thr Ala Arg Glu Ala Lys Val Leu Arg

545                 550                 555                 560

 

 

Met Arg Phe Gly Ile Asn Met Asn Thr Asp Tyr Thr Leu Glu Glu Val

                565                 570                 575    

 

 

Gly Lys Gln Phe Asp Val Thr Arg Glu Arg Ile Arg Gln Ile Glu Ala

            580                 585                 590        

 

 

Lys Ala Leu Arg Lys Leu Arg His Pro Ser Cys Ser Gly Val Gln Arg

        595                 600                 605            

 

 

Ser Phe Leu Asp Asp

    610