同时测定亚致死量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性的方法

摘要

本发明公开了一种同时测定亚致死量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性的方法，包括如下步骤：(1)制备含干扰剂的金黄色葡萄球菌的菌悬液；(2)测定抗药性；(3)测定耐药性；(4)敏感性恢复测定；(5)找出所述亚致死量金黄色葡萄球菌对所述消毒剂的抗性及其耐药性的变化规律。本发明同时测定亚致死量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性的方法在一个实验中将细菌的抗药性、耐药性和药敏性恢复测定相结合，特别是能很直观看到抗药性、耐药性之间的变化规律及联系，具有准确、直接揭示二者的内部联系的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种同时测定细菌抗药性和耐药性测定方法，具体涉及一种同时测定亚致死 量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性的方法。

背景技术

自1961年jevons在英国首先发现MRSA，20世纪60年代中期扩展至欧洲许多国家及加 拿大，70年代末MRSA极具增多遍及全球，耐药范围日益扩大，耐药程度日益严重。80年 代后期已成为全球性的病原菌，居医院感染病原菌的首位，占教学医院分离金葡菌的60-80％。 20世纪90年代后期又出现了耐万古的MRSA。目前MRSA是超级细菌的重要组成部分，其 耐药性强、死亡率高已成为与HBV、AIDS并列世界范围内的3大难解决的感染性疾病。因 此探讨MRSA的来源及其耐药机制，寻找有效的控制方法，是遏制其感染流行的最有效途径。

消毒剂与抗生素同属于具有特殊抑杀微生物作用的化学物质，它们对微生物的作用机制 也有很多相同或相似之处，某些耐药的微生物同样可能产生对消毒剂的抗性现象。美国学者 提出抗生素和消毒剂促成MRSA的选择和维持性的可能性，实验证明金葡菌含有多种抗生素 和消毒剂的抗药性质粒，并发现他们之间存在着一定的联系。大量的流行病学数据也显示： 金黄色葡萄球菌的耐药菌株对消毒剂的抗性升高。围绕金黄色葡萄球菌家族qac基因和β— 内酰胺酶的结构基因研究显示，qac基因所在的质粒同时携带抗菌药物耐药基因，而葡萄球菌 β—内酰胺酶的结构基因blaz和两个紧密连接的基因blai和blaR的转座子Tn552和大质粒 如pST6也在同一质粒上。也有报道指出qac基因、β—内酰胺酶和latk基因同在多耐药质粒 pMs62上，后者还携带ermc,frA,acAaphD，产生对红霉素、甲氧嘧啶等抗生素耐药，这些为 金黄色葡萄球菌抗药性和消毒剂交叉耐药提供一些提示和参考。

发明内容

本发明提供了一种亚致死量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性测定方法，本发明方法具有 将细菌的抗药性、耐药性和敏感性恢复三者结合，特别是能很直观看到抗药性、耐药性之间 的变化规律及联系，具有准确、直接地揭示二者的内部联系的优点。

一种同时测定亚致死量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性的方法，包括如下步骤：

(1)制备含干扰剂的金黄色葡萄球菌的菌悬液；

(2)配制不同种类不同浓度的消毒剂对所述含干扰剂的金黄色葡萄球菌的菌悬液进行杀 菌试验并测定每一代亚致死量金黄色葡萄球菌的抗药性；同时测定所述每一代亚致死量金黄 色葡萄球菌对抗生素的耐药性；连续做20代；

(3)敏感性恢复实验：选取经消毒剂亚致死量筛选的第20代金黄色葡萄球菌作为原代 菌，接种到血液增菌肉汤管中培养并制备成血液增菌肉汤菌悬液，将所述血液增菌肉汤菌悬 液进行药物敏感试验；重复上述步骤至第40代。

(4)根据所述步骤(2)、(3)和(4)的测定结果，找出所述亚致死量金黄色葡萄球菌 对所述消毒剂的抗药性及其对所述抗生素的耐药性的变化规律及联系。

本发明所述同时测定亚致死量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性的方法，其中，所述步骤 (1)具体包括如下步骤：

将所述金黄色葡萄球菌经过增菌培养和分离培养，经分离培养后将所述金黄色葡萄球菌 分成单个细菌，并使其独立分裂繁殖形成单独菌落；用接种针挑取所述分离培养得到的典型 菌落接种到营养琼脂斜面，在35-37℃条件下培养24h形成菌苔；用质量分数为3％磷酸盐缓 冲液洗下所述菌苔，经振荡均匀并经无菌脱脂棉过滤后得到滤液，用无菌水稀释所述滤液制 备成浓度为0.5麦氏标准的菌悬液；将所述菌悬液与干扰剂溶液做对倍稀释配成10ml的浓度 为7.5×10⁷cfu/ml含有干扰剂的菌悬液备用，所述干扰剂溶液时由成品血清白蛋白30g和蒸馏 水1000mL混匀后用0.45μm微孔滤膜过滤除菌制备而成，所述干扰剂溶液中牛血清蛋白的质 量分数为3％。

本发明所述同时测定亚致死量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性的方法，其中，所述步骤 (2)具体包括如下步骤：

各浓度碘伏的制备：取11个无菌试管分别编号A₁～A₁₁，用注射器把编号A₂～A₁₁的试管 各加入4毫升蒸馏水，取4毫升碘伏原液加入A₁号试管中，所述碘伏原液中有效碘的浓度为 5000mg/l；再取4毫升所述碘伏原液加入A₂号试管混匀得到A₂碘伏液，其有效碘的浓度为 2500mg/l；然后从A₂号试管取4毫升A₂碘伏液加到A₃号试管，其有效碘的浓度为1250mg/l； 一次操作至A₁₀号试管，依此类推A₄号试管有效碘的浓度为625mg/l；A₅号试管有效碘的浓 度为312.5mg/l；A₆号试管有效碘的浓度为156.25mg/l；A₇号试管有效碘的浓度为78.13mg/l； A₈号试管有效碘的浓度约为39.06mg/l；A₉号试管有效碘的浓度约为19.53mg/l；A₁₀号试管 有效碘的浓度为9.77mg/l；A₁₁号试管不加消毒液，只是4毫升蒸馏水作为阳性对照；

各浓度溶葡萄球菌酶的制备：取9个无菌试管分别编号a₁～a₉，用注射器把编号a₂～a₉的 试管各加入4毫升蒸馏水，取4毫升溶葡萄球菌酶原液加入a₁号试管中，所述葡萄球菌酶原 液中溶葡萄球菌酶的浓度为1000U/L；再取4毫升所述溶葡萄球菌酶原液加入a₂号试管混匀 得到a₂溶葡萄球菌酶溶液，其浓度为500U/L；然后取4毫升所述a₂溶葡萄球菌酶溶液加到 a₃号试管中得到a₃溶葡萄球菌酶溶液，其溶葡萄球菌酶的浓度为250U/L；依次操作至a₈号 试管，依此类推a₄号试管溶葡萄球菌酶的浓度为125U/L；a₅号试管溶葡萄球菌酶的浓度为 62.50U/L；a₆号试管溶葡萄球菌酶的浓度为31.25U/L；a₇号试管溶葡萄球菌酶浓度为15.63 U/L；a₈号试管溶葡萄球菌酶的浓度,为7.80U/L；a₉号试管只加入4毫升蒸馏水不含消毒液作 为阳性对照；

各浓度含氯消毒液的制备：取11个无菌试管并编号B₁～B₁₁，首先制备有效氯为5000.0mg/l 作为原液，用注射器把B₂～B₁₁的试管各加入4毫升蒸馏水，取4毫升浓度为5000.0mg/l有效 氯原液加入B₁号试管中，有效氯的浓度为5000mg/l；再取4毫升加入B₂号试管混匀得到B₂含氯消毒液，其有效氯的浓度为2500mg/l；然后取4毫升所述B₂含氯消毒液加到所述B₃号 试管混匀的到B₃含氯消毒液，其有效氯的浓度为1250mg/l；依次操作至B₁₀号试管，依此类 推B₄号试管中有效氯的浓度为625mg/l；B₅号试管中有效氯的浓度为312.5mg/l；B₆号试管 中有效氯的浓度为156.25mg/l；B₇号试管中有效氯的浓度为78.13mg/l；B₈号试管中有效氯 的浓度为39.06mg/l；B₉号试管中有效氯的浓度为19.53mg/l；B₁₀号试管中有效氯的浓度为 9.77mg/l；11号试管只加入4毫升蒸馏水，不含消毒液作为阳性对照；

以所述制备好的含干扰剂的金黄色葡萄球菌的菌悬液为原代，取样接种所需培养基斜面， 然后分别同所述配置好的各浓度碘伏、含氯消毒剂及溶葡萄球菌复合酶作用，所述碘伏的作 用时间为0.5min，所述含氯消毒剂的作用时间为5min，所述溶葡萄球菌复合酶的作用时间为 6min；然后立刻转入含有相应的中和剂的肉汤管中中和10分钟，中和后转种计数平皿，再从 各自的计数平皿上取亚致死量的金黄色葡萄球菌，重复上述步骤至20代，比较所述20代亚 致死量金黄色葡萄球菌的抗药性得到所述亚致死量金黄色葡萄球菌对消毒剂的抗药性变化；

在测定所述亚致死量金黄色葡萄球菌对消毒剂的抗药性变化的同时，采用K-B纸片试验 法，分别连续观察记录所述三种消毒液的亚致死量1-20代的金黄色葡萄细菌对抗生素药敏的 变化，所述抗生素为以下几种之一：青霉素、红霉素、万古霉素、庆大霉素、利福平、左氧 氟沙星、头孢西丁、SMZ-CO。

本发明所述同时测定亚致死量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性的方法，其中，所述步骤 (4)具体包括如下步骤：

选取经消毒剂亚致死量筛选的第20代金黄色葡萄球菌作为原代菌，用接种环蘸取典型的 菌落，接种到血液增菌肉汤管中培养24h为一代；用所述接种环蘸取培养好的血液增菌肉汤 菌悬液，接种到分离平皿中，置于35℃-37℃培养18-24h；用所述接种环蘸取所述分离平皿 中的典型菌落接种到营养琼脂斜面上，35℃-37℃培养18-24h得到菌苔；质量分数为3％的磷 酸盐缓冲液洗下菌苔，振荡均匀并经无菌脱脂棉过滤制备成所述血液增菌肉汤菌悬液；按照 所述步骤(3)进行药物敏感试验，记录每次药敏结果，连续重复传代从第20代到第40代。

本发明所述同时测定亚致死量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性的方法，其中，所述亚致 死量金黄色葡萄球菌对抗生素的耐药性的测定具体包括如下步骤：

分别用无菌棉签蘸取所述1-20代亚致死量的金黄色葡萄球菌的菌悬液，在试管内壁液面 上方旋转紧压，将多余的菌液挤去，然后在每个M-H培养基平板琼脂表面上均匀涂抹接种3 次，每次旋转平板60℃，以确保接种菌的均匀分布，最后沿着平板内缘涂抹一周，干燥5分 钟；然后在平板上贴放选取的直径5mm抗菌药物纸片，使其紧贴平板表面，每个平皿贴4 张，盖好平皿，置于35-37℃培养18-20h，用游标卡尺量取抑菌圈，记录每次药敏结果，结 果判定根据临床微生物标准化操作；连续做20代试验。

本发明所述同时测定亚致死量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性的方法，其中，所述增菌 肉汤管中含有血液增菌肉汤，其组分为：蛋白胨10.0g/L；牛肉浸出粉3.0g/L；氯化钠5.0g/L； 葡萄糖1.0g/L；枸橼酸钠3.0g/L；磷酸氢二钾2g g/L；对氨基苯甲酸0.05g/L；硫酸镁2.4g/L； 酚红0.024g/L；其余为蒸馏水；血液增菌肉汤pH值为7.4±0.1；经121℃灭菌15min和35℃ 24h无菌试验备用。

本发明所述同时测定亚致死量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性的方法，其中，所述步骤 (3)具体包括如下步骤：是采用K-B纸片试验法，连续观察记录所述三种消毒液的亚致死 量1-20代金黄色葡萄细菌的每一代对抗生素药敏的变化，所述抗生素为以下几种之一：青霉 素、红霉素、万古霉素、庆大霉素、利福平、左氧氟沙星、头孢西丁、SMZ-CO。

本发明方法中0.5麦氏比浊管配制方法为：0.48mol/L Bacl2(1.17％w/v BaCl_2·2H₂O)溶液 0.5ml；0.18mol/L H₂SO₄溶液99.5ml；将两液混合，分置管内密封，用前混匀；0.5麦氏标准： 含菌量1.5×10⁸cfu/ml

本发明所述亚致死量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性测定方法，执行本发明过程中应注 意问题如下：

各种培养基的排污染技术：实验所用的营养肉汤管、记数平皿、营养琼脂斜面，于实验 前2天置于孵育箱内经35-37℃培养48h，没有污染可以使用；

实验用菌悬液的排污染技术：从斜面培养基洗下的菌悬液先涂片革兰氏染色，观察是否 为金黄色葡萄球菌，排除实验用菌悬液的污染后，再做杀菌实验；

环境的排污染技术：即无菌操作技术的运用；

实验前把实验用品备齐：高压灭菌的隔离衣，使用一次性口罩和帽子、无菌手套；同时 把以下放入净化台内的物品先用75％酒精擦拭除尘：血液增菌肉汤管等各种培养基(预培养 的)、酒精灯、接种环、接种针、一次性注射器、无菌试管、无菌硬水、三种消毒液、小牛血 清等；

检查实验设备的完好性：35-37℃孵育箱等；

实验室大环境的准备：试验在生物安全实验室进行，每次实验前一天清洁房间各种表面 和地面，实验当天首先打开房间和超净台的紫外线消毒40分钟以上；

操作环境的准备：洗净双手，穿灭菌隔离衣，带一次性口罩、帽子、带无菌手套；试验 前用75％酒精消毒擦拭超净工作台面；

本发明中的杀菌和抗药敏试验均按照消毒技术规范操作。

与现有技术相比，本发明同时测定亚致死量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性的方法具有 如下有点：

本发明将细菌的抗药性、耐药性和药敏性恢复三个实验方法巧妙结合，能够准确、清楚 地测出三者之间的动态关系，测定结果可信度高，揭示出亚致死量消毒剂(相当于实际工作 中不规范使用消毒剂)，不仅选择出对消毒剂耐受性增加的细菌，并且选择出的细菌对抗生素 也产生耐药性，说明两者之间有交叉耐药现象，因此本实验为将来的加强消毒剂的使用管理 (要像使用抗菌药物一样，要规范使用消毒剂，减少细菌耐药性和抗性的产生，延缓消毒剂 和抗生素的寿命)提供理论指导。

具体实施方式

实施例1

一种同时测定亚致死量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性的方法，包括如下步骤：

(1)制备含干扰剂的金黄色葡萄球菌的菌悬液；

(2)配制不同种类不同浓度的消毒剂对所述含干扰剂的金黄色葡萄球菌的菌悬液进行杀 菌试验并测定每一代亚致死量金黄色葡萄球菌的抗药性；同时测定所述每一代亚致死量金黄 色葡萄球菌对抗生素的耐药性；连续做20代；

(3)敏感性恢复实验：选取经消毒剂亚致死量筛选的第20代金黄色葡萄球菌作为原代 菌，接种到血液增菌肉汤管中培养并制备成血液增菌肉汤菌悬液，将所述血液增菌肉汤菌悬 液进行药物敏感试验；重复上述步骤至第40代。

(4)根据所述步骤(2)、(3)和(4)的测定结果，找出所述亚致死量金黄色葡萄球菌 对所述消毒剂的抗药性及其对所述抗生素的耐药性的变化规律及联系。

实施例2

一种同时测定亚致死量金黄色葡萄球菌抗药性和耐药性的方法，包括如下步骤：

(1)将所述金黄色葡萄球菌经过增菌培养和分离培养，经分离培养后将所述金黄色葡萄 球菌分成单个细菌，并使其独立分裂繁殖形成单独菌落；用接种针挑取所述分离培养得到的 典型菌落接种到营养琼脂斜面，在35-37℃条件下培养24h形成菌苔；用质量分数为3％磷酸 盐缓冲液洗下所述菌苔，经振荡均匀并经无菌脱脂棉过滤后得到滤液，用无菌水稀释所述滤 液制备成浓度为0.5麦氏标准的菌悬液；将所述菌悬液与干扰剂溶液做对倍稀释配成10ml的 浓度为7.5×10⁷cfu/ml含有干扰剂的菌悬液备用，所述干扰剂溶液时由成品血清白蛋白30g 和蒸馏水1000mL混匀后用0.45μm微孔滤膜过滤除菌制备而成，所述干扰剂溶液中牛血清蛋 白的质量分数为3％；

(2)各浓度碘伏的制备：取11个无菌试管分别编号A₁～A₁₁，用注射器把编号A₂～A₁₁的试管各加入4毫升蒸馏水，取4毫升碘伏原液加入A₁号试管中，所述碘伏原液中有效碘的 浓度为5000mg/l；再取4毫升所述碘伏原液加入A₂号试管混匀得到A₂碘伏液，其有效碘的 浓度为2500mg/l；然后从A₂号试管取4毫升A₂碘伏液加到A₃号试管，其有效碘的浓度为 1250mg/l；一次操作至A₁₀号试管，依此类推A₄号试管有效碘的浓度为625mg/l；A₅号试管 有效碘的浓度为312.5mg/l；A₆号试管有效碘的浓度为156.25mg/l；A₇号试管有效碘的浓度为 78.13mg/l；A₈号试管有效碘的浓度约为39.06mg/l；A₉号试管有效碘的浓度约为19.53mg/l； A₁₀号试管有效碘的浓度为9.77mg/l；A₁₁号试管不加消毒液，只是4毫升蒸馏水作为阳性对 照；

各浓度溶葡萄球菌酶的制备：取9个无菌试管分别编号a₁～a₉，用注射器把编号a₂～a₉的 试管各加入4毫升蒸馏水，取4毫升溶葡萄球菌酶原液加入a₁号试管中，所述葡萄球菌酶原 液中溶葡萄球菌酶的浓度为1000U/L；再取4毫升所述溶葡萄球菌酶原液加入a₂号试管混匀 得到a₂溶葡萄球菌酶溶液，其浓度为500U/L；然后取4毫升所述a₂溶葡萄球菌酶溶液加到 a₃号试管中得到a₃溶葡萄球菌酶溶液，其溶葡萄球菌酶的浓度为250U/L；依次操作至a₈号 试管，依此类推a₄号试管溶葡萄球菌酶的浓度为125U/L；a₅号试管溶葡萄球菌酶的浓度为 62.50U/L；a₆号试管溶葡萄球菌酶的浓度为31.25U/L；a₇号试管溶葡萄球菌酶浓度为15.63 U/L；a₈号试管溶葡萄球菌酶的浓度,为7.80U/L；a₉号试管只加入4毫升蒸馏水不含消毒液作 为阳性对照；

各浓度含氯消毒液的制备：取11个无菌试管并编号B₁～B₁₁，首先制备有效氯为5000.0mg/l 作为原液，用注射器把B₂～B₁₁的试管各加入4毫升蒸馏水，取4毫升浓度为5000.0mg/l有效 氯原液加入B₁号试管中，有效氯的浓度为5000mg/l；再取4毫升加入B₂号试管混匀得到B₂含氯消毒液，其有效氯的浓度为2500mg/l；然后取4毫升所述B₂含氯消毒液加到所述B₃号 试管混匀的到B₃含氯消毒液，其有效氯的浓度为1250mg/l；依次操作至B₁₀号试管，依此类 推B₄号试管中有效氯的浓度为625mg/l；B₅号试管中有效氯的浓度为312.5mg/l；B₆号试管 中有效氯的浓度为156.25mg/l；B₇号试管中有效氯的浓度为78.13mg/l；B₈号试管中有效氯 的浓度为39.06mg/l；B₉号试管中有效氯的浓度为19.53mg/l；B₁₀号试管中有效氯的浓度为 9.77mg/l；11号试管只加入4毫升蒸馏水，不含消毒液作为阳性对照；

以所述制备好的含干扰剂的金黄色葡萄球菌的菌悬液为原代，取样接种所需培养基斜面， 然后分别同所述配置好的各浓度碘伏、含氯消毒剂及溶葡萄球菌复合酶作用，所述碘伏的作 用时间为0.5min，所述含氯消毒剂的作用时间为5min，所述溶葡萄球菌复合酶的作用时间为 6min；然后立刻转入含有相应的中和剂的肉汤管中中和10分钟，中和后转种计数平皿，再从 各自的计数平皿上取亚致死量的金黄色葡萄球菌，重复上述步骤至20代，比较所述20代亚 致死量金黄色葡萄球菌的抗药性得到所述亚致死量金黄色葡萄球菌对消毒剂的抗药性变化。

在测定所述亚致死量金黄色葡萄球菌对消毒剂的抗药性变化的同时，采用K-B纸片试验 法，分别连续观察记录所述三种消毒液的亚致死量1-20代的金黄色葡萄细菌对抗生素药敏的 变化，所述抗生素为以下几种之一：青霉素、红霉素、万古霉素、庆大霉素、利福平、左氧 氟沙星、头孢西丁、SMZ-CO；

分别用无菌棉签蘸取所述1-20代亚致死量的金黄色葡萄球菌的菌悬液，在试管内壁液面 上方旋转紧压，将多余的菌液挤去，然后在每个M-H培养基平板琼脂表面上均匀涂抹接种3 次，每次旋转平板60℃，以确保接种菌的均匀分布，最后沿着平板内缘涂抹一周，干燥5分 钟；然后在平板上贴放选取的直径5mm抗菌药物纸片，使其紧贴平板表面，每个平皿贴4 张，盖好平皿，置于35-37℃培养18-20h，用游标卡尺量取抑菌圈，记录每次药敏结果，结 果判定根据临床微生物标准化操作；连续做20代试验；

(3)敏感性恢复实验：选取经消毒剂亚致死量筛选的第20代金黄色葡萄球菌作为原代 菌，用接种环蘸取典型的菌落，接种到血液增菌肉汤管中培养24h为一代；用所述接种环蘸 取培养好的血液增菌肉汤菌悬液，接种到分离平皿中，置于35℃-37℃培养18-24h；用所述 接种环蘸取所述分离平皿中的典型菌落接种到营养琼脂斜面上，35℃-37℃培养18-24h得到 菌苔；质量分数为3％的磷酸盐缓冲液洗下菌苔，振荡均匀并经无菌脱脂棉过滤制备成所述血 液增菌肉汤菌悬液；按照所述步骤(3)进行药物敏感试验，记录每次药敏结果，连续重复传 代从第20代到第40代；

所述增菌肉汤管中含有血液增菌肉汤，其组分为：蛋白胨10.0g/L；牛肉浸出粉3.0g/L； 氯化钠5.0g/L；葡萄糖1.0g/L；枸橼酸钠3.0g/L；磷酸氢二钾2g g/L；对氨基苯甲酸0.05g/L； 硫酸镁2.4g/L；酚红0.024g/L；其余为蒸馏水；血液增菌肉汤pH值为7.4±0.1；经121℃灭 菌15min和35℃24h无菌试验备用。

(4)根据所述步骤(2)、(3)和(4)的测定结果，找出所述亚致死量金黄色葡萄球菌 对所述消毒剂的抗药性及其对所述抗生素的耐药性的变化规律及联系。

本实施例测得的结果如下：

消毒剂对不同传代细菌杀灭效果变化：

经对原代至20代金黄色葡萄球菌杀灭效果观察显示，有效碘浓度在39.06mg/L～ 9.77mg/L范围内，均作用0.5min；有效氯在19.53mg/L～9.77mg/L范围内，均作用5min；对 不同传代数的金黄色葡萄球菌杀灭率虽有波动，但没有降低趋势，具体结果见表1。

表1两种化学消毒剂对不同传代数金黄色葡萄球菌杀灭效果

溶葡萄球菌酶浓度在1000U/L～7.8U/L范围内，均作用6min，对传代20次的金黄色葡 萄球菌杀灭率虽有波动，但没有下降趋势，结果提示，金黄色葡萄球菌标准株经20代培养， 其对所试验的三种消毒剂的抗力未发生变化，具体结果见表2。

表2溶葡萄球菌酶对不同传代数金黄色葡萄球菌杀灭效果

三种消毒剂诱导金黄色葡萄球菌药敏试验和敏感性恢复实验结果

三种消毒剂传代20代的结果表明经碘伏作用传代10次的金黄色葡萄球菌对青霉素和红 霉素出现耐药，并且用血液营养传代20次，敏感性没有恢复；另两种消毒剂作用后的菌株则 对青霉素、红霉素和万古霉素3种抗菌药物抗力基本无规律性变化，具体数据见表3。

表3消毒剂诱导金黄色葡萄球菌药敏试验结果

备注：单数纵行是1-20代杀菌实验药敏结果，双数纵行为21-40代血液增菌培养的药敏结果

抗性菌株对消毒液敏感性恢复试验结果

结果表明，经消毒剂诱导培养20代的金黄色葡萄球菌，再经血培养基培养20代，其对 消毒剂的敏感性没有恢复或改变的迹象见表4和表5；但低浓度溶菌酶诱导培养20代的菌株， 在血培养基上继续传代20次后，抗力反而增强的趋势，见表6。

表4抗性菌株对碘伏消毒剂敏感性恢复情况

注：A40代为经碘伏诱导的金葡菌再血培养传20代

表5抗性菌株对含氯消毒剂敏感性恢复情况

注：B40代为经含氯消毒剂诱导的金葡菌再血培养传20代

表6抗性菌株对溶葡萄球菌酶敏感性恢复情况

注：a40代为经溶菌酶诱导的金葡菌再血培养传20代

2.4金黄色葡萄球菌不同株药敏试验结果

试验表明，经上述消毒剂诱导培养的金黄色葡萄球菌和MRSA菌株最多传代培养45次， 其对不同抗菌药物的敏感性均没有恢复的现象，具体数据见表7。

表7不同株金黄色葡萄球菌药敏试验结果

注：表内A、B、a分别代表经碘伏、含氯消毒剂和溶菌酶诱导金黄色葡萄球菌

由以上结果可以得出如下结论：

消毒剂的浓度是杀菌作用的决定性因素之一，研究发现，本试验所用的三种消毒剂在较 低浓度下对包括多重耐药菌在内的所有实验菌都有很好的杀灭作用，但在很低(亚致死)浓 度的消毒液中会有试验菌存活。在实际工作中，亚致死量消毒剂的残留可以随处存在，如皮 肤消毒后或各种手消毒后的皮肤上以及消毒后的物体表面等。

本研究发现，亚致死量消毒液可以诱导出既有一定抗性又有耐药性的菌株，其对消毒剂 抗性与对抗菌药物的耐药性具有一定的联系。试验证明，抗性菌株既使在强化营养培养基上 传代30代，其敏感性也没有恢复的迹象。Zhang等报道，临床护士鼻腔金黄色葡萄球菌携带 率为20.5％，MRSA定值率为3.21％，护士鼻腔分离菌群qacA/B基因的检出率高达41.2％。由 于护士有更多的接触重病患者和被污染的医院环境的机会，并且医院消毒剂的选择压力导致 抗消毒剂菌株的形成和传播，可以通过持续低水平消毒剂残留区域构成医院感染的风险「8」。 因此，对参与移植等高风险手术、接触大面积烧伤或需要保护性隔离的患者时，医护人员应 减少耐药菌定植或主动清除和杀灭人体携带的耐药菌株。

本研究中发现，常在实验培养平板生长出粗糙和油煎蛋色菌落，也有研究从医院内镜清 洗机上培养出类似的菌落，提示试验菌在培养过程中会随营养状态不同而发生改变。消毒剂 耐药影响因素之一是微生物营养状态，营养限制影响因素只有与卤素抗性有关，是由特殊蛋 白介导的，cAMP能促进其抗性产生。这个理论合理解释了本研究杀菌试验诱导的抗性菌株转 种血液增菌培养管2-3代后对万古霉素的敏感性有所恢复，但有待于进一步证实。

有报道长时间频繁的接触碘伏，微生物对碘伏的抗性有不同程度的增加，产生耐受以及 MRSA对抗生素的耐受性可能与其对碘伏的抗性有内在的联系。本研究也发现多重耐药菌对含 氯消毒剂抗性没有增加，对碘伏的抗性有所增加。溶葡萄球菌酶在亚致死量条件下没有像碘 伏一样诱导出耐药菌株，并且前3个浓度也能100.0％杀灭MRSA。

研究进一步揭示，消毒剂与抗菌药物之间存在着交叉抗性，细菌在长时间脱离接触某消 毒剂后，对该消毒剂的抗性不会立刻消失。亚致死量的消毒剂的持续作用可能增加消毒液耐 药菌株的选择作用，使其在医院环境中获得生长优势，反之亦然抗生素的大量使用也有可能 对消毒剂抗性菌株产生选择。因此建议，要限制消毒剂的使用范围，杜绝滥用；对低效消毒 剂最好交替使用；对亚致死量消毒液细菌产生抗性和耐性以及多重耐药菌在血液增菌肉汤中 敏感性恢复等现象，希望能够得到更进一步的研究。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行 限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的 各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。