一种脂质体介导转化双孢蘑菇菌褶的方法

摘要

本发明涉及一种脂质体介导转化双孢蘑菇菌褶的方法，具体为：1）采摘菌褶未破的幼嫩蘑菇子实体，清洁表面后，收集菌褶组织并切成块；2）将脂质体和质粒混匀，于-5－5℃放置15－60min；3）将步骤2）产物用无菌超纯水稀释1000倍，与菌褶组织块混匀，室温放置80－120min；4）将步骤3）所得产物加入到RCM固体培养基中，室温培养8－12d；5）将萌发的双孢蘑菇菌褶组织块转移到含潮霉素的PDA平板上，室温培养10－20d；6）切下新生长的菌丝块移植到PDA斜面培养，传代培养2－5次，再转接到含潮霉素的PDA平板上，能够正常生长的即为转化子。该方法具有操作简便、转化率高、转化子稳定等优点。

说明书

技术领域

本发明属于脂质体转化技术领域，具体涉及一种脂质体介导转化双孢蘑菇菌褶的方法。

背景技术

双孢蘑菇（Agaricus bisporus）又称白蘑菇、蘑菇、洋蘑菇，是世界上栽培最广泛、生产量和消费量最大的食用菌，产量约占世界食用菌总产量的3/4。然而，双孢蘑菇的遗传转化一直缺乏简便有效的方法。双孢蘑菇遗传转化方法先后报道的有原生质体电转化法、原生质体PEG介导转化法、基因枪法轰击双孢蘑菇的菌丝体和子实体、及农杆菌介导的菌褶转化法，把外源基因转入双孢蘑菇菌株中。这些方法普遍存在操作繁琐、装置复杂、转化率低、转化子不稳定等缺点。有些方法需要制备原生质体，制备过程复杂，如原生质体电转化法和PEG介导的原生质体转化法。有些方法不需要制备原生质体，但装置复杂、转化成本高，如基因枪转化法。有些方法的转化率不稳定，转化率受多种因素的影响，如农杆菌转化法转化率受农杆菌菌株类型、质粒载体类型及两者间的匹配情况、培养基成分及诱导条件等多种因素的影响。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术不足，提供一种脂质体介导转化双孢蘑菇菌褶的方法，该方法操作简便快捷、转化率高、转化子遗传稳定，不需要复杂装置。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种脂质体介导转化双孢蘑菇菌褶的方法，其包括以下步骤：

1）采摘菌褶未破的幼嫩双孢蘑菇子实体，清洁表面后，收集菌褶组织并切成块，获得菌褶组织块；

2）将脂质体Lipofectamine ^TM 2000和质粒pBHg-dsACO混匀，于-5－5℃放置15－60 min；

3）将步骤2）产物用无菌超纯水稀释1000倍，然后与步骤1）菌褶组织块混匀，室温（25±5℃）放置80－120 min；

4）将步骤3）所得产物加入到RCM固体培养基中，20－30℃培养8－12d；

5）将萌发的双孢蘑菇菌褶组织块转移到含潮霉素的PDA平板上，20－30℃培养10－20d；

6）切下新生长的菌丝块移植到PDA斜面进行培养，如此传代培养2－5次，再转接到含潮霉素的PDA平板上，能够正常生长的即为转化子。可将转化子接种到常规PDA斜面进行培养和保存。

具体的，所述步骤2）中将1 μL脂质体Lipofectamine ^TM 2000和2－3 μg质粒pBHg-dsACO混匀。

所述步骤4）中的RCM固体培养基组成为：胰蛋白胨2.0 g，酵母提取物2.0 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，K₂HPO₄ 0.46 g，KH₂PO₄ 1 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，甘露醇109.3 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0。

所述步骤5）和6）中的PDA平板含潮霉素浓度为20－100 μg/mL。

和现有技术相比，本发明所述的双孢蘑菇脂质体介导转化菌褶方法具有操作简便、快捷，转化率高，转化子遗传稳定，且不需要制备原生质体，不需要复杂装置等优点。

附图说明

图1为质粒pBHg-dsACO的物理图谱；

图2为双孢蘑菇的转化子；CK：AS2796出发菌株；箭头处为在复筛抗性板上长出的转化子；

图3为转化子的 PCR验证；A为hph 基因PCR结果；B为ACO基因PCR结果；图中，M：DNA Marker；WT：出发菌株 AS2796；p：质粒pBHg-dsACO；1-5，转化子；

图4为转化子ACO基因的半定量PCR分析；WT：出发菌株AS2796；1-5：转化子；**，与WT相比差异达到显著水平（p<0.01）；

图5为转化子ACO酶活力测定结果；WT：出发菌株AS2796；1-5：转化子；WT：*，与WT相比差异达到显著水平（p<0.05）；

图6为转化子乙烯合成量测定结果；WT：出发菌株AS2796；1-5：转化子；WT：*，与WT相比差异达到显著水平（p<0.05）。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不局限于此。

实施例1

1 实验材料

1.1 菌株

双孢蘑菇CGMCC NO.0214，来自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1.2 质粒

质粒pBHg，购自美国 Sylvan 公司。质粒pBHg-dsACO由pBHg改造而成，含有潮霉素抗性基因（hph）表达框和双孢蘑菇1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）氧化酶基因（ACO）部分序列双链RNA（ds RNA）的表达框，其物理图谱见图1，其中S-ACO的序列为：GAACCCACCCAGAACCTCTTAGGCCGTTCCTATCTGAAATCGACGATTTCTCGGATCAAATCCACTCTGATATAATTAACACAATTCTTCGCCTCATCGCAATGAGCTTGGAGCTAGATGAAGATTACTTCATCCAAATGCATGATCGTTCTGCGAACGCAGAAACATTCCTCCGGTTTGTGAATTATTTCCCTCATCCAGAAGAAGAAGAGAATAAATCCGGCGGAGTCTGGTTGAAAGGACATACTG，R-ACO的序列为：ACCTAGCAGCCGAACATCATCGGGGGACAGTCCTTAAGTTAACGGAGAGGTTATAACTGTTCTTGAGGTAAGAGTTGCACGAACTGGGTGAAGGTAACGGGTAGAAATCAGTAATAGACCTCCCTACGATGACCGACCGACTTATCGTTGCAATCGCAGTATTTCAGTCATACAGGAAAGTTGGTCTGAGGCGGCCTAAATAAGAGAAGAAGAAGACCTACTCCCTTTATTAAGTGTTTGGCCTCCTTACAAAGACGCAAGCGTCTTGCTAGTACGTAAACCTACTTCATTAGAAGTAGATCGAGGTTCGAGTAACGCTACTCCGCTTCTTAACACAATTAATATAGTCTCACCTAAACTAGGCTCTTTAGCAGCTAAAGTCTATCCTTGCCGGATTCTCCAAGACCCACCCAAG。具体改造方法为本领域常规技术，可参见文献（Smith, N. A., Singh, S. P., Wang, M. B., Stoutjesdijk, P. A., Green, A. G., & Waterhouse, P. M. (2000). Gene expression: Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs. Nature, 407(6802), 319-320）。其中，优选按下述方法构建质粒pBHg-dsACO：

质粒pBHg-dsACO由双孢蘑菇ACO基因CDS部分序列双链RNA（dsRNA）的表达框插入质粒 pBHg的多克隆位点处构建而成。双孢蘑菇ACO基因CDS部分序列dsRNA表达框由四个DNA片段经酶切酶连得到，四个DNA片段分别是双孢蘑菇3-磷酸甘油脱氢酶基因gpd启动子、双孢蘑菇ACO基因CDS部分正向序列S-ACO、双孢蘑菇ACO基因CDS部分反向序列R-ACO和CaMV35S基因的终止序列T35S。S-ACO和R-ACO二者有248 bp的重复序列。gpd启动子的PCR扩增使用的引物是GPD-U、GPD-D（表1），模板是质粒pBHg，PCR扩增条件：94℃预变性5 min，94℃ 40 s、55℃ 1 min、72℃ 1 min共30个循环，72℃延伸10 min。扩增S-ACO和R-ACO使用的引物是S-ACO-U、S-ACO-D和R-ACO-U、R-ACO-D，依据双孢蘑菇AS2796 ACO基因cDNA序列（GeneBank登录号JQ314344.1）设计，模板是双孢蘑菇AS2796的总RNA经采用MMLV Reverse Transcriptase 1st-Strand cDNA Synthesis Kit合成的cDNA。PCR扩增条件：94℃预变性5 min，94℃ 40 s、56℃ 1 min、72℃ 1 min共30个循环，72℃延伸10 min。T35S扩增使用的引物是T35S-U、T35S-D（表1），模板是质粒pBHg，PCR扩增条件：94℃预变性5 min，94℃ 40 s、55℃ 1 min、72℃ 1 min共30个循环，72℃延伸10 min。

 用KpnI 单酶切gpd启动子和R-ACO片段，用 ApaLI单酶切T35S和S-ACO片段，纯化回收后用T4连接酶分别连接gpd启动子和R-ACO片段及T35S和S-ACO片段。以酶连产物为模板，用GPD-U、R-ACO-D为引物，PCR扩增gpd启动子+R-ACO片段，用T35S-D和S-ACO-D为引物，PCR扩增S-ACO+T35S片段，PCR扩增条件均是：94℃预变性5 min，94℃ 40 s、55℃ 1 min、72℃ 1 min共30个循环，72℃延伸10 min。PCR产物纯化回收，分别将gpd启动子+R-ACO片段和S-ACO+T35S片段与pMD19-T simple 载体相连，转入E. coli JM109，培养后提取得到二个重组质粒。二个重组质粒用SalI/ NcoI分别双酶切，纯化回收含gpd启动子+R-ACO片段的质粒酶切后的大片段、含S-ACO+T35S的质粒酶切后的小片段，并用T4连接酶连接，得到克隆载体pMD19-dsACO。将pMD19-dsACO转入E. coli JM109，培养增殖后提取克隆载体pMD19-dsACO。用SalI/BamHI 双酶切质粒pBHg和pMD19-dsACO，分别回收大片段和小片段，用T4连接酶将大、小片段进行酶连，得到表达质粒pBHg-dsACO（图1），转化入E. coli HA105中，经增殖培养后提取质粒pBHg-dsACO，用于转化双孢蘑菇菌褶。

1.3 培养基

PDA固体培养基：马铃薯200 g（去皮切块加水煮沸20 min用四层纱布过滤取滤液），琼脂20 g，葡萄糖 20 g，蒸馏水1000 mL。

PD液体培养基：马铃薯200 g（去皮切块加水煮沸20 min用四层纱布过滤取滤液），葡萄糖 20 g，蒸馏水1000 mL。

RCM固体培养基：胰蛋白胨2.0 g，酵母提取物2.0 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，K₂HPO₄ 0.46 g，KH₂PO₄ 1 g，葡萄糖 20 g，琼脂 20 g，甘露醇109.3 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0。

1.4 脂质体

脂质体Lipofectamine ^TM 2000购自invitorgen公司。

2.1 实验方法

一种脂质体介导转化双孢蘑菇菌褶的方法，其包括以下步骤：

1）采摘菌褶未破的幼嫩蘑菇子实体，清洁表面后，收集菌褶组织并切成细块，获得菌褶组织细块，把菌褶组织细块加入到50 mL无菌的离心管中；

2）将1 μL脂质体Lipofectamine ^TM 2000和2.5 μg质粒pBHg-dsACO混匀，0℃放置30 min；

3）将步骤2）产物用无菌超纯水稀释1000倍，然后转入到装有菌褶组织细块的离心管中（以淹没菌褶组织细块为宜），混匀，25℃放置100 min；

4）将步骤3）所得产物加入到RCM固体培养基中，倒平板，25℃倒置培养10d；

5）将萌发的双孢蘑菇菌褶组织块转移到含30 μg/mL潮霉素的PDA平板上，25℃培养2周；

6）切下新生长的菌丝块移植到常规PDA斜面进行培养，如此传代培养3次，再转接到含30 μg/mL潮霉素的PDA平板上，能够正常生长的即为转化子（见图2）。

2.2 转化子的PCR鉴定

选取长势良好的5个转化子，转接到PDA液体培养基中，摇瓶培养。收集菌丝，采用CTAB法提取转化子菌丝的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，用hph基因和ACO基因的CDS的特异性引物进行PCR扩增验证。

hph基因扩增引物是hph-F（5′-CTATTCCTTTGCCCTCGG-3′）和hph-R（5′-ATGAAAAAGCCTGAA CTCACC-3′）。扩增条件：94℃预变性5 min，94℃ 40 s、50℃ 1 min、72℃ 1 min共30个循环，72℃延伸10 min。

ACO基因的CDS扩增引物是T4-F（5′-GAACCCACCCAGAACCTC-3′）和T4-R（5′-ATGTTCGGCTGTTAGGTA-3′）。扩增条件：94℃预变性5 min，94℃45 s、52℃ 1 min、72℃ 30 s共30个循环，72℃延伸10 min。

分别取5 μl PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明（见图3）：均能扩增出hph基因（产物大小为750 bp）和ACO基因产物（产物大小为416 bp）。

2.3 转化子ACO基因表达量的半定量PCR分析

随机选取5个转化子，采用Trizol法提取转化子菌丝的总RNA。利用宝生物工程(大连)有限公司提供的AMV Reverse Transcriptase试剂盒进行反转录，合成cDNA第一链。

ACO基因扩增用引物是T4-F（5′-GAACCCACCCAGAACCTC-3′）和T4-R（5′-ATGTTCGGCTGTTAGGTA-3′）。内参基因GAPDH扩增引物是GAPDH-F（5′-TCACGCCACCACCGCTACTCAA-3′）和GAPDH-R（5′-CGGGCTTCTCAAGACGAACAACAA-3′），扩增产物大小分别为416 bp和200 bp。扩增条件均为：94℃预变性5 min，94℃ 30 s、52℃ 30 S、72℃ 45 S共26个循环，72℃延伸10 min。

取5 μl PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像系统照相并用Gel Base／Gel Blot Support软件分析各电泳条带的灰度值。结果表明（见图4）：5个转化子的ACO基因表达水平显著降低，比出发菌株降低47－74%。

2.4 转化子ACO氧化酶酶活性测定

将随机选取的5个转化子，转接到PD液体培养基中，摇瓶培养20 d。离心收集菌丝球，取1g新鲜的双孢蘑菇菌丝球样品放入20 mL试管中，再加入3 mL Mops缓冲液（100 mmol /L，pH7.2），混匀；每个转化子做6个重复。向作为空白对照的试管中加50 μL无菌水。其余试管中则加入50 μL 含50mmol/L ACC（1-氨基环丙烷-1-羧酸）的水溶液，并立即用橡皮塞密封，并用注射器加入CO₂使试管中的CO₂体积约达到5%。然后将试管置于26℃水浴中反应30 min。用气密针抽取1 mL试管内的气体样品，用气相色谱仪测定乙烯生成量，从而计算出ACC氧化酶活性。以在26℃条件下1h每毫克蛋白产生乙烯的纳摩数表示为1个酶活力单位（U）。

结果表明（见图5）：与出发菌株相比，5个转化子的ACO酶活力显著降低，酶活力降低68－86%。

2.5 转化子乙烯合成量测定

将双孢蘑菇的出发菌株与转化子分别接种到PD液体培养基中，于25℃、160 r/min 条件下进行培养，每种处理做6个重复。培养20 d时，打开封口膜在无菌条件下吹4 h（用以除去乙烯），密封培养8 h后，利用气相色谱法测定各样品中乙烯含量，进样量为1 mL。气相色谱条件：Agilent 7890型气相色谱仪；色谱柱：HP-2 55%（毛细管柱）Phenyl Met hyl Siloxane Capillary 3010 m×320 μm×0.125 μm nominal，FID检测器，柱温100℃；氢离子火焰检测器（FID），检测器温150℃；载气N₂流速50 mL/min，燃气H₂流速50 mL/min，空气流速400 mL/min，保留时间为3.0 min。用进样针进1 mL乙烯样品在色谱仪上测定，气样的进样流速为115 mL/min，重复测定 6 次。

结果表明（见图6）：与出发菌株相比，5个转化子的乙烯产量显著降低，乙烯产量降低27－48%。

2.6 共培养时间对菌褶萌发率的影响

1）采摘菌褶未破的幼嫩蘑菇子实体，清洁表面后，收集菌褶组织并切成细块，获得菌褶组织细块，把菌褶组织细块加入到50 mL无菌的离心管中；

2）将1 μL脂质体Lipofectamine ^TM 2000和2.5 μg质粒pBHg-dsACO混匀，0℃放置30 min；

3）将步骤2）产物用无菌超纯水稀释1000倍，然后转入到装有菌褶组织细块的离心管中（以淹没菌褶组织细块为宜），混匀，25℃放置20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min，共六个时间梯度用作对比；

4）将步骤3）所得产物加入到RCM固体培养基中，倒平板，25℃倒置培养一周，计算菌褶块的萌发数。

萌发率=菌褶块的萌发数/参与转化的菌褶块总数。结果见表2。随着共培养时间的增加，双孢蘑菇菌褶组织的萌发率不断升高。当共培养时间达到100 min后再延长共培养时间，萌发率升高较少，综合考虑共培养时间与萌发率的比例，确定共培养时间以100 min为最佳。

结论

    由上述结果可以看出，本发明所述双孢蘑菇脂质体介导转化菌褶方法具有操作简便、转化率高、转化子稳定等优点。