一种聚甘油结构树枝状大分子及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种聚甘油结构树枝状大分子及其制备方法和应用。所述聚甘油结构树枝状大分子的结构式如式(Ⅰ)所示。本发明的聚甘油结构树枝状大分子，其内部含有大量的醚键，具有良好的生物相容性，且生理条件下化学结构稳定；其表面含有大量的反应性基团，可用来键合多种药物，分子探针以及靶向基团，其内核具备的空腔结构也可负载药物和生物探针，可以作为生物载体材料广泛地用于药物、基因、造影剂，生物探针的输送；本发明的制备方法，合成步骤少，分离纯化简单，容易合成高分子量的树枝状大分子，大幅提高了聚甘油结构树枝状大分子的合成效率，使得这种具有广泛应用前景的树枝状大分子规模化生产成为可能。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物载体材料，具体涉及一种聚甘油结构树枝状大分 子及其制备方法和应用。

背景技术

树枝状大分子由于其分子结构能够被精确控制，因此被作为一种极富 潜力的平台化合物广泛研究，如作为药物，基因或造影剂等的载体(如： Kaminskas,L.M.；McLeod,V.M.；Ryan,G.M.；Kelly,B.D.；Haynes,J.M.； Williamson,M.；Thienthong,N.；Owen,D.J.；Porter,C.J.H.,Pulmonary  administration of a doxorubicin-conjugated dendrimer enhances drug exposure  to lung metastases and improves cancer therapy.Journal Of Controlled  Release 2014,183,18-26.)。首先，树枝状大分子可以利用内部空腔对疏水 性小分子进行包裹运输(Wen,X.F.；Lan,J.L.；Cai,Z.Q.；Pi,P.H.；Xu,S.P.； Zhang,L.J.；Qian,Y.；Wang,S.N.,Dissipative particle dynamics simulation  on drug loading/release in polyester(-PEG)dendrimer.J.Nanopart.Res.2014, 16(5).)；其次，树枝状大分子表面大量的官能团也可以用于链接各种功能 基团，如荧光基团，MRI基团，药物以及各类靶向基团(Krippner,G.Y.； Williams,C.C.；Kelly,B.D.；Henderson,S.A.；Wu,Z.；Razzino,P.Targeted  polylysine dendrimer therapeutic agent.US 08420067,Apr 162013,2013； Baker,J.R.；Cheng,X.-m.；Thomas,T.P.；Huang,B.M.Dendrimer conjugates. US 08445528,May 212013,2013.)。

在各种类型的树枝状大分子中，聚甘油结构的树枝状大分子由于其生 物相容性好，毒副作用低，在生理条件下结构稳定，因此具有极佳的发展 潜力。然而，传统的聚甘油结构树枝状大分子具有合成方法复杂，分子量 低，免疫原性等缺点，限制了聚甘油结构树枝状大分子的大规模应用。

传统工艺中，聚甘油结构树枝状大分子通常由发散(Haag,R.；Sunder, A.；Stumbé,J.F.,An Approach to Glycerol Dendrimers and Pseudo-Dendritic  Polyglycerols.J.Am.Chem.Soc.2000,122(12),2954-2955.)和收敛法 (Elmer,S.L.；Man,S.；Zimmerman,S.C.,Synthesis of Polyglycerol, Porphyrin-Cored Dendrimers Using Click Chemistry.Eur.J.Org.Chem 2008, 2008(22),3845-3851.)合成。

发散法合成的不足之处在于：当以季戊四醇为核时，目前报道的聚甘 油结构树枝状大分子的最高分子量为2.2kDa，分子量过低，难以作为药物 或各类探针的载体；并且该分子量的纯净产物的获得至少需要8个反应步 骤，且每步反应都需要通过柱层析色谱法分离提纯，操作较为繁琐。这些 原因导致了聚甘油结构树枝状大分子的制备不仅过程非常复杂，而且产量 低下且难以扩大化生产。

收敛法合成聚甘油结构树枝状大分子，能够有效地提高大分子合成的 效率，也能够一定程度的提高分子量。然而，这种方法的合成体系仍然涉 及使用HPLC进行分离提纯，因此会损失大量的树枝状大分子，导致产率 低下，同时分子量仍然较低。

因此，设计一种制备过程简单、分子量高、表面性质容易调节的树枝 状大分子，对于其在医用材料领域的大规模应用具有重大意义。

发明内容

本发明公开了一种聚甘油结构树枝状大分子，该树枝状大分子分子量 高，表面性质容易调节。

1、一种聚甘油结构树枝状大分子，结构式如式(Ⅰ)所示：

式(Ⅰ)中，a、b、c、d均为0；

或者，d为2，a、b、c均为0；

或者，c、d均为2，a、b均为0；

或者，b、c、d均为2，a为0；

或者，a、b、c、d均为2；

X表示结构单元；

R表示基团(即-CH₂CH＝CH₂)、(即-CH₂CHOHCH₂OH) 基团或巯基单体。

本发明还提供了所述聚甘油结构树枝状大分子的制备方法，该制备方 法包括以下步骤：

(1)利用环糊精和不饱和卤代烷进行威廉姆斯反应，获得第1代带 基团的聚甘油结构树枝状大分子；

(2)利用第1代带基团的聚甘油结构树枝状大分子交替地进 行双键氧化反应和威廉姆斯反应，获得第2代、第3代、第4代或第5代 基团的聚甘油结构树枝状大分子；

(3)取利用第1代带基团的聚甘油结构树枝状大分子进行双 键氧化反应获得的第1.5代带基团的聚甘油结构树枝状大分子， 交替地进行威廉姆斯反应和双键氧化反应，获得第2.5代、第3.5代或第 4.5代带基团的聚甘油结构树枝状大分子；

(4)在氮气保护、紫外光照和安息香二甲醚存在下，将第1代～第5 代中任一带的聚甘油结构树枝状大分子与巯基单体进行加成反应， 获得带巯基单体的聚甘油结构树枝状大分子。

本发明的聚甘油结构树枝状大分子以环糊精为核，以不饱和卤代烷为 单体，交替地进行威廉姆斯反应和双键氧化反应，经威廉姆斯反应获得带 基团的聚甘油结构树枝状大分子，经双键氧化反应获得带基团的聚甘油结构树枝状大分子；进一步利用带基团的聚甘油结构 树枝状大分子与巯基单体进行加成反应，可以获得表面带不同官能团的聚 甘油结构树枝状大分子(此时R表示巯基单体)。

具体地，所述聚甘油结构树枝状大分子的制备方法包括以下步骤：

(1)利用环糊精和不饱和卤代烷进行威廉姆斯反应，获得第1代带 基团的聚甘油结构树枝状大分子；

进一步地，所述威廉姆斯反应包括：

(1.1)将环糊精与金属钠或氢化钠反应，生成醇钠化合物；

将氢化钠或金属钠溶于无水DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中，获得A 液；将环糊精溶于无水DMF中，获得B液；将B液逐滴加入A液中，搅 拌反应13～17min后，在冰浴中冷却；

氢化钠或金属钠与环糊精的用量比为63：1(mol/mol)。

所述环糊精可选用α-环糊精，β-环糊精或γ-环糊精；更优选为β-环糊 精。

(1.2)在氮气保护下，将所述醇钠化合物与不饱和卤代烷反应，生成 第1代带基团的聚甘油结构树枝状大分子。

将不饱和卤代烷在冰浴条件下逐滴加入上述B液与A液的反应液中， 在氮气保护下，室温搅拌反应5.5～6.5h；反应产物经旋蒸、洗涤后真空干 燥，即得第1代带基团的聚甘油结构树枝状大分子。

不饱和卤代烷一方面为威廉姆斯反应提供具有活性的卤素，一方面为 后续为双键氧化反应提供不饱和键。

所述不饱和卤代烷可选用卤代丙烯或卤代丙炔，优选为碘丙烯、溴丙 烯或氯丙烯，更优选为氯丙烯。氯丙稀反应活性适中，且副反应少。

(2)对第1代带基团的聚甘油结构树枝状大分子交替地进行 双键氧化反应和威廉姆斯反应，获得第1代、第1代、第4代或第5代带 基团的聚甘油结构树枝状大分子；

作为优选，所述双键氧化反应为：在含锇催化剂存在下，对低代带 基团的聚甘油结构树枝状大分子进行氧化。

具体地，将低代带基团的聚甘油结构树枝状大分子溶解(可采 用丙酮、叔丁醇以及去离子水组成的混合溶解体系)后，加入氧化物，搅 拌混匀后加入含锇催化剂，室温搅拌10～30h。

所述氧化物可选用氮甲基吗啉氮氧化物、叔丁基过氧化氢或过氧化 氢。

所述含锇催化剂可选用锇酸钾或四锇酸。

带基团的聚甘油结构树枝状大分子经双键氧化后获得带 基团的聚甘油结构树枝状大分子，该带的聚甘油结构树枝 状大分子可以直接使用，也可以与不饱和卤代烷继续进行威廉姆斯反应， 获得代数更高的带基团的聚甘油结构树枝状大分子，用于连接巯基 单体，以获得带不同表面基团的聚甘油结构树枝状大分子。

(3)在氮气保护、紫外光照和安息香二甲醚存在下，将第1代～第5 代中任一带基团的聚甘油结构树枝状大分子与巯基单体进行加成 反应，获得带不同表面基团的聚甘油结构树枝状大分子。

本发明中，所述巯基单体为3-巯基-1,2-丙二醇、巯基丙酸、巯基乙胺 或半胱氨酸。利用3-巯基-1,2-丙二醇可获得表面带羟基的聚甘油结构树枝 状大分子，利用巯基丙酸可获得表面带羧基的聚甘油结构树枝状大分子， 利用巯基乙胺可获得表面带氨基的聚甘油结构树枝状大分子，利用半胱氨 酸可获得表面带氨基酸基团的聚甘油结构树枝状大分子。

本发明还提供了所述聚甘油结构树枝状大分子在制备药物、基因、造 影剂或生物探针载体材料中的应用。

本发明的聚甘油结构树枝状大分子表面含有大量的反应性基团，如氨 基、羟基、羧基或氨基酸基团，其中间产物上带有的双键也属于反应性基 团，可用来键合多种药物、分子探针以及靶向基团，其内核具备的空腔结 构也可负载药物和生物探针，因此，本发明的聚甘油结构树枝状大分子可 以作为生物载体材料广泛地用于药物、基因、造影剂或生物探针的输送。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明以环糊精为核制备的聚甘油结构树枝状大分子，由于其 内部含有大量的醚键，因此具有类似PEG的生物学和化学性质，如良好 的生物相容性，生理条件下化学结构稳定性；

(2)本发明的树枝状大分子的表面含有大量的反应性基团，如双键、 氨基、羟基和羧基等，可用来键合多种药物，分子探针以及靶向基团，其 内核具备的空腔结构也可负载药物和生物探针，因此，它可以作为生物载 体材料广泛地用于药物、基因、造影剂，生物探针的输送；

(3)本发明聚甘油结构树枝状大分子的制备方法，合成步骤少，分 离纯化简单，容易合成高分子量的树枝状大分子，大幅提高了聚甘油结构 树枝状大分子的合成效率，使得这种具有广泛应用前景的树枝状大分子规 模化生产成为可能。

附图说明

图1为本发明第4代表面带基团的聚甘油结构树枝状大分子的 反应原理示意图；

图2A为本发明第1～4代表面带基团的聚甘油结构树枝状大分 子的核磁图；

图2B为本发明第1～4代表面氨基酸修饰的聚甘油结构树枝状大分子 的核磁图；

图3为本发明中明第1～4代表面带基团的聚甘油结构树枝状大 分子的GPC图；

其中，Time(min)表示时间(分钟)；

图4为本发明第1～4代表面氨基酸修饰的聚甘油结构树枝状大分子以 及PAMAM与FBS相互作用的DLS结果；

其中，Size(d.nm)表示规格(粒径，纳米)，Intensity(％)表示强 度(％)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

实施例1第1代表面带基团的聚甘油树枝状大分子(G₁)的合成

将11.1g的NaH(80％)和干燥DMF在500mL圆底烧瓶中混合，10 gβ-环糊精溶解于100mL干燥DMF中逐滴加入圆底烧瓶；搅拌该浊液15 分钟后在冰浴中冷却，然后将31mL溴丙烯在冰浴条件下逐滴加入圆底烧 瓶中；室温条件下，将该反应在氮气气氛保护下继续搅拌8h；将反应溶 剂减压蒸发得到黄色油状的粗产物，将粗产物用200mL甲醇稀释并过滤， 清液用200mL正己烷洗涤3次；甲醇相经旋转蒸发，真空干燥，得到14.6g 淡黄色油状产物，产率为83％。

实施例2第1.5代表面带基团的聚甘油结构树枝状大分子(G_1.5) 的合成

取14.6g G1置于500mL圆底烧瓶中用100mL丙酮溶解，在溶液中 加入30mL叔丁醇，55mL 50％氮甲基吗啉氮氧化物和45mL去离子水， 搅拌混合均匀后加入146mg锇酸钾，将反应体系于室温下搅拌20h后， 在500mL丙酮中沉淀，得到棕色粗产物，将粗产物用50mL甲醇稀释， 过滤除去固体；旋转蒸发，真空干燥得到黄色固体13.2g，产率为67％。

实施例3第2代表面带基团的聚甘油结构树枝状大分子(G₂)的合 成

将4.7g NaH(80％)和100mL干燥DMF在250mL圆底烧瓶中混合， 5g G1.5在50mL干燥DMF中溶解并滴加至该浊液中；搅拌该浊液15分 钟后在冰浴中冷却，然后将14mL溴丙烯在冰浴条件下逐滴加入反应器。

反应过程与纯化过程同实施例1，得到黄色油状产物(G2)4.6g，产 率为57％。

实施例4第2.5代表面带基团的聚甘油结构树枝状大分子(G_2.5) 的合成

将4.6g G2在250mL圆底烧瓶中用50mL丙酮溶解，在溶液中加入 20mL叔丁醇，16mL 50％氮甲基吗啉氮氧化物和40mL去离子水，搅拌 混合均匀后加入46mg锇酸钾。反应过程与纯化过程同实施例2，得到黄 色固体(G2.5)4.2g，产率为70％。

实施例5第3代表面带基团的聚甘油结构树枝状大分子(G₃)的合 成

将3.5g NaH(80％)和30mL干燥DMF在250mL圆底烧瓶中混合， 4g G2.5在50mL干燥DMF中溶解并滴加至该浊液中；搅拌该浊液15分 钟后在冰浴中冷却，然后将10mL溴丙烯在冰浴条件下逐滴加入反应器。 反应过程与纯化过程同实施例1，得到黄色油状产物(G₃)3.5g，产率为 55％。

实施例6第3.5代表面带基团的聚甘油结构树枝状大分子(G_3.5) 的合成

将3g G3在100mL圆底烧瓶中用30mL丙酮溶解。在溶液中加入10 mL叔丁醇，13mL 50％氮甲基吗啉氮氧化物和20mL去离子水，搅拌混 合均匀后加入30mg锇酸钾。反应过程与纯化过程同实施例2，得到黄色 固体(G_3.5)3.0g，产率为76％。

实施例7第4代表面带基团的聚甘油结构树枝状大分子(G₄)的合 成

将2.5g NaH(80％)和30mL干燥DMF在250mL圆底烧瓶中混合， 3g G3.5在30mL干燥DMF中溶解并滴加至该浊液中；搅拌该浊液15分 钟后在冰浴中冷却，然后将7mL溴丙烯在冰浴条件下逐滴加入反应器。 反应过程与纯化过程同实施例1，得到黄色油状产物(G₃)1.6g，产率为 34％。

实施例8第4代表面带氨基酸基团的聚甘油结构树枝状大分子(G₃-Cys) 的合成

取0.5g G3，7.8g L-半胱氨酸盐酸盐和0.15g安息香二甲醚溶解于100 mL甲醇中，通入氮气15分钟排除空气，紫外灯照射下反应6h，获得的 粗产物溶液旋蒸至黄色粘稠液体；通过1000Da透析膜在水中透析1天， 冻干得到淡黄色粉末0.79g，产率为75％。

实施例9第4代表面带氨基酸基团的聚甘油结构树枝状大分子(G₄-Cys) 的合成

取0.5g G4，7.8g L-半胱氨酸盐酸盐和0.15g安息香二甲醚溶解于100 mL甲醇中，通入氮气15分钟排除空气，紫外灯照射下反应6h，获得的 粗产物溶液旋蒸至黄色粘稠液体；通过1000Da透析膜在水中透析1天， 冻干得到淡黄色粉末0.82g，产率为81％。

实施例10第3代表面带氨基的聚甘油结构树枝状大分子(G₃-NH₂)的合 成

0.5g G3，5.0g半胱氨盐酸盐和0.11g安息香二甲醚溶解于100mL 甲醇中，通入氮气15分钟排除空气，紫外灯照射下反应6h，获得的粗产 物溶液旋蒸至黄色粘稠液体；通过1000Da透析膜在水中透析1天，冻干 得到淡黄色粉末0.56g，产率为65％。

实施例11第3代表面带羧基的聚甘油结构树枝状大分子(G₃-COOH)的 合成

取0.5g G3，4.6g巯基丙酸和0.11g安息香二甲醚溶解于100mL甲 醇中，通入氮气15分钟排除空气，紫外灯照射下反应6h，获得的粗产物 溶液旋蒸至黄色粘稠液体，乙醚中沉淀真空干燥得到黄色粘稠固体，0.64 g，产率为65％。

实施例12第3代表面带羟基的聚甘油结构树枝状大分子(G₃-OH)的合 成

取0.5g G3，4.7g 3-巯基-1，2-丙二醇和0.11g安息香二甲醚溶解于 100mL甲醇中，通入氮气15分钟排除空气，紫外灯照射下反应6h；获 得的粗产物溶液旋蒸至黄色粘稠液体，丙酮中沉淀真空干燥得到无色粘稠 固体，0.46g，产率为49％。

测试例1树枝大分子表征

(1)利用¹H-NMR(表征结果见图2A)，GPC(图3)以及Maldi-tof， 对表面带双键的聚甘油结构树枝状大分子(G1,G2,G3,G4)进行表征。

其中，G1的表征数据为：

¹H NMR(CDCl₃,400Hz),δppm:6.0～5.8(m,21H,CH₂CHCH₂O), 5.23～5.16(m,21H,HCHCCH₂-O-),5.16～5.0(m,21H,HCHCCH₂-O-and  C(1)H ofβ-CD),4.42-4.46(m,7H,CH₂CH-HCH-O-),4.19～4.24(m,7H, CH₂CH-HCH-O-),4.10(s,14H,CH₂CHCH₂-O-),3.94(s,14H, CH₂CHCH₂-O-),3.84～3.87(d,7H,C(5)H ofβ-CD),3.70～3.75(s,14H,C(6)H  ofβ-CD),3.63～3.70(d,7H,C(2)H ofβ-CD),3.50～3.57(d,7H,C(3)H of β-CD),3.22～3.33(m,7H,C(4)H ofβ-CD)；

GPC(DMF，0.8mL/min at 40℃)：Mn 2.08kDa,Mw 2.16kDa,PDI 1.09；

Maldi-tof：2027.76 Da。

G2的表征数据为：

¹H NMR(CDCl₃,400Hz),δppm:6.0～5.8(s,42H CH₂CHCH₂O),5.28～5.20(d,42H,HCHCCH₂-O-),5.14(s,42H,HCHCCH₂-O-and 7H, C(1)H ofβ-CD),4.14(s,42H,CH₂CHCH₂-O-),3.98(s,42H,CH₂CHCH₂-O-), 3.2～3.9(broad,147H,-O-CH₂CH(O)CH₂-O-and C(2)H～C(6)H ofβ-CD)；

GPC(DMF，0.8mL/min at 40℃)：Mn 4.99kDa,Mw 5.29kDa,PDI 1.06；

Maldi-tof：4418.55 Da。

G3的表征数据为：

¹H NMR of G3(CDCl₃,400Hz),δppm:6.0～5.8(s,42H,CH₂CHCH₂O),5.28～5.20(d,42H,HCHCCH₂-O-),5.14(s,42H,HCHCCH₂-O-and 7H, C(1)H ofβ-CD),4.14(s,42H,CH₂CHCH₂-O-),3.98(s,42H,CH₂CHCH₂-O-), 3.2～3.9(broad,357H,-O-CH₂CH(O)CH₂-O-and C(2)H～C(6)H ofβ-CD)；

GPC(DMF，0.8mL/min at 40℃)：Mn 9.63kDa,Mw 10.38kDa,PDI 1.07。

G4的表征数据为：

¹H NMR of G4(CDCl₃,400Hz),δppm:6.0～5.8(s,168H,CH₂CHCH₂O),5.28～5.20(d,168H,HCHCCH₂-O-),5.14(s,168H,HCHCCH₂-O-and 7H, C(1)H ofβ-CD),4.14(s,168H,CH₂CHCH₂-O-),3.98(s,168H, CH₂CHCH₂-O-),3.2～3.9(b,777H,-O-CH₂CH(O)CH₂-O-and C(2)H～C(6)H  ofβ-CD)；

GPC(DMF，0.8mL/min at 40℃)：Mn 20.82kDa,Mw 21.56kDa,PDI 1.04。

(2)表面羟基，氨基，羧基以及氨基酸(图2B)等结构的树枝状大分 子，均利用¹H-NMR进行表征。

其中G3-Cys的¹H-NMR(D₂O,400Hz)的数据为：

δppm:5.18(s,7H,C(1)H ofβ-CD),4.0(s,84H,HOCOCH(NH₂)), 3.83～3.25(broad,525H,-SCH₂CH₂CH₂O-and C(2)H～C(6)H ofβ-CD),3.05 (s,168H,-SCH₂CH(NH₂)-),2.61(s,168H,-SCH₂CH₂CH₂O-),1.80(s,168H, -SCH₂CH₂CH₂O-)。

测试例2表面氨基酸修饰的聚甘油结构树枝大分子的抗蛋白吸附试验

利用动态光散射仪(DLS)测定PBS、胎牛血清以及树枝状大分子混 合溶液中蛋白质颗粒粒径的变化，表征表面氨基酸结构树枝状大分子抗蛋 白质吸附的性质。

将1ml胎牛血清(FBS)与1mL PBS、1ml G3-Cys的PBS溶液、1mL  PAMAM(聚酰胺-胺型树枝状高分子，5代，下同)的PBS溶液分别混合， 依次获得溶液1(阴性对照)、溶液2、溶液3(阳性对照)，静置5分钟， 在DLS中测定粒径大小。测定结果见图4。

其中，溶液2与溶液1现象一致，溶液澄清，粒径分布在200nm以下； 而溶液3，肉眼可见浑浊，粒径主要分布在1000nm左右。证明表面氨基 酸结构的树枝状大分子G3-Cys有较好的抗蛋白质吸附的能力。

树枝状大分子G3-Cys的抗蛋白质吸附性能主要是由其表面的Cys基 团决定的，表面连接有Cys基团的其他代数的树枝状大分子也具备相同的 抗蛋白质吸附的能力。

测试例3表面氨基酸修饰的聚甘油结构树枝大分子的肝脏富集实验

将罗丹明B异硫氰酸酯标记的G3-Cys和PAMAM溶于PBS中，浓度 分别为22.9mg/mL和15.7mg/mL；对5周龄ICR雌性小鼠分别通过尾静 脉给药10mL/kg。注射PAMAM的小鼠在给药后表现出明显的不良反应并 在注射后0.75h左右死亡。而注射G3-Cys的小鼠在注射后1h时处死，并 将两只老鼠分别解剖，取出肝脏制备冷冻切片，通过激光共聚焦显微镜进 行观察发现，发现PAMAM在肝脏中富集明显，呈点状分布；而G3-Cys 在肝脏中基本无富集。

这是因为PAMAM易于与蛋白质结合，从而容易被肝脏中的kuffer 细胞捕获，进而在肝脏中富集。而G3-Cys具有良好的抗蛋白吸附能力， 因此并未在肝脏中富集；抗蛋白吸附性能使其生物相容性更好，体内循环 时间更长，作为载体能够更加有效的将药物基因等输送到病灶部位。