杂交瘤细胞DBP-4E10及其产生的邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体

摘要

本发明提供了杂交瘤细胞株4E10、其分泌产生的抗邻苯二甲酸二丁酯DBP单克隆抗体及其应用。该杂交瘤细胞株4E10可以用于制备高效价邻苯二甲酸二丁酯DBP抗体，鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得的效价可达3.12×10

说明书

技术领域

本发明涉及杂交瘤细胞株DBP-4E10及其产生的邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体。

背景技术

邻苯二甲酸酯类化合物（PAEs)是一类环境激素类物质，具有雌激素活性，干扰生物体内分泌系统正常功能、导致突变、畸变和癌细胞增殖。2005年，欧盟将邻苯二甲酸二辛酯（DEHP）, 邻苯二甲酸二丁酯（DBP）及邻苯二甲酸丁苄酯（BBP）评定为“第二类生殖毒性”。其中，DBP被认为是毒性最高的酞酸酯类化合物。

PAEs化合物是塑料工业的主要增塑剂和软化剂，广泛应用于食品包装材料、容器、医疗用品及塑料等的制造。由于其广泛应用以及从各种制品中的释放，酞酸酯类化合物已经几乎渗透到我们生活的每一个角落。研究表明，我国居民DBP每日摄入量为12.2mg/kg，超过世界卫生组织建议的10mg/kg.d的每日最大容许摄入量标准。食品被认为是人类暴露于酞酸酯类化合物的主要途径。食品中酞酸酯类化合物的污染主要来自于食品的塑料包装以及生产过程。这是因为酞酸酯是一种脂溶性化合物，它很容易进入食品的脂肪、油脂中，并在其中富集。

DBP现有的检测方法GC、MS、HPLC测定DBP灵敏度高、精确度好，而且能分别测定结构相似的多种化合物及其异构体，是目前最理想的检测方法。但是这类分析方法体系将待测污染物从样品中分离提取并去除杂质干扰的前处理过程十分复杂，操作费时，分析成本昂贵。所以开发操作简单、快速、经济且灵敏度高的检测方法具有重要的实际意义。

免疫分析方法将免疫反应的高特异性和现代测试手段高灵敏性相结合，具有快速、经济、样品所需量少、前处理简单等优点，成为现代生物化学、医学、化学分析和环境监测等领域的研究热点。免疫分析是利用抗原抗体的特异性的结合反应和抗原、抗体上的标记物的放大作用来对超微量待测物进行定性、定量检测，所以要研究建立针对邻苯二甲酸二丁酯（DBP）的任何一种免疫学检测技术，都必须先获得抗邻苯二甲酸二丁酯（DBP）的抗体。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供杂交瘤细胞株DBP-4E10及其产生的邻苯二甲酸二丁酯DBP的单克隆抗体

本发明提供了杂交瘤细株DBP-4E10，该细胞株已于2014年12月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是，中国，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.10202。分类命名为S/P20杂交瘤细胞。

抗邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体由保藏编号为CGMCC NO. 10202的杂交瘤细胞株DBP-4E10分泌产生。该DBP单克隆抗体可以识别邻苯二甲酸二丁酯，对邻苯二甲酸二丁酯的50%抑制浓度IC50为 0.22 mg/L。

抗邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体在邻苯二甲酸二丁酯测定中的应用。

本发明提供的杂交瘤细胞株DBP-4E10单克隆抗体是采用三步法筛选获得的，其具体步骤是：以4-硝基邻苯二甲酸酐在H₂SO₄作用下和正丁醇反应生成4-硝基邻苯二甲酸二丁酯，然后将硝基还原成氨基，在最后在盐酸和亚硝酸钠的存在下发生重氮化作用然后和BSA偶联生成DBP-BSA。用其免疫BLAB/c小鼠4次，最后一次加强免疫用2倍与前一次免疫剂量的DBP-BSA，免疫3天后进行细胞融合。采用ELISA分两步法进行筛选融合细胞：第一步采用间接ELISA法筛选出仅能抗邻苯二甲酸二丁酯而不抗载体蛋白BSA的阳性克隆；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性克隆培养液进行检测，采用DBP作为竞争源，选择吸光度值低、灵敏度较高的阳性克隆进行有限稀释法继续克隆，克隆10天后采用同样的两步筛选法进行抗体检测，如此重复2次，最终筛选获得的杂交瘤细胞DBP-4E10。

本发明提供的邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体的制备方法，步骤如下：将获得的杂交瘤细胞株DBP-4E10注射预先用弗氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，纯化处理后获得抗邻苯二甲酸二丁酯的单克隆抗体。

上述纯化方法的具体操作为：腹水于4℃，3000r/min 离心 5min 以上，吸取上清，将上清与2倍体积的醋酸盐缓冲液混合，边搅拌边缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33μL，室温混合 30min，4℃静置 2h以上，使其充分沉淀。然后 4℃，12000r/min离心 30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用砂芯漏斗过滤后，加入 1/10 滤液体积的0.1mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液，用 2 mol/L 的氢氧化钠溶液调节pH 至 7.4，4 ℃预冷1小时，缓慢加入0.277g/mL硫酸铵至硫酸铵终浓度为45%，4℃静置 2h以上，然后 4℃ 12000r/min离心 30min，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积 1/10 的 0.01mol/L 磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用0.01mol/L 磷酸盐缓冲液透析，将充分透析好的蛋白溶液加入等体积甘油，置-20℃冰箱中备用；

醋酸盐缓冲液 ：0.29g 醋酸钠加入 0.141mL 醋酸，纯水定容至 100mL ；

0.1mol/L 磷酸盐缓冲液 ： 0.8g 氯化钠，0.29g 十二水磷酸氢二钠，0.02g 氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至 100mL。

0.01mol/L 磷酸盐缓冲液：用纯水将0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液稀释10倍。

本发明的有益效果在于：

1 本发明提供的杂交瘤细胞DBP-4E10可以用于制备高效价的抗邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体，将邻苯二甲酸二丁酯小鼠腹水抗体酶联免疫吸附方法测定的效价达到3.12×10⁶，即腹水稀释至3.12×10⁶时溶液测定结果仍为阳性。

2 本发明提供的邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体灵敏度高、特异性好，对邻苯二甲酸二丁酯的半抑制浓度IC50为0.22 mg/L，与邻苯二甲酸二乙丁酯的交叉反应率36.9%，与邻苯二甲酸丁苄酯的交叉反应率10.7%，与其他结构类似物的交叉反应率均小于1%。

3 本发明提供的抗邻苯二甲酸二丁酯的单克隆抗体可用于测定邻苯二甲酸二丁酯的含量。

附图说明

     图1 DBP-4E10单克隆抗体对DBP的标准曲线。

具体实施方式

实施例1：杂交瘤细胞株DBP-4E10的筛选

1.     抗原的合成及动物的免疫

4-硝基邻苯二甲酸酐与正丁醇生条件下发生酯化反应，得到4-硝基邻苯二甲酸二丁酯，再在酸性条件下与锌粉发生还原反应，得到半抗原衍生物4-氨基邻苯二甲酸二丁酯酯，有苯氨基的邻苯二甲酸酯半抗原衍生物在低温下与NaNO2和浓HCl发生重氮化反应，生成相应的重氮盐；重氮盐与载体蛋白发生偶联反应，得到相应的人工抗原。

4-硝基邻苯二甲酸二丁酯的合成

将2.5克 4-硝基邻苯二甲酸溶于50mL正丁醇中，向其中缓慢滴入1mL浓H2SO4作催化剂，在120℃下反应并不断搅拌。反应结束后，用10%NaCO3洗涤三次，每次10mL。80℃旋转蒸发除去正丁醇和水。得油状物质4-硝基邻苯二甲酸二丁酯，称重。

4-氨基邻苯二甲酸二丁酯酯的合成

称取0.1523克4-硝基邻苯二甲酸二丁酯；加入28mL苯和0.28g锌粉，然后分三次加入8.2mL浓HCl，搅拌反应18min后再加入0.28克锌粉，室温搅拌反应12h。反应结束后，分液；然后用34mLH2O清洗苯层，分别用5g无水Na2SO4干燥苯层三次，50℃旋转蒸发除去苯。得黄色4-氨基邻苯二甲酸二丁酯固体，称重。

人工抗原的合成

配置A液：称取0.0466克4-氨基邻苯二甲酸二丁酯于50mL三角瓶中，依次加入0.1mL浓HCl、3mLH2O和2mL二甲基甲酰胺。置冰浴5度下，搅拌。逐滴加入0.2mol/L亚硝酸钠，至淀粉KI试纸变蓝，反应30分钟。

配置B液：4mg/mLBSA的硼酸钠缓冲溶液（pH9.0）40mL。

将B液逐滴加入A液中，逐渐有橙红色溶液出现，继续反应2h，得粗产品。反应液装入透析袋中，磷酸盐缓冲液（pH7.4 0.01mol/L）透析3天，每天换两次透析液。收集透析袋内的液体，即为制得的DBP-BSA人工抗原。

人工抗原的鉴定

通过紫外光谱扫描法鉴定表明制备得到了邻苯二甲酸二丁酯的完全抗原DBP-BSA。

购买 6 周龄雌性 BALB/c 小鼠 6 只，免疫自行合成的邻苯二甲酸二丁酯的完全抗原DBP-BSA。第一次免疫将完全抗原DBP-BSA与等量弗氏完全佐剂混合乳化，然后小鼠颈背部皮下多点注射。第二次免疫于首免3周后进行，采用弗氏不完全佐剂与等体积完全抗原DBP-BSA 乳化，免疫剂量与方法与首免相同。第三次免疫与第二次免疫间隔时间3周，免疫剂量和方法与第二次相同。第四次免疫于第三次免疫 3 周后进行，免疫方式及免疫剂量与第三次免疫相同，每次免疫剂量为每鼠 50μg。前 3 次每次免疫后一周，眼周采血，分离血清，采用间接 ELISA 法监测小鼠血清抗体效价。第 4 次免疫后3天，尾静脉采血，分离血清，采用间接 ELISA 法监测小鼠血清抗体效价，并用间接竞争 ELISA 法测定小鼠血清灵敏度，选择效价、灵敏度均相对较高的血清对应的小鼠进行最后一次加强免疫，免疫剂量为之前的 2 倍。

2.     细胞融合

最后一次加强免疫3天后，采用50%（重量百分比）的聚乙二醇（PEG，分子量1460）作融合剂，按常规方法进行细胞融合。具体步骤如下：

将BALB/c小鼠脱颈处死，浸泡于75%酒精中。约3 min后放入超净台。用镊子提起小鼠腹部皮肤，用手术剪剪一个小口(注意勿剪破腹膜)，然后用镊子向头、尾两个方向撕开皮肤，充分暴露腹膜。换用干净剪刀剪开腹膜，取出脾脏，放入已盛有10mL不完全培养液的平皿中清洗一次，并剥去结缔组织。将脾脏转入另一盛有5 mL不完全培养液的平皿中，取一铜网，将脾脏置于铜网上，用注射器内芯研磨脾脏，并用平皿内的不完全培养液冲洗铜网，使脾细胞全部通过网孔进入溶液中。将脾细胞溶液转入50 ml离心管中，加不完全培养液至30 mL，混匀。1000 rpm离心5 min，弃上清。沉淀细胞再用不完全培养液离心一次，然后将细胞悬于10 ml完全培养液中，混匀。细胞计数，备用。

将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10的比例混合，在50 mL离心管中用DMEM培养基洗1次，1200 rpm离心8 min；弃上清，用吸管吸净残留液体。用50%PEG融合，用含20%牛血清、1% HAT DMEM培养基重悬。将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μL。将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养。DMEM培养基为含有2%（重量百分数）生长因子的DMEM基础培养基，DMEM基础培养基购于Hyclone公司，1%HAT（次黄嘌呤－氨基蝶呤－胸腺嘧啶核苷购于Gibco公司。

3.     细胞株的筛选及克隆

待细胞融合后第 10天左右，细胞集落长到占孔底 1/2面积大小，即可进行抗体检测。采用 ELISA方法对有杂交瘤细胞生长的培养孔进行筛选，筛选分两步进行，第一步采用间接 ELISA 法筛选出抗邻苯二甲酸二丁酯而不抗载体蛋白 BSA 的阳性孔 ；第二步采用间接竞争 ELISA 法对第一步筛选出的阳性孔进行检测，用邻苯二甲酸二丁酯作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔（吸光值较高指竞争原为 0 的孔即阴性对照孔的最终测定值较高，灵敏度较高指抑制率为 50% 时的竞争原浓度亦即 IC 50 值较小），采用有限稀释法将杂交瘤细胞克隆化，克隆后 10天左右采用同样的两步法进行检测，如此重复克隆 2-3次后，获得杂交瘤细胞株 DBP-4E10。

实施例2：抗体的制备、纯化及鉴定

将实施例1获得的将获得的杂交瘤细胞株DBP-4E10注射预先用弗氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，纯化处理后获得抗邻苯二甲酸二丁酯的单克隆抗体。

具体操作为：腹水于4℃ 3000r/min 离心 5min 以上，吸取上清，将上清与2倍体积的醋酸盐缓冲液混合，边搅拌边缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33μL，室温混合 30min，4℃静置 2h，使其充分沉淀。然后 4℃ 12000r/min离心 30min，弃沉淀，将得到的上清液用砂芯漏斗过滤后，加入 1/10 滤液体积的0.1mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液，用2 mol/L 的氢氧化钠溶液调节pH 至 7.4，4 ℃预冷1小时，缓慢加入0.277g/mL硫酸铵至硫酸铵终浓度为45%，4℃静置 2h，4℃ 12000r/min离心 30min，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积 1/10 的 0.01mol/L 磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用0.01mol/L 磷酸盐缓冲液透析，将充分透析好的蛋白溶液加入等体积甘油，置-20℃冰箱中备用；

醋酸盐缓冲液 ：0.29g 醋酸钠加入 0.141mL 醋酸，纯水定容至 100mL ；

0.1mol/L 磷酸盐缓冲液：0.8g 氯化钠，0.29g 十二水磷酸氢二钠，0.02g 氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至 100mL。

0.01mol/L 磷酸盐缓冲液：用纯水将0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液稀释10倍。

用常规非竞争酶联免疫吸附分析（ELISA）法测得2D10的鼠腹水抗体的效价可达3.12×10⁶，即腹水稀释至3.12×10⁶时测定结果为阳性。用常规间接竞争 ELISA法鉴定其对对邻苯二甲酸二丁酯的半抑制浓度IC50为0.22 mg/L，与邻苯二甲酸二乙丁酯的交叉反应率36.9%，与邻苯二甲酸丁苄酯的交叉反应率10.7%，与其他结构类似物的交叉反应率均小于1%。

实施例3：抗体的应用

将杂交瘤细胞株DBP-4E10分泌的抗邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体用于邻苯二甲酸二丁酯单克隆ELISA添加回收试验，具体步骤如下：

（1）       包被：使用96孔聚苯乙烯酶标板，用0.05mol/L pH 9.6 的碳酸缓冲液将DBP-BSA稀释到1μg/mL，用多道可调式移液枪（简称排枪）往每孔中加入100μL，加完后将酶标板用保鲜膜盖住，置于4℃过夜。

（2）       洗板：第二天，将酶标板从4℃取出，使用PBST洗涤，每孔250μl，洗涤4次，洗完后在毛巾上拍干。

（3）       封闭：用排枪往每孔中加入200μL 1% BSA的PBS，加完后将酶标板用盖盖住，置于37℃放置2h。使用PBST洗涤，每孔250μl，洗涤4次，洗完后在毛巾上拍干。

（4）       用35%甲醇配制0、0.03、0.09、0.27、0.81、2.43 mg/L的邻苯二甲酸二丁酯标准溶液。将标准溶液及待检测样品提取液，分别加入已经封闭好的酶标板中，50mL/孔，每个样品3个重复孔，再加入稀释成1：50000邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体50mL/孔，再加入稀释成1：3000的酶标二抗50mL/孔，轻轻拍打酶标板后37℃恒温箱中反应40min。

（5）       洗板：操作同上。

（6）       显色：将显色液A和显色液B按1：1的体积比混合，用排枪加入混合好的显色液100mL/孔，置37℃恒温箱避光环境反应10min。

（7）       测定：使用排枪加入2mol/L H₂SO₄ 50mL/孔，轻轻振荡酶标板，使用酶标仪检测450/630nm波长处OD值。

（8）       添加回收率及样品前处理：称取5g 白酒置于干净的10mL 玻璃试管中，分别添加1.5、3、5mg DBP，加入2mL色谱纯的正己烷，盖上盖后振荡3min，静置，待分层后取上层清液1mL，于干净的玻璃器皿中挥干。挥干后用1mL 35%的甲醇重溶，转移至1.5ml离心管后作为ELISA样品提取液待测。采用间接竞争ELISA进行添加回收率实验，回收率分别为78.1、89.9、109.3%。

（9）       溶液的配置： 碳酸缓冲液：称取Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，加入纯水至990mL，调pH至9.6，再用纯水定容至1000mL，4℃贮存备用。 磷酸缓冲液（PBS）： 8.5g NaCl，2.2g Na₂HPO₄12H₂O，0.2g NaH₂PO₄2H₂O，溶于900mL纯水中，调pH至7.4，定容至1000mL。 PBST：取500mL PBS，加入0.25mL 吐温20，混匀备用。

显色液A：20mg TMB溶于10mL DMSO中，4℃保存，临用前取出恢复至室温，用纯水稀释至100mL。

显色液B：21g 一水合柠檬酸，71.1g Na₂HPO₄12H₂O，2g 过氧化氢尿素，加纯水定容至1000mL。

酶标二抗购自于SoutherBiotech公司。