一种羟基红花黄色素A冻干粉针剂的制备方法及其产品

摘要

本发明公开了一种羟基红花黄色素A冻干粉针剂的制备方法及其产品，所述方法包括将羟基红花黄色素A、维生素C以及甘露醇加入配液缸中，然后向配好的药液中加入医用活性炭，过滤脱碳，除菌微孔滤膜精滤，分装半加塞，最后冻干即得。本发明通过将含有羟基红花黄色素A的药物组合进行低温滤膜过滤灭菌后，装入小瓶，再将这种组合物冰冻，并在真空下将水除去的方法制备成了羟基红花黄色素A冻干粉针剂，相较于传统方法制成的红花注射液提高了羟基红花黄色素A的稳定性及其含量。

说明书

技术领域

本发明涉及从中药红花中分离出羟基红花黄色素A并将其制备成冻干粉针 剂的制备方法及其产品，本发明属于医药技术领域。

背景技术

中药红花是一种被中国药典收录的传统中药，广泛地用于治疗心脑血管疾 病。红花中的主要成分羟基红花黄色素A，具有多方面的药理活性,羟基红花 黄色素A有拮抗血小板活化因子受体结合作用；减少心肌梗塞面积；降低血压、 抗血栓和抑制血小板凝聚等；羟基红花黄色素A能显著降低压和减少心率,羟 基红花黄色素A还有抑制细胞凋亡和细胞周期保护缺氧引起的人脐静脉内皮 细胞损伤作用；此外羟基红花黄色素A还有抗氧化作用、抗肿瘤作用等。

由于羟基红花黄色素A是查尔酮类衍生物，稳定性差，高温灭菌会影响到药物 的稳定性。因此，本发明对羟基红花黄色素A注射液的稳定性进行了考察，发现注 射液的稳定性极差，故为了提高其稳定性，本发明通过将含有羟基红花黄色素A的 药物组合进行低温滤膜过滤灭菌后，装入小瓶，再将这种组合物冰冻，并在真空下 将水除去的方法制备成了羟基红花黄色素A冻干粉针剂，从而提高了红花黄色素A 的稳定性及其含量。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种羟基红花黄色素A冻干粉针剂的制备方法，所 述的羟基红花黄色素A的结构如下所示：

所述的冻干粉针剂可通过以下方法制备得到：

1)配液:将羟基红花黄色素A、维生素C以及甘露醇加入配液缸中，加入注 射用水搅拌至全部溶解，用氢氧化钠调节pH为6.5-7.5，补加注射用水至溶液体积 为羟基红花黄色素A质量的150-250倍；

2)脱色：向配好的药液中加入药液质量1.0-3.0％的医用活性炭，室温搅拌， 过滤脱碳，然后滤液再用除菌微孔滤膜精滤，分装，半加塞；

3)冻干

a、预冻：将分装好的药液按1.1℃/分钟速度降温至-48℃，保温冷冻3小时；

b、升华：将预冻好的药液抽真空，至15Pa，然后在8小时内匀速缓慢升温至 -20℃，保温2小时，再在5小时内匀速升温至5℃；

c、干燥：将升华完毕阶段结束后的药液在4小时内匀速升温至40℃，保温干 燥3小时，即得。

其中，优选的，步骤(1)中维生素C的加入量为羟基红花黄色素A重量的1％， 甘露醇的加入量为羟基红花黄色素A重量的30％，用氢氧化钠调节pH为7.0，补 加注射用水至溶液体积为羟基红花黄色素A质量的200倍。

其中，优选的，所述的羟基红花黄色素A通过以下方法提取得到：

1)红花(Carthamus tinctorius L.)的干燥花适度粉碎，加去离子水，浸泡24h之 后40-60℃水浴加热0.5-2h，超声5-15分钟，过滤；滤渣再次用水浴加热0.5-2h， 超声5-15分钟，过滤，合并滤液；浓缩至相对密度为1.16～1.26，加乙醇，冷藏， 静置36-72小时，滤过，滤液回收乙醇，并浓缩至相对密度为1.10～1.14，再加乙 醇使含醇量达75-85％(v/v)，冷藏，静置36-72小时，滤过，滤液回收乙醇，用 旋转蒸发仪浓缩得到相对密度为1.16～1.20的浸膏；

2)取红花浸膏上大孔树脂柱，依次用去离子水、10％(v/v)乙醇洗脱，流速 为2柱体积/h，收集10％(v/v)乙醇洗脱物，洗脱液浓缩，真空干燥，即得。

本发明的第二个目的在于提供有上述方法制备得到的羟基红花黄色素A药用制 剂新剂型—冻干粉针制剂。

附图说明

图1为红花水提液过大孔色谱后的100％水洗脱及10％乙醇洗脱物的HPLC图 谱(A.HSYA标准品；B-F:100％水不同洗脱时间收集的组分；G:10％乙醇洗脱物)；

图2为经waters 2545高通量分离纯化系统制备的羟基红花黄色素A的高效液 相色谱图；

图3为红花注射液在制备过程中不加稳定剂经高温灭菌前羟基红花黄色素A的 含量变化；

图4为红花注射液在制备过程中不加稳定剂经高温灭菌后羟基红花黄色素A的 含量变化；

图5为红花注射液在制备过程中加入稳定剂经高温灭菌前羟基红花黄色素A的 含量变化；

图6为红花注射液在制备过程中加入稳定剂经高温灭菌后羟基红花黄色素A的 含量变化；

图7为同等浓度的原液做成红花注射液和冻干粉后HSYA的含量对比。

上图为红花注射液中HSYA的含量，下图为冻干粉剂中HSYA的含量。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述 而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域 技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的 细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1、羟基红花黄色素A冻干粉针剂的制备

1、羟基红花黄色素A的制备

1.1用中药材粉碎机粉碎干红花，称取干红花粉末700g，加水7000ml浸泡24h 之后通过50℃水浴锅水浴加热1h，50℃超声10分钟，用4层纱布过滤，总滤液抽 滤，得待用滤液1和滤渣。滤渣再次用50℃水浴加热1h，50℃超声10分钟，用4 层纱布过滤抽滤后得滤液2。将滤液1与滤液2合并，滤过，滤液浓缩至相对密度 为1.16～1.26，加乙醇使含醇量达70％(v/v)，冷藏，静置48小时，滤过，滤液回 收乙醇，并浓缩至相对密度为1.10～1.14，再加乙醇使含醇量达80％(v/v)，冷藏， 静置48小时，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度为1.16～1.20，用旋转蒸发仪 浓缩，水浴锅温度不超过60℃。本制备方法可有效保护羟基红花黄色素A不分解变 性。

1.2取直径为10cm长度为85cm的色谱柱洗净，最底层用洁净脱脂棉铺放，再 用醇、碱、酸处理后铺放洁净的石英砂，将D101型大孔树脂装柱并去离子水泡24h 发胀至饱和，去除色谱柱里的空气，在大孔树脂上层再铺上洁净脱脂棉和小玻璃珠。 然后用去离子水洗4倍柱体积后醇泡24h，再用醇洗至洗出液与水比例为1:5无白 色浑浊物为止，去离子水洗至无醇味后加入5％HCl浸泡4h，用5％HCl冲洗2倍柱 体积，水洗至中性，最后用2％NaOH浸泡4h后用2％NaOH冲洗2倍柱体积，去离 子水水洗至中性备用。

1.3取红花浸膏128g，上大孔树脂柱，依次用去离子水、10％(v/v)乙醇、20％ (v/v)乙醇和30％(v/v)乙醇洗脱，流速为2柱体积/h，接样瓶每瓶接样200ml 并分别进行编号，接样同时进行聚酰胺薄膜点板分析，在日光及紫外灯下观察斑点 情况，并进行合并。将合并后的样品分别浓缩，冷冻干燥成粉末，称量并标号放置 冰箱备用。

1.4精密称取HSYA标准品0.0010g，用蒸馏水配制成浓度为0.1mg/mL的溶剂， 过0.45μm微孔滤膜后在高效液相上进行梯度洗脱。设置0.5％磷酸水为A，甲醇为 B，洗脱程序为0～60min：10％B～100％B；60～70min：100％B。流速为1ml/min,在 以上设置的基础上通过安捷伦1200二极管阵列检测器进行全波长扫描，选取3D图 及220nm、360nm、403nm波长观察出峰情况，相对调整，最终确立最佳HPLC条 件Agilent Ecsipse XDB-C18(4.6×150mm，5μm)，甲醇-0.5％磷酸水(23:77)为流 动相，流速1ml/min，波长403nm，进样量10μl。以HSYA标准品为参比，将100％ 水洗脱、10％(v/v)乙醇洗脱物及羟基红花黄色素A标准品在相同色谱条件下进行 HPLC分析，结果见图1。确定10％(v/v)乙醇洗脱物为收集目标，经waters 2545 高通量分离纯化系统制备纯的羟基红花黄色素A纯度达97％，高效液相色谱图如图 2所示。

2、羟基红花黄色素A冻干粉针剂的制备

2.1配液:将羟基红花黄色素A 5g、稳定剂维生素C 0.05g以及赋形剂甘露醇 1.5g加入配液缸中，加入注射用水搅拌至全部溶解，用氢氧化钠调节pH为7.0，补 加注射用水至1000ml；

2.2脱色：向配好的药液中加入医用活性炭，室温搅拌，过滤脱碳，然后滤液 再用0.22μm的除菌微孔滤膜精滤，分装，半加塞。

2.3冻干

a、预冻：将分装好的药液按1.1℃/分钟速度降温至-48℃，保温冷冻3小时；

b、升华：将预冻好的药液抽真空，至15Pa，然后在8小时内匀速缓慢升温至 -20℃，保温2小时，再在5小时内匀速升温至5℃；

c、干燥：将升华完毕阶段结束后的药液在4小时内匀速升温至40℃，保温干 燥3小时，即得。

实施例2、羟基红花黄色素A冻干粉针剂的制备

1、羟基红花黄色素A的制备

1.1用中药材粉碎机粉碎干红花，称取干红花粉末700g，加水7000ml浸泡24h 之后通过60℃水浴锅水浴加热1.5h，50℃超声5分钟，用4层纱布过滤，总滤液抽 滤，得待用滤液1和滤渣。滤渣再次用60℃水浴加热1.5h，50℃超声5分钟，用4 层纱布过滤抽滤后得滤液2。将滤液1与滤液2合并，滤过，滤液浓缩至相对密度 为1.16～1.26，加乙醇使含醇量达70％(v/v)，冷藏，静置72小时，滤过，滤液回 收乙醇，并浓缩至相对密度为1.10～1.14，再加乙醇使含醇量达80％(v/v)，冷藏， 静置48小时，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度为1.16～1.20的浸膏，用旋 转蒸发仪浓缩。

1.2取直径为10cm长度为85cm的色谱柱洗净，最底层用洁净脱脂棉铺放，再 用醇、碱、酸处理后铺放洁净的石英砂，将D101型大孔树脂装柱并去离子水泡24h 发胀至饱和，去除色谱柱里的空气，在大孔树脂上层再铺上洁净脱脂棉和小玻璃珠。 然后用去离子水洗4倍柱体积后醇泡24h，再用醇洗至洗出液与水比例为1:5无白 色浑浊物为止，去离子水洗至无醇味后加入5％HCl浸泡4h，用5％HCl冲洗2倍柱 体积，水洗至中性，最后用2％NaOH浸泡4h后用2％NaOH冲洗2倍柱体积，去离 子水水洗至中性备用。

1.3取红花浸膏128g，上大孔树脂柱，依次用去离子水、10％(v/v)乙醇洗脱， 流速为2柱体积/h，收集10％(v/v)乙醇洗脱物，接样瓶每瓶接样200ml，并进行 合并。将合并后的样品分别浓缩，冷冻干燥成粉末，称量并标号放置冰箱备用。

2、羟基红花黄色素A冻干粉针剂的制备

2.1配液:将羟基红花黄色素A 5g、稳定剂维生素C 0.05g以及赋形剂甘露醇 1.5g加入配液缸中，加入注射用水搅拌至全部溶解，用氢氧化钠调节pH为7.0，补 加注射用水至1000ml；

2.2脱色：向配好的药液中加入药液质量1.0-3.0％的医用活性炭，室温搅拌， 过滤脱碳，然后滤液再用0.22μm的除菌微孔滤膜精滤，分装，半加塞。

2.3冻干

a、预冻：将分装好的药液按1.1℃/分钟速度降温至-48℃，保温冷冻3小时；

b、升华：将预冻好的药液抽真空，至15Pa，然后在8小时内匀速缓慢升温至 -20℃，保温2小时，再在5小时内匀速升温至5℃；

c、干燥：将升华完毕阶段结束后的药液在4小时内匀速升温至40℃，保温干 燥3小时，即得。

实验例1：红花注射液工艺流程考察及稳定性研究

1、2010药典红花注射液的制备工艺

取红花500g，加水煎煮三次，第一次1小时，第二次50分钟，第三次30分钟， 合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.161-26，加乙醇使含乙醇量达70％，冷藏， 静置48小时，滤过，滤液回收乙醇，并浓缩至相对密度为1.10-1.14，再加乙醇使含 醇量达80％，冷藏，静置48小时，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度为1.16-1.20， 加10倍量的水，冷藏，静置16-24小时，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.02-1.04，用 50％氢氧化钠溶液调节PH值7.5-8.0，加注射用水使成1000ml，滤过，获得原料液， 灌封，灭菌，即得。

2、灭菌前后羟基红花黄色素A的含量考察

取原料药液100ml，加入稳定剂，测量加入稳定剂(如维生素C)后的羟基红花 黄色素A的含量。取100ml原料液不加入稳定剂，测量此时的羟基红花黄色素A的 含量。对有稳定剂与无稳定剂的红花注射液灌封。两者在相同的环境下进行灭菌， 灭菌温度为103℃～108℃，灭菌时间为25-30min。观察灭菌后的红花注射液的性状 变化，高效液相法检测灭菌后的羟基红花黄色素A的含量。(高效液相基本色谱条 件：色谱柱XDB-C18,150×4.6mm,5μm coulmn；乙腈，5％磷酸水为流动相(乙腈： 5％磷酸水为1:9)；柱温25℃，流速v＝1.0ml/min，进样量为10微升)观察颜色和 PH值的变化。

3、灌装前HSYA的含量测定

取原料液20ml，置于4℃的冰箱储藏。在0天，2天，3天，4天，5天分别取2ml 原料液，置于5ml的容量瓶中，加注射用水至刻度。再从容量瓶中取2ml，高效液相 法检测HSYA的含量。高效液相基本色谱条件：色谱柱XDB-C18,150×4.6mm,5μm coulmn；乙腈，5％磷酸水为流动相(乙腈：5％磷酸水为1:9)；柱温25℃，流速 v＝1.0ml/min，进样量为10微升，并观察颜色变化。

4、稳定剂考察

有稳定剂和无稳定剂的红花注射液成品，各取8只放入综合药品稳定性试验箱 的光照实验箱。其中4支放于光照处，另外4支放于暗处。在5小时，24小时，50小 时，70小时分别吸取药液2ml，置于5ml的容量瓶中，加注射用水至刻度。从容量瓶 中取2ml，高效液相法检测羟基红花黄色素A的含量，并观察颜色变化。结果如图 3-6所示。

红花注射液在灭菌前和灭菌后羟基红花黄色素A的含量有很大程度的改变，无 稳定剂和有稳定剂的红花注射液灭菌前后的颜色变化、PH值、羟基红花黄色素A 峰面积以及灭菌前后峰面积的减少百分率，如表1。制成红花注射液原料液后，及 时加入稳定剂(如维生素C)及时灌封。灌封过程应该排除安瓿内的空气或充入惰 性气体。灭菌后，成品应该密封，低温，暗处储存。红花注射液的主要活性成分羟 基红花黄色素A极易受到环境影响，因此，红花做成注射液的制备必须严格控制温 度，可考虑做成冻干粉针剂，以避免高温灭菌过程。

表1 有稳定剂和无稳定剂的灭菌前后的变化

实验例2：羟基红花黄色素A冻干粉针的制备及其稳定性考察

1、处方：羟基红花黄色素A 5g、赋形剂甘露醇1.5g、稳定剂维生素C 0.05g, 加注射用水至1000ml。

2、冻干骨架剂种类的筛选：

常见的冻干稳定剂有：柠檬酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、维 生素C、乙二胺四乙酸二钠等。根据我们前期对红花注射液稳定性的考察结果，加 入羟基红花黄色素A重量的1％的稳定剂维生素C可防止红花水提液中有效成分羟 基红花黄色素A的分解，对其制成粉针剂有较好的稳定作用。鉴于此，本发明优 选以1％的维生素C作为羟基红花黄色素A冻干粉针剂的稳定剂。

常见的冻干支持剂有：甘露醇、葡萄糖、乳糖、氯化钠等，对上述支持剂进行 了筛选。

取羟基红花黄色素A 5g，加入维生素C 0.05g，加入羟基红花黄色素A重量的 3％的不同支持剂，待充分溶解后加活性炭处理，微孔滤膜过滤，进行冻干。冻干效 果见表2。

表2 冻干支持剂种类的筛选

由表2可见，以冻干粉针剂的成型性、水溶性、澄明度以及在冻干过程中有无 喷瓶现象发生为依据，选择甘露醇为冻干支持剂。

2、冻干支持剂的用量考察：

取羟基红花黄色素A 5g，加入维生素C 0.05g，不同比例量的甘露醇支持剂， 待充分溶解后加活性炭处理，微孔滤膜过滤，进行冻干。冻干效果见表3，可见以 3％(w/w)的甘露醇作为冻干支持剂效果最好。

表3 冻干支持剂用量考察

3、除菌方法：

湿热灭菌法，干热灭菌法或加压灭菌法都会造成羟基红花黄色素A的结构破 坏，不但降低药物的含量和药效，可能还会引起不良反应，所以我们采用孔径为0.22 μm的微孔滤膜，在常温下通过物理过筛作用，对药液进行过滤灭菌，以避免红花 有效成分的破坏和损失。

4.羟基红花黄色素A冻干粉制备方法：

4.1配液：将羟基红花黄色素A 5g、赋形剂甘露醇1.5g、稳定剂维生素C 0.05g 加入配液缸中，加入适量注射用水搅拌至全部溶解，用氢氧化钠调节pH为7.0，补 加注射用水至溶液体积为1000毫升；

4.2脱色：向配好的药液中加入药液质量1.0-3.0％的医用活性炭，室温搅拌 15分钟，过滤脱碳，然后滤液再用0.22um除菌微孔滤膜精滤，滤液测PH值、含 量，分装半加塞，

4.3冻干

a、预冻：将分装好的药液按1.1℃/分钟速度降温至-48℃，保温冷冻3小时。

b、升华：将预冻好的药液抽真空，至15Pa，然后在8小时内匀速缓慢升温至 -20℃，保温2小时，再在5小时内匀速升温至5℃。

c、干燥：将升华完毕阶段结束后的药液在4小时内匀速升温至40℃，保温干 燥3小时。

同等浓度的原液做成红花注射液(参照药典2010版)和冻干粉剂后HSYA的 含量对比如图7所示。