决明酮苷在制备黄嘌呤氧化酶抑制剂中的应用

摘要

本发明提供了决明酮苷在制备黄嘌呤氧化酶抑制剂中的应用。经体外试验证实，决明酮苷对黄嘌呤氧化酶活性有明显抑制作用；经实验性高尿酸血症小鼠模型试验证实，决明酮苷显著降低模型小鼠血清尿酸水平，可用于制备黄嘌呤氧化酶抑制剂，用于制备抑制黄嘌呤氧化酶活性治疗高尿酸血症的产品。

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，涉及决明酮苷在制备黄嘌呤氧化酶抑制剂中的应用。

背景技术

高尿酸血症是嘌呤代谢紊乱或（和）尿酸排泄减少所引起的一组异质性疾病，是引发痛风的重要生化基础，与心血管疾病、慢性肾脏病及代谢综合征，如糖尿病、肥胖等密切相关，是一种严重影响公共健康的疾病。来自中国、美国和英国等国的流行病学调查显示高尿酸血症的发病率呈急速上升趋势，被世界卫生组织列为二十世纪人类十大顽症之一。高尿酸血症不仅严重影响病人的生活质量，甚至威胁患者生命，严重威胁到公共卫生健康状态，给社会带来沉重的经济负担。

黄嘌呤氧化酶作为尿酸生成关键酶是降低尿酸药物的作用靶点。黄嘌呤氧化酶是一种黄素蛋白酶，存在于各种生物体中，可催化体内的嘌呤底物形成尿酸。黄嘌呤氧化酶的晶体结构由1330个氨基酸构成，其氨基酸序列在鼠和人之间具有90%的同源性，它是由两个完全对称的结构单元构成。每个结构单元为145 ku，其催化中心包括一个钼蝶玲中心、两个铁-硫中心和一个黄素腺嘌呤二核苷酸，其中钼蝶玲中心是黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤生成尿酸的关键位点。

人体内尿酸的来源有内源性和外源性之分，外源性尿酸来源于食物，占体内尿酸来源的20%；内源性尿酸源于体内氨基酸、磷酸核糖及其他小分子合成和核酸分解代谢，占体内尿酸来源的80%。尿酸生成过多是高尿酸血症的一个主要发病原因。黄嘌呤氧化酶广泛分布于人体心、肺、肝等组织细胞浆内，能催化黄嘌呤和次黄嘌呤的氧化生成尿酸，并产生过氧化物自由基，尿酸浓度过高会导致高尿酸血症，并可引起痛风发作。别嘌呤醇和非布索坦是在临床上使用的黄嘌呤氧化酶抑制剂，但皮肤过敏、肝炎、超敏反应综合征等不良反应在一定程度上限制了其使用。2013年国家食品药品监督管理总局发布第57期《药品不良反应信息通报》，提示别嘌呤醇引起重症药疹的安全问题。

为筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂，本案发明人构建了以黄嘌呤为底物，HPLC法测定尿酸生成量的黄嘌呤氧化酶抑制活性评价体系，从毒副作用小的天然产物中寻找黄嘌呤氧化酶抑制剂，发现了高活性化合物决明酮苷。

决明酮苷，又名决明酮-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，属于奈苷类化合物，英文名称torachrysone-8-O-β-D-glucopyranoside，主要存在于虎杖、巴天酸模、尼泊尔酸模、戟叶酸模、何首乌、掌叶大黄、唐古特大黄、喜马拉雅大黄、长柱琉璃草、刺亦模、毛脉廖等植物中。具有具有α-葡萄糖苷酶抑制作用（Babu KS，Tiwari AK，Srinivas PV，Ali AZ，Raju BC，Rao JM. Bioorg Med Chem Lett，2004，14：3841-3845）、神经保护作用（Xiang L，Lei Fan，Xing DM，Wang W，Zheng JH. Tsinghua Science and Technology，2005，10（4）：426-429）、促进毛发生长作用（Sun YN，Cui L，Li W，Yan XT，Yang SY，Kang JI，Kang HK，Kim YH. Bioorg Med Chem Lett，2013，23：4801-4805）和抗炎作用（Matsuda H，Kageura T，Morikawa T，Toguchida I，Harima S，Yoshikawa M. Bioorg Med Chem Lett，2000，10：323-327）。

但未见决明酮苷抑制黄嘌呤氧化酶活性作用和抗高尿酸血症作用的研究报道。

发明内容

本案发明人以组分结构理论为指导，从宏观到微观解析，微观到宏观表征虎杖抗高尿酸血症有效部位组分结构，以抗高尿酸血症主要靶点寻找活性化合物。采用黄嘌呤氧化酶抑制活性指标指导下的导向分离模式虎杖提取物抗高尿酸血症活性物质基础，从有效部位中分离鉴定了决明酮苷、大黄素-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、虎杖苷、白藜芦醇、大黄酚。发现其中决明酮苷对黄嘌呤氧化酶活性有显著地抑制作用，因而完成了本发明。

本发明目的是提供决明酮苷在制备黄嘌呤氧化酶抑制剂中的应用。

决明酮苷是如下结构式的化合物：

                                                 。

决明酮苷抑制黄嘌呤氧化酶活性，可在制备黄嘌呤氧化酶抑制剂中应用，通过抑制黄嘌呤氧化酶活性，抑制催化黄嘌呤和次黄嘌呤的氧化生成尿酸，可在制备抑制黄嘌呤氧化酶活性治疗高尿酸血症产品中应用。

本发明的决明酮苷在制备黄嘌呤氧化酶抑制剂中的应用优点为作用机制明确，决明酮苷可从虎杖、巴天酸模、尼泊尔酸模、戟叶酸模、何首乌、掌叶大黄、唐古特大黄、喜马拉雅大黄、长柱琉璃草、刺亦模、毛脉廖等植物中分离，毒副作用小。

本发明还提供用本发明所述的决明酮苷以及药学上可接受的载体或赋形剂制备的药物制剂。这些药物制剂选自以下剂型：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、泡腾片剂、舌下片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、微囊剂、微球剂、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、散剂、膏剂、口服液、混悬剂、溶液剂、气雾剂、注射剂，注射乳剂、冻干粉针，还可以根据需要制备成缓释或控释制剂。

本发明的含有所述决明酮苷的药物制剂，在制备药物制剂时可加入药物可接受的载体，所述药物可接受的载体来自：抗氧剂、鏊合剂、表面活性剂、填充剂、崩解剂、湿润剂、溶剂、缓释材料、肠溶材料、pH调节剂、矫味剂、色素等，常用载体如：甘露糖醇、右旋糖苷、乳糖、葡萄糖、山梨醇、木糖醇、注射用水、注射用乙醇、氯化钠、硅衍生物、纤维素、纤维素衍生物、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、吐温80、琼脂、碳酸钙、聚乙二醇、环糊精、磷脂类材料、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙等。

附图说明

图1  决明酮苷对黄嘌呤氧化酶抑制动力学Lineweaver-Burk双倒数图

以下通过具体实施例对本发明作进一步的说明，并非对本发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于具体实施例。

具体实施方式

实施例1

决明酮苷对黄嘌呤氧化酶抑制作用半数抑制浓度IC₅₀测定

HPLC测定方法：Diamonsil ODS色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：100 mmol/L磷酸二氢钠溶液（pH=3.5）；检测波长：290 nm；流速：1.0 mL/min。

测定体系：不同浓度测试品溶液（含0.25%DMSO的0.07 mol/L磷酸盐缓冲液）200μL加入0.07 mol/L磷酸盐缓冲液140μL，黄嘌呤氧化酶溶液120μL（0.02 unit/mL，0.07 mol/L磷酸盐缓冲液），25℃保温15 min，加入黄嘌呤溶液240μL（300μmol/L，0.07 mol/L磷酸盐缓冲液），25℃保温15 min，加入1 mol/L盐酸100μL终止反应。空白对照测定，供试品溶液用含1%DMSO的0.07 mol/L磷酸盐缓冲液代替。HPLC法测定尿酸生成量，每组浓度平行三次，计算抑制率。以测试品浓度为横坐标，抑制剂对黄嘌呤氧化酶抑制率为纵坐标绘制IC₅₀曲线，通过SPSS统计学软件计算出决明酮苷的IC₅₀为8.31μM；临床治疗药物别嘌呤醇的IC₅₀为3.42μM。

实施例2

决明酮苷对黄嘌呤氧化酶抑制作用类型测定

HPLC测定方法：Diamonsil ODS色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：100 mmol/L磷酸二氢钠溶液（pH=3.5）；检测波长：290 nm；流速：1.0 mL/min。

测定体系：不同浓度测试品溶液（含0.25%DMSO的0.07 mol/L磷酸盐缓冲液）200μL，加入0.07 mol/L磷酸盐缓冲液140μL，加入黄嘌呤溶液240μL（100 μmol/L、50 μmol/L、37.5μmol/L、25μmol/L，0.07 mol/L磷酸盐缓冲液），黄嘌呤氧化酶溶液120μL（0.05 unit/mL，0.07 mol/L磷酸盐缓冲液），25℃保温1 min，加入1 mol/L盐酸100μL终止反应。HPLC法测定尿酸生成量，每组浓度平行三次，按Lineweaver-Burk双倒数图法确定抑制作用类型。不同浓度决明酮苷Lineweaver-Burk双倒数直线均相交于X轴，表示决明酮苷的抑制类型为非竞争性抑制；不同浓度临床治疗药物别嘌呤醇Lineweaver-Burk双倒数直线均相交于Y轴，表示别嘌呤醇的抑制类型为竞争性抑制。

实施例3

决明酮苷对实验性高尿酸血症模型小鼠血清尿酸水平的影响

小鼠随机分为6组，每组20只，分别为正常对照组（生理盐水10 mL/Kg）、模型对照组（氧嗪酸钾250 mg/Kg），决明酮苷高剂量组（氧嗪酸钾250 mg/Kg+决明酮苷40 mg/Kg），决明酮苷中剂量组（氧嗪酸钾250 mg/Kg+决明酮苷20 mg/Kg），决明酮苷低剂量组（氧嗪酸钾250 mg/Kg+决明酮苷10 mg/Kg），别嘌呤醇对照组（氧嗪酸钾250 mg/Kg+别嘌呤5 mg/Kg）。每天AM9:00分别灌胃给予模型对照组和各给药组氧嗪酸钾，1小时后各给药组分别灌胃给药，给药周期7天，正常对照组和模型对照组灌胃给予等量生理盐水。在第7天给药1小时后，小鼠眼球后静脉丛取血（取血前1血小时禁食），在10000×g条件下离心5分钟，取血清。采用磷钨酸还原法测定血清尿酸水平。结果见表1。

表1 决明酮苷对实验性高尿酸血症模型小鼠血清尿酸水平的影响

          同正常对照组比较：^##P<0.01

          同模型对照组比较：*P<0.05，**P<0.01

    同正常对照组比较，模型对照组大鼠血清尿酸水平明显增高。别嘌呤醇5 mg/Kg组、决明酮苷20 mg/Kg和40 mg/Kg组同模型组比较显著降低模型小鼠血清尿酸水平。

实施例4

决明酮苷的结构鉴定

¹H-NMR（CD₃OD，500 MHz）：6.98（2H，s，H-5，7），6.77（1H，s，H-4），5.07（1H，d，J = 7.7，H-1'），3.84（3H，s，-OCH₃），2.58（3H，s，-COCH₃），2.27（3H，s，-CH₃）；¹³C-NMR（CD₃OD，125 MHz）：208.1（-COCH₃），160.4（C-6），157.1（C-8），153.7（C-1），139.1（C-9），135.4（C-3），123.9（C-2），120.3（C-4），110.3（C-10），104.4（C-7），104.3（C-1'），102.5（C-5），78.8（C-5'），78.1（C-3'），74.9（C-2'），71.3（C-4'），62.4（C-6'），56.0（-OCH₃），32.6（-COCH₃），20.2（-CH₃）；ESI-MS m/z：431 [M+Na]⁺。

实施例5

决明酮苷用药学上可接受的载体或赋形剂制备的药物制剂。这些药物制剂选自以下剂型：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、泡腾片剂、舌下片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、微囊剂、微球剂、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、散剂、膏剂、口服液、混悬剂、溶液剂、气雾剂、注射剂，注射乳剂、冻干粉针，还可以根据需要制备成缓释或控释制剂，在制备药物制剂时可加入药物可接受的载体，所述药物可接受的载体来自：抗氧剂、鏊合剂、表面活性剂、填充剂、崩解剂、湿润剂、溶剂、缓释材料、肠溶材料、pH调节剂、矫味剂、色素等，常用载体如：甘露糖醇、右旋糖苷、乳糖、葡萄糖、山梨醇、木糖醇、注射用水、注射用乙醇、氯化钠、硅衍生物、纤维素、纤维素衍生物、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、吐温80、琼脂、碳酸钙、聚乙二醇、环糊精、磷脂类材料、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙。上述制备工艺均为本领域常规操作，在此不加赘述。

实施例6

决明酮苷为原料制得的药物制剂不仅包括单独使用决明酮苷的药物制剂，还包括添加决明酮苷作为活性成分的药物制剂。