脂质体介导的遗传转化体系的构建及漆酶在金针菇生长发育过程中的研究

摘要

金针菇（Flammulina velutipes）在东南亚乃至全世界范围内都是一种极其重要的食药用真菌。它以其独特的口感和良好的营养、药用价值在东亚尤其是中日韩等国家赢得了众多消费者的喜爱。但由于金针菇中遗传转化体系的缺乏，限制了金针菇的生物学研究进展。
　　本研究首次将脂质体转化方法成功引入到金针菇中，获得了一个简单有效的金针菇遗传转化体系。在金针菇中，脂质体转化法的转化效率能够高达60-80个转化子/104个原生质体，而电击转化法的转化效率为10-20个转化子/104个原生质体，农杆菌转化法的转化效率仅为5-10个转化子/104个原生质体;脂质体介导的金针菇遗传转化体系5-6天就能观察到转化子，而电击转化方法要到10天时才能发现转化子，农杆菌转化方法则需要两周。相比较而言，脂质体转化方法所需培养时间更短，转化效率更高。
　　为了研究漆酶基因在金针菇生长发育中的作用，本研究使用建立的脂质体转化体系筛选得到漆酶基因的沉默菌株和过表达菌株。在金针菇中共比对到9条漆酶序列，应用RT-PCR检测金针菇中的漆酶基因表达量，结果表明:Lac1，Lac2，Lac3，Lac4的基因表达量较高，而Lac5，Lac6，Lac7，Lac8，Lac9的表达量相对比较低。通过比对这9条漆酶序列的相似性，发现Lac2，Lac3，Lac4之间两两相似性最高(Lac2和Lac3的相似度达到33.72％, Lac3和Lac4的相似度达到26.08％, Lac2和Lac4的相似度达到30.03％），且Lac2的基因表达量最高，据此针对Lac2挑选相似度高的片段设计沉默片段，构建了沉默载体，之后又构建了Lac2的过表达载体。然后通过脂质体转化的方法将构建好的栽体转入金针菇中，筛选得到对Lac2沉默效率达到百分之七十五，对Lac3和Lac4的沉默效率达到百分之五十左右的沉默转化子，以及过表达漆酶基因1.6倍左右的过表达Lac2转化子。为了进一步研究漆酶沉默和过表达转化子对表型的影响，我们检测了这些转化子的漆酶酶活、菌丝生长速度和生物量、吃料速度以及佥针菇原基情况。结果表明:沉默转化子的漆酶酶活、菌丝生物量低于野生型，吃料速度以及原基发生速度也比野生型慢;过表达转化子的漆酶酶活、菌丝生物量高于野生型，吃料速度以及原基萌发也比野生型快。综合这些结果表明:提高漆酶基因转录水平可以提高漆酶活性、菌丝生物量，加快菌丝的吃料速度和促进原基的萌发。
　　综上所述，本研究首次在金针菇中建立了高效的脂质体遗传转化体系，为后续金针菇功能基因的研究奠定了基础;之后研究了漆酶基因在金针菇生长发育过程中的作用，将进一步揭示金针菇子实体形成过程中漆酶基因的作用，并为深入研究漆酶基因提供了理论基础。

目录

论文说明

声明

摘要

符号和缩略语说明

第一章 文献综述

第一节 金针菇的概述

1．1 金针菇的分类地位

1．2 金针菇的组成部分

1．3 金针菇营养价值

1．4 金针菇药用价值

第二节 脂质体介导的遗传转化研究进展

2．1 目前丝状真菌中主要的遗传转化方法

2．2 脂质体转化方法的简介

2．3 金针菇中遗传转化方法的研究

第三节 漆酶基因家族的简介

3．1 漆酶的命名和分类

3．2 漆酶的特性

3．3 漆酶基因家族与菌丝生长、子实体形成有关

第四节 本论文的研究内容及意义

4．1 研究意义

4．2 研究内容

第二章 脂质体介导的金针菇遗传转化体系的建立

1．1 菌株、质粒、试剂

1．2 菌株培养条件

2 实验方法

2．1 金针菇原生质体的制备

2．2 脂质体介导的金针菇转化体系

2．3 金针菇电击转化体系

2．4 农杆菌介导的金针菇转化体系

2．5 金针菇转化子的分子水平验证

2．6 GFP报告基因的检测

2．7 金针菇转化子有丝分裂稳定性验证

3 结果与分析

3．1 潮霉素抗性浓度筛选结果

3．2 脂质体转化结果

3．3 潮霉素扩增验证随机挑取的转化子

3．4 转化子绿色荧光的检测

3．5 金针菇脂质体转化子有丝分裂稳定性验证

3．6 金针菇三种转化方法转化效率的比较

3．7 金针菇三种转化方法转化子获得的时间比较

4 本章讨论

第三章 漆酶基因对金针菇生长发育的影响

1．1 实验菌株和试剂

1．2 菌株培养条件

2 实验方法

2．1 金针菇基因组DNA的提取(CTAB法)

2．2 金针菇总RNA的提取和cDNA的反转录

2．3 Lac2i沉默载体的构建

2．4 Lac2过表达载体的构建

2．5 Lac2基因沉默载体和过表达载体的脂质体转化

2．6 转化子的筛选及PCR验证

2．7 转化子中Lac2基因mRNA水平表达量的影响

2．8 漆酶活性测定

2．9 纤维素酶活性检测

2．10 漆酶基因Lac2转化子在生长方面的变化

2．11 漆酶基因Lac2沉默和过表达转化子的吃料实验

2．12 漆酶基因Lac2沉默和过表达转化子出原基情况

3 结果与分析

3．1 金针菇中的漆酶序列

3．2 金针菇不同漆酶在发酵过程中转录水平差异分析

3．3 金针菇中漆酶序列相似性比较

3．4 金针菇漆酶沉默和过表达载体构建过程中部分电泳图

3．5 漆酶基因Lac2转化子的分子水平验证

3．6 漆酶基因Lac2、Lac3、Lac4在转化子中转录水平的变化

3．7 漆酶基因Lac2的沉默转化子和过表达转化子中漆酶活性的变化

3．8 漆酶基因的沉默转化子和过表达转化子中纤维素酶活性的变化

3．9 漆酶基因Lac2沉默转化子和过表达转化子在平板上的生长情况

3．10 漆酶基因Lac2沉默转化子和过表达转化子生物量的变化

3．11 漆酶基因Lac2沉默转化子和过表达转化子吃料实验

3．12 漆酶基因Lac2沉默转化子和过表达转化子原基发生实验

4 本章讨论

全文总结

参考文献

附录

致谢