牛乳中分离凝血酶抑制肽的方法及其活性测定和质谱鉴定

摘要

本发明公开了一种牛乳中分离凝血酶抑制肽的方法及其活性测定和质谱鉴定，通过对牛乳进行酶解、纯化，对获得的蛋白组分进行抗凝血效果分析，对高抗凝血组分进行液相色谱-电喷雾质谱鉴定和生物信息学分析，有效地分离出了牛乳中的凝血酶抑制肽，其凝血酶抑制率可达91.51％，发现了安全、毒副作用小的抗血液凝集肽，为用以制备治疗和预防血栓的药品或保健品、保障人类健康、预防和减少心血管疾病的发生提供基础。

说明书

技术领域

本发明属生命医学领域，具体涉及一种牛乳中分离凝血酶抑制肽的方法及其活性测定和质谱鉴定。

背景技术

随着我国居民生活方式的变化、人口老龄化以及城镇化的发展，心血管病发病人数持续增加，目前已成为我国发病率、致残率和死亡率最高的疾病。相应地，因心血管病造成的死亡也已占我国城乡居民总死亡原因的首位，其中农村为38.7％，城市为41.1％。病理性血栓是其中严重影响我国居民身体健康的一类心血管疾病，可引发肺梗塞、脑血栓、视网膜动静脉阻塞、心肌梗塞、四肢及周围血管栓塞，己经成为我国高致病、高死亡的一类疾病，调查显示，近年来每1000人中就有1-3人患有血栓类疾病。

研发抗凝血药物，对于预防和减少血栓类疾病具有重要的意义和临床价值。尽管肝素、口服香豆素、链激酶和尿激酶等抗凝血药物已经应用一段时间，但这些药物会导致血小板减少、出血等副作用。近些年来，从水蛭、蜱虫、钩口线虫、蛇毒和蜂毒中提取的抗凝溶栓活性物质显示出良好的抗凝血效果，但毒副作用大、来源有限、价格昂贵。随着对保健食品、功能性食品研究的不断深入，研发安全、有效、副作用小、来源广泛的抗凝血产品引起了越来越多的关注。

生物活性肽因其安全性高、易吸收、功效好，近些年来已被广泛应用于功能性产品的开发，例如抗氧化肽、降血压肽、抗疲劳肽、增强免疫力肽及增强记忆力肽。乳中含有大量的生物活性因子，如阿片样肽(Opioid peptides)、降血压肽(Antihypertensive peptides)、抗血栓肽(Antithrombolic peptides)、免疫促进肽((Immunositimulating peptodes)、促钙吸收的酪蛋白磷酸肽(Casein phosphopeptides)等，这些活性多肽主要是由生物体分泌细胞、内分泌腺组织器官、体液或胞质产生或获得的，生命活动中的血液凝固或抗凝、细胞分化、神经激素递质调节、肿瘤病变、免疫调节、生物钟节律、生殖控制等均与活性多肽密切相关。

目前，一些肽类化合物已被发现具有显著的抗凝血活性，按其来源不同可分为非食物源肽和食物源肽两大类，其中非食物源抗凝肽已有较长的研究历史，而食物源抗凝肽 的研究近年来才引起广泛的关注。牛乳凝固与血液凝固机制有着许多相似之处，牛乳除本身存在的抗凝结因子之外，一些隐藏在蛋白质中的肽段，经酶消化释放出来，也表现出抗凝活性，这些活性肽对血液同样具有良好的抗凝结功效，因而具有抗血栓的生理功能。牛乳作为食物的组成部分，从中提取的抗凝血肽具有副作用小、可直接使用的优势。我国是世界畜牧业大国，2012年奶牛存栏数已达1493万头，牛乳生产总量达3743.6万吨，成为世界第三大产奶国，原料来源十分丰富，具有很高的研究价值。目前，国内外在这一方面的研究还尚未见分离鉴定的报道，亟待深入研究。

经检索，付莉等采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶对牛乳蛋白进行水解，结果水解度在5.24％-10.58％之间，其中胰蛋白酶的水解度最高；该作者上述酶采用的pH值分别为5.88、5.91、6.00、6.32、6.40和6.67，明显偏酸性；另外该作者采用鲜牛乳进行试验，其技术方案不便于技术推广和产业化进展，同时还会造成大量的经济成本。

发明内容

针对上述现状，本发明的目的是提供一种牛乳中分离凝血酶抑制肽的方法及其活性测定和质谱鉴定。本技术方案通过对牛乳进行酶解、纯化，对获得的蛋白组分进行抗凝血效果分析，对高抗凝血组分进行液相色谱-电喷雾质谱(LC-ESI-MS)鉴定和生物信息学分析，初步摸清其组成，预测其特性和功能，为进一步阐明牛乳的抗凝血机制，发现安全、毒副作用小的抗血液凝集肽，用以制备治疗和预防血栓的药品或保健品，保障人类健康，预防和减少心血管疾病的发生提供基础。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供一种从牛乳中分离凝血酶抑制肽的方法，所述方法包括如下步骤：

步骤一，采用蛋白酶对牛乳进行酶解，对酶解产物进行钝化、离心、透析，得酶解产物混合物；

步骤二，采用Sephadex G-50层析柱对所述酶解产物混合物进行分离纯化，即得凝血酶抑制肽。

优选地，步骤一中，所述蛋白酶包括碱性蛋白酶2709、风味蛋白酶、Neturase 1.5MG、Alcalase 2.4L、Protex 6L、Protex 7L、中性蛋白酶或胰蛋白酶。

更优选地，所述蛋白酶为Alcalase 2.4L。

优选地，步骤一中，所述牛乳来自全脂奶粉，如光明乳业股份有限公司生产的全脂奶粉(批号20140806044132)等。

优选地，步骤一中，所述钝化具体指将酶解产物置于100℃加热15min。

优选地，步骤一中，所述透析的时间为48h。

优选地，步骤一中，所述酶解产物混合物冷冻至干粉，置于-20℃冰箱中备用。

优选地，所述方法还包括对步骤二所得凝血酶抑制肽进行抗凝血酶活性测定、LC-ESI-MS鉴定或生物信息学分析。

优选地，所述生物信息学分析包括凝血酶抑制肽的分子量、等电点分析，亚细胞定位分析，信号肽分析或功能分析等。

优选地，所述亚细胞定位采用软件为PSORTⅡ；信号肽分析采用软件为SignalP 4.1；功能分析采用软件为GO软件。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、本发明在现有酶解技术的基础上，对酶解产物进行分离、纯化后的LC-ESI-MS、生物信息学分析等，是一种全面、系统的凝血酶抑制肽分离、分析方法；双向电泳(two-dimensional electrophoresis，2-DE，也称二维电泳)是现有蛋白质组学研究中最早使用的分离技术，但它对碱性端的蛋白分离效果较差，尤其对低丰度蛋白的分离效果有限；而LC-ESI-MS技术是近年来广泛使用的高通量、高灵敏度的蛋白质组学分析方法，在定量分析和低丰度蛋白的分离分析方面更加便利和准确；本发明运用LC-ESI-MS技术对牛乳的高凝血酶抑制组分进行了蛋白质组学分析，结果层析组分液相色谱谱图显示，蛋白分离清晰，信号强度高，蛋白分离效果良好，存在多个高丰度蛋白，为进行ESI质谱分析打下了良好基础；

2、本发明所选用酶的pH值分别为8.0、7.5、8.5、7.0，环境温和；

3、本发明采用奶粉作为牛乳来源，在实际操作中更易于定量，重复性更强，增强了本发明的准确性和科学性，同时在本发明技术方案推广及产业化中利于存储，降低成本。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为牛乳层析样品的液相色谱谱图；

图2为牛乳鉴定多肽的亚细胞定位；

图3为牛乳鉴定多肽的信号肽存在情况；

图4为牛乳层析产物鉴定蛋白功能分布图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

1材料与方法

1.1实验材料

全脂奶粉，光明乳业股份有限公司生产，批号20140806044132；碱性蛋白酶2709、Protex 6L、Protex 7L、Neturase 1.5MG、风味蛋白酶购自上海为奥生物科技有限公司；Alcalase 2.4L购自丹麦诺维信酶制剂公司；中性蛋白酶、胰蛋白酶、Tris购自上海生工生物工程公司；凝血酶(型号T4648-1kv，牛血浆)、纤维蛋白原(型号F6755，大鼠血浆)、Sephadex G-50，购自Sigma公司；蓝色葡聚糖Dextran blue 2000购自上海西塘生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2不同种蛋白酶对牛乳的酶解比较

选择碱性蛋白酶2709、风味蛋白酶、Neturase 1.5MG、Alcalase 2.4L、Protex 6L、Protex 7L、中性蛋白酶和胰蛋白酶共8种蛋白酶分别进行酶解比较。称取6.0g全脂奶粉溶于200mL去离子水中，磁力搅拌15min，90℃加热预处理10min。先根据不同蛋白酶的最适温度和pH值(表1)，分别加温和调整pH值，然后添加奶粉质量5％的蛋白酶酶解1-2h，观察不同蛋白酶的水解效果。在水解过程中加入0.1mol/L的NaOH以维持pH值恒定，每10min记录一次耗碱量。采用pH-stat法，通过以下公式计算水解度(degree of hydrolysis,DH)：DH％＝M/Mh×100％＝[V×C/(a×m×Mh)]×100％，其中V为消耗碱的体积(mL)；C为碱的浓度(mmol/mL)；m为奶粉中蛋白质含量(g)，牛乳的蛋白质含量为40％；a为氨基酸平均解离程度，1/a＝1.08；Mh为每克蛋白质中肽键的毫摩尔数，对于奶粉蛋白质为8.3。反应结束后，将水解物于100℃加热15min以钝化蛋白酶，待其自然冷却后，以4 500r/min离心15min，收集上清液。取水解度最高的奶粉酶解产物上清50mL加入透析袋中，于重蒸水中透析48h后，在冷冻干燥仪中冷冻至干粉，置-20℃冰箱中备用。

1.3牛乳酶解产物的分离纯化

采用Sephadex G-50层析柱分离纯化牛乳源凝血酶抑制肽。取2L蒸馏水，置于超声波清洗机中超声30min去气泡，静置备用，后续步骤中使用的均为此去气泡蒸馏水。取 Sephadex G-50 4.5g，加入蒸馏水中沸水浴1h，待溶胀平衡后，自然冷却至室温，倾去上清液，以除去破碎的颗粒后装柱。取0.9×50cm层析柱，清洗，垂直置于铁架台上，关闭柱出口，加入蒸馏水，使底部充满液体，把溶胀好的凝胶调成薄浆，连续倒入柱内。当沉积的胶床至2-3cm时，打开柱的出口，以均匀不变的流速灌胶，直到装完为止。静止10min，打开出液口，排除过量的洗脱液，使柱内胶面上保留5-6cm洗脱剂。之后继续持续添加一个柱体积的蒸馏水，使柱内胶面上始终保留5-6cm洗脱剂，以此平衡柱层。取冷冻干燥的纯化样品，分别溶于5mL蒸馏水中溶解。打开柱的出口，待柱中洗脱液流至距床表面1-2cm时，关闭出口。用移液枪将5mL样品慢慢加至柱床表面，打开出口，当样品渗入床中，接近床表面1cm时关闭出口。同时小心地加入少量蒸馏水，再打开柱的出口，使床表面的样品全部渗入床中。在床的表面小心地加入蒸馏水，高出床面5-6cm。层析开始，不断加入蒸馏水，使柱内胶面上保留5-6cm洗脱剂，在柱的出口处以离心管分管收集流出液，直到柱中样品全部被洗下，将纯化好的样品置于-20℃冰箱中备用。一个样品层析完后，用两个柱体积以上的蒸馏水清洗柱子。

1.4牛乳不同纯化产物的抗凝血酶效果测定

采用酶标仪法测定抗凝血肽对凝血酶的抑制活性。将酶标仪的测定波长设定为405nm，纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液均以蒸馏水配制。向酶标板的小孔中加入140μL 0.1％(W/V)纤维蛋白原溶液，用全波长酶标仪(Thermo/MSS BioTek-Epoch)测光密度(optical density，OD)值两次，得到光密度差值(ODb)；加入40μL样品溶液，读数，再加10μL凝血酶溶液(12U/mL)开始反应，10min后读数，测得光密度差值(ODs)。取40μL蒸馏水代替样品溶液，其他操作同样品管，测得光密度差值(ODc)。

按下式计算样品抑制凝血酶催化纤维蛋白原形成纤维蛋白的能力：Y(抑制率)＝[(ODc-ODs)/(ODc-ODb)]×100％。

1.5牛乳高抗凝血活性组分的LC-ESI-MS鉴定

1.5.1样品的FASP酶解

取牛乳分离获得的高抗凝血酶活性样品50μL，加入50μL 8M尿素，再加入1μL 1MDTT至终浓度为10mM，37℃还原2.5h，冷却至室温。加入5μL 1M IAA溶液，避光30min。加入200μL 25mM碳酸氢铵缓冲液，再加入4μg Trypsin，37℃酶解过夜。酶解样品酸化后，过3M C18脱盐柱脱盐，再加入500μL 0.1％TFA过柱2次，再加500μL 0.1％TFA、70％乙腈水洗脱2次。将样品冻干、复溶，用于色谱分析。

1.5.2毛细管高效液相色谱分析

色谱柱0.15mm×150mm(RP-C18，Column Technology Inc.)以95％的0.1％甲酸水溶液(A液)平衡。样品由自动进样器上样到Zorbax 300SB-C18peptide traps(Agilent Technologies,Wilmington,DE)，再经色谱柱分离，相关液相梯度如下：0min-50min，0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为84％)(B液)线性梯度从4％到50％；50min-54min，B液线性梯度从50％到100％；54min-60min，B液维持在100％。2.5.3ESI质谱鉴定

酶解产物经毛细管高效液相色谱脱盐及分离后用Q Exactive质谱仪(Thermo Fisher)进行质谱分析。检测方式为正离子。多肽和多肽的碎片的质量电荷比按以下方法采集：每次全扫描(full scan)后采集10个碎片图谱(MS²scan)。

1.6质谱数据处理及生物信息学分析

1.6.1ESI质谱数据分析 

原始文件用Mascot 2.2软件搜索相应的数据库，获得鉴定的蛋白质信息。相关参数如下：Enzyme＝Trypsin；Missed cleavage＝2；Fixed modification：Carbamidomethyl(C)；Variable modification：Oxidation(M)；搜索使用Uniprot数据库，即uniprot_Bos_taurus_31817_20140914.REVERSED.fasta，下载日期20140914，序列31817条。Peptides tolerance：20ppm；MS/MS tolerance：0.1Da；Mascot结果过滤参数为：Mascot score≥20。

1.6.2多肽的生物信息学分析

蛋白质分子质量、等电点通过蛋白质组学网(http://www.expasy.org/tools)和蛋白质专家分析软件(expert proteins analysis system，ExPASy)分析；蛋白质亚细胞定位基于PSORT II软件(http://psort.hgc.jp/form2.html)分析；信号肽分析采用SignalP 4.1软件分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；功能分类基于Gene Ontology(GO)注解软件(http://geneontology.org/)分析。

2结果与分析

2.1八种蛋白酶对牛乳的酶解比较

采用8种蛋白水解酶，在各自最适条件下，对牛乳蛋白进行酶解，结果，牛乳的水解度在2.95％～14.77％之间，水解度最高的为Alcalase 2.4L(表1)。

表1 8种蛋白水解酶对牛乳的酶解结果

蛋白水解酶 最适温度(℃) 最适pH值 耗碱量(mL) 水解度(％) 碱性蛋白酶2709 60 8.5 23.9 11.77 风味蛋白酶 52 7.5 9.6 4.73 Neturase 1.5MG 50 7.5 10.6 5.22 Alcalase 2.4L 60 8.5 30 14.77

Protex 7L 50 7.5 15.5 7.63 Protex 6L 50 7.5 26 12.80 中性蛋白酶 50 7.0 6 2.95 胰蛋白酶 50 8.0 7.5 3.69

2.2牛乳酶解产物的纯化及不同纯化产物的抗凝血酶效果测定

取Alcalase 2.4L水解的牛乳上清液各50mL，经透析、冷冻干燥后，溶于5mL重蒸水并过柱后，收集不同层析液，测定其抑制凝血酶活性效果，结果，编号为15的牛乳层析样品抑制率最高，达到91.51％(表2)。

表2 不同层析样品的抑制率

说明：“-”表示该结果可疑。Note:“-”means these results were doubtful. 

2.3牛乳高抗凝血活性组分的LC-ESI-MS鉴定

将编号为15#的牛乳Alcalase 2.4L酶解纯化产物进行LC-ESI-MS分析，结果成功地获得了质谱谱图(图1)。牛乳层析样品经ESI鉴定共获得了147个多肽序列，通过数据库搜索，共鉴定出70个多肽(表3)。

表3 牛乳层析样品LC-ESI-MS鉴定结果

2.4多肽的分子量和等电点分析

经软件分析，牛乳样品中鉴定的多肽分子量在4359.24～303704.48之间，等电点在4.66～11.25之间(表3)。

2.5多肽的亚细胞定位

经PSORT II软件分析，牛乳鉴定多肽中定位于细胞外、细胞膜、细胞质、分泌囊泡的多肽分别有2、7、19、1个，占2.86％、10.00％、27.14％和1.43％；定位于线粒体、内质网、空泡、细胞核中的多肽分别有4、8、1和23个，占5.71％、11.43％、1.43％和32.86％；定位未知的有5个，占7.14％(图2)。

2.6多肽的信号肽分析

经SignalP 4.1软件分析，牛乳鉴定多肽中，有信号肽的有29个，占41.43％；无信号肽的有36个，占51.43％；信号肽未知的有5个，占7.14％(图3)。

2.7多肽的功能分类

经GO软件分析，牛乳层析样品鉴定的多肽的功能大致可分为22类，包括影响蛋白(酶)活性(6个)、蛋白合成(4个)、蛋白结合(7个)、胞外区(12个)、信号转导(1个)、转运蛋白(9个)、细胞粘附及迁移(1个)、离子代谢(3个)、胞浆蛋白(1个)、细胞凋亡调节(2个)、细胞分化调节(2个)、激素活性调节(2个)、膜蛋白(3个)，以及免疫反应调节(1个)、化学刺激检测(1个)、核酸结合(2个)、线粒体蛋白及其折叠(1个)、核酸合成及代谢(2个)、核蛋白(1个)、脂类代谢(1个)、结构蛋白(2个)和未知功能蛋白(2个)(图4)。

本发明采用8种蛋白水解酶，对牛乳溶液进行酶解，结果发现，牛乳的水解度在2.95％～14.77％之间，其中Alcalase 2.4L的水解度最高，其次为碱性蛋白酶。

取Alcalase 2.4L水解的牛乳上清过柱层析，不同组分对凝血酶的抑制率各不相同，最高的可达到91.51％，上述结果提示本研究通过比较不同蛋白酶的水解效果，获得了对凝血酶抑制效果更好的组分，为下一步鉴定其蛋白组分、特性和功能打下了良好的基础。

对牛乳ESI质谱鉴定的70种多肽进行生物信息学分析，结果发现，牛乳鉴定的多肽中定位于细胞外、细胞膜、细胞质、分泌囊泡的多肽分别有2、7、19、1个，占2.86％、10.00％、27.14％和1.43％；另外一些多肽定位于线粒体、内质网、空泡、细胞核中，其中定位于细胞核的比例最高，达32.86％，此外还有5个多肽定位未知。信号肽分析显示，牛乳鉴定多肽中，29个有信号肽，占41.43％；36个无信号肽，占51.43％；另有5个未知。GO软件分析显示，牛乳鉴定多肽的功能大致可分为22类，包括影响蛋白(酶)活性、蛋白合成、蛋白结合、胞外区、信号转导、转运蛋白、细胞粘附及迁移、离子代谢、胞浆蛋白、细胞凋亡调节、细胞分化调节、激素活性调节、膜蛋白等等，这些蛋白可能参与抑制凝血酶的活性，值得进一步深入研究。

由于目前鉴定的凝血酶抑制肽种类尚非常少，尤其牛乳源的凝血酶抑制肽基本空白，其序列及结构特征不清楚，这给深入分析鉴定牛乳源凝血酶抑制肽带来了困难。下一步将重点对那些定位于细胞外、细胞膜和细胞质中，具有信号肽，又具有蛋白结合、调节蛋白合成和活性等功能的多肽进行进一步的深入研究，以具体确定这些多肽在牛乳抑制凝血酶活性中的作用，为研发安全、有效、副作用小、来源广泛的抗凝血药物或保健品奠定基础。

综上所述，本发明采用8种蛋白水解酶对牛乳蛋白进行酶解，发现Alcalase 2.4L对牛乳的水解度最高，达14.77％。其水解上清液Sephadex G-50柱层析产物的凝血酶抑制率可达91.51％。对从牛乳获得的凝血酶抑制活性最高的层析组分进行LC-MSI-MS分析，鉴定出70个多肽，对这些多肽的分子量、等电点、亚细胞定位、信号肽和可能的功能分类进行了软件分析和预测，发现它们具有影响蛋白(酶)活性、蛋白合成、蛋白结合、胞外区、信号转导、转运蛋白、细胞粘附及迁移、离子代谢、胞浆蛋白、细胞凋亡调节、细胞分化调节、激素活性调节等功能，为今后进一步鉴定牛乳中功能明确、结构清晰的凝血酶抑制肽，阐明牛乳的抗凝血机制，研发安全、有效、副作用小、来源广泛的新型抗凝血药物或保健品打下了基础。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改。