阴离子表面活性剂耐受性提高的枝孢霉脂肪酶变体

摘要

本发明提供了一种脂肪酶，该脂肪酶具有良好的阴离子表面活性剂耐受性，可作为洗涤剂的酶制剂使用，具有良好的工业应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体说涉及阴离子表面活性剂耐受性提高的枝孢霉脂肪酶变体。

背景技术

脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)是一类特殊的酯键水解酶，广泛存在于动植物和微生物体中。脂肪酶可以催化酯类化合物的水解、醇解、酯化、酯交换以及化合物的合成等反应。其可应用于食品、医药、洗涤剂、纺织、生物柴油、造纸、皮革、化妆品和环境保护等多个工业领域（Hasan F,Ali SA,Hameed A.Industrial applications ofmicrobial lipases.Enzyme Microb.Technol.2006,39:235-251.）。洗涤剂主要应用于餐具和衣物的清洗、漂白、干洗，皮革清洁，隐形眼睛清洗，化妆品和食品加工等工业废物的清理，排气管和抽水马桶有机废物的降解等（Enzymes used in detergents:Lipases）。在低温、弱碱性洗涤环境下，油性污垢难以去除，在洗衣剂和餐具洗涤剂中配入分解油脂的脂肪酶，能得到比较好的去污效果（脂肪酶在洗涤剂中的应用，坂口博修，日用化学工业译丛，1990年第2期，11-14）。

目前商品化的脂肪酶有：诺维信公司的脂肪酶Lipolase，杰能科公司的Lumafast，以及吉斯特-布罗卡德斯公司的Lipomax。三种商品化脂肪酶虽然在洗涤工业上应用较广，但在阴离子和非离子表面活性剂中的耐受性较差。而表面活性剂是洗涤剂中不可缺少的成分，对洗涤过程中污垢的去除起着至关重要的作用，其中阴离子表面活性剂是洗涤剂中的主要成分，因此，现有的这三种商品化脂肪酶在洗涤工业上的应用受到较大限制。

因此，业界急需一种阴离子表面活性剂耐受性好的脂肪酶，以克服上述缺陷，提高脂肪酶在洗涤工业上的应用。

发明内容

本发明的发明人通过突变，获得了一种脂肪酶，该脂肪酶具有良好的阴离子表面活性剂耐受性，可作为洗涤剂的酶制剂使用，具有良好的工业应用前景。

因此，本发明的第一方面在于，提供一种具有脂肪酶活性的多肽。

本发明提供的具有脂肪酶活性的多肽包含突变的SEQ ID No:42所示的氨基酸序列或其活性片段，其中所述突变包括将SEQ ID No:42所示的氨基酸序列的第377位的赖氨酸突变为酸性氨基酸或其酰胺。

在本发明的一个实施方案中，将SEQ ID No:42所示的氨基酸序列的第377位的赖氨酸突变为谷氨酸（E）、天冬氨酸（D）、谷氨酰胺（Q）或天冬酰胺（N），优选突变为谷氨酸（E）或天冬氨酸（D）。

本发明的第二个方面在于，提供编码第一方面的多肽的核酸分子。

本发明的第三个方面在于，提供包含第二方面的核酸分子的载体。

在本发明的一个实施方案中，所述载体为表达载体。

在本发明的一个实施方案中，所述载体被设计用于真核细胞或原核细胞中表达。在本发明的一个实施方案中，所述载体进一步被设计用于细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞中表达。

本发明的第四个方面在于，提供包含本发明第二方面的核酸分子或第三方面的载体的细胞。

在本发明的一个实施方案中，所述细胞为真核细胞或原核细胞。在本发明的一个实施方案中，所述细胞为细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞。

本发明的第五个方面在于，提供使用本发明第四个方面的细胞产生的脂肪酶。

本发明的第六个方面在于，提供使用本发明第四个方面的细胞产生的脂肪酶酶液。

在本发明的一个实施方案中，所述脂肪酶酶液为所述细胞的发酵上清。

本发明的第七个方面在于，提供本发明的第一个方面的多肽、或第二个方面的核酸分子编码的多肽、或第三个方面的载体编码的多肽、或第四个方面的细胞表达出的多肽、或第五个方面的脂肪酶、或第六个方面的脂肪酶酶液用于洗涤工艺中的用途。

本发明的第八个方面在于，提供本发明的第一个方面的多肽、或第二个方面的核酸分子、或第三个方面的载体、或第四个方面的细胞在制备脂肪酶中的用途。

本发明的第九个方面在于，提供一种洗涤产品，所述洗涤产品包括本发明的第一个方面的多肽、或第二个方面的核酸分子、或第三个方面的载体、或第四个方面的细胞、或第五个方面的脂肪酶、或第六个方面的脂肪酶酶液。

附图说明

图1显示377位的不同突变的脂肪酶的SDS耐受性比较结果。

图2显示脂肪酶突变体496和脂肪酶wt的阳离子和非离子表面活性剂耐受性比较结果。

图3显示脂肪酶突变体496和脂肪酶wt的LAS耐受性比较结果。

图4显示脂肪酶突变体496和脂肪酶wt的AOS耐受性比较结果。

图5显示脂肪酶突变体496和脂肪酶wt的AES耐受性比较结果。

图6显示脂肪酶突变体496和脂肪酶wt的SDS耐受性比较结果。

本发明的枝孢霉（Cladosporium sp.）WBRD3.10062425已于2011年06月17日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）”(北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号是CGMCC No.4962，分类命名为：枝孢霉Cladosporium sp.。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

在本发明中，如果没有特别的说明，百分数（％）或者份都指相对于组合物的重量百分数或者重量份。

在本发明中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。

在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方式可以相互组合形成新的技术方案。

在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。

在本发明中，如果没有相反的说明，组合物中各组分的含量之和为100％。

在本发明中，如果没有相反的说明，组合物中各组分的份数之和可以为100重量份。

在本发明中，除非有其他说明，数值范围“a-b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0-5”表示本文中已经全部列出了“0-5”之间的全部实数，“0-5”只是这些数值组合的缩略表示。

在本发明中，除非有其他说明，整数数值范围“a-b”表示a到b之间的任意整数组合的缩略表示，其中a和b都是整数。例如整数数值范围“1-N”表示1、2……N，其中N是整数。

在本发明中，除非有其他说明，“其组合”表示所述各元件的多组分混合物，例如两种、三种、四种以及直到最大可能的多组分混合物。

如果没有特别指出，本说明书所用的术语“一种”指“至少一种”。

如果没有特别指出，本发明所述的百分数（包括重量百分数）的基准都是所述组合物的总重量。

本文所公开的“范围”以下限和上限的形式。可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的。选定的下限和上限限定了特别范围的边界。所有可以这种方式进行限定的范围是包含和可组合的，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，针对特定参数列出了60－120和80－110的范围，理解为60－110和80－120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如果列出了最大范围值3，4和5，则下面的范围可全部预料到：1－3、1－4、1－5、2－3、2－4、和2－5。

在本文中，除非另有说明，各组分的比例或者重量都指干重。

在本文中，除非另有说明，各反应都在常温常压下进行。

在本文中，除非另有说明，各个反应步骤可以顺序进行，也可以不按顺序进行。例如，各个反应步骤之间可以包含其他步骤，而且反应步骤之间也可以调换顺序。优选地，本文中的反应方法是顺序进行的。

在本发明的下述实施例中，脂肪酶酶活测定采用对硝基苯棕榈酸酯（p-NPP）法来测定，该方法以对硝基苯棕榈酸酯为反应底物，通过脂肪酶的催化产生有色产物对硝基苯酚（p-NP），该产物在405-410nm波长下具有强烈吸收。酶活力单位定义为：1个单位即指在标准实验条件下每分钟催化释放1μmol的p-NP所需的酶量。具体方法如下：

预先配置底物和缓冲液，底物：6mg/ml p-NPP（异丙醇溶解），缓冲液：0.05mol/lTris（pH8.0，0.1%阿拉伯胶）。将底物和缓冲液以1:9（v/v）配成反应混合液。取两个2ml离心管，分别为对照管和样品管。分别添加400ul反应混合液至两离心管，在35℃预温浴5min。向样品管中加入一定量的稀释酶液，混合均匀后，继续温浴15min。加入1.5ml乙醇至上述两离心管终止反应，并添加同样量的稀释酶液至对照管。12000rpm离心2min，取上清，测405nm处的吸光值。

根据标准曲线所得酶活计算公式为：A=-（[A1-A0]×0.7885-0.0118）×V1×n/（V2×t）。

其中，A：样品酶活（U/ml），A1：样品酶液的OD405，A0：对照酶液的OD405，V1：总反应液的体积（ml），n：酶液的稀释倍数，V2：酶液的体积（ml），t：反应时间（min）。

在本发明的下述实施例中，使用的培养基为：

LB液体培养基：1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%氯化钠，调整pH至7.0。

PDA液体培养基：20%马铃薯（切成小块，加水煮烂，用八层纱布过滤，收集液体），2%葡萄糖，自然pH。

YPD液体培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，1%葡萄糖，自然pH。

生长培养基BMGY：1%酵母提取物，2%蛋白胨，100mM磷酸钾（pH6.0），1.34%酵母基础氮源，4×10^-5%生物素，1%甘油。

诱导培养基BMMY：1%酵母提取物，2%蛋白胨，100mM磷酸钾（pH6.0），1.34%酵母基础氮源，4×10^-5%生物素，0.5%甲醇。

脂肪酶鉴定培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，100mM磷酸钾（pH6.0），1.34%酵母基础氮源，4×10^-5%生物素，0.5%甲醇，0.001%罗丹明B，4%聚乙烯醇，2%橄榄油，2%琼脂。

在本发明的下述实施例中，使用的枝孢霉（Cladosporium sp.）WBRD3.10062425已于2011年06月17日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）”(北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号是CGMCC No.4962，分类命名为：枝孢霉Cladosporium sp.。

实施例1、377位饱和突变

1.1、枝孢霉基因组提取

将枝孢霉WBRD3.10062425接种PDA液体培养基，28℃、200rpm条件下培养2天，通过布氏漏斗抽滤法收集枝孢霉菌体，于液氮中速冻。

取冷冻后的菌体，根据厂商提供的方法，使用宝公司MiniBEST UniversalGenomic DNA Extraction Kit试剂盒抽提基因组，获得枝孢霉基因组。

将提取获得的枝孢霉基因组进行琼脂糖电泳，通过与DNA标准样品（购自上海皓嘉科技发展有限公司）的带型和亮度比较，验证基因组质量和浓度。

结果显示，提取获得的基因组完整度良好，浓度达到50ng/μl。

1.2野生型脂肪酶重组毕赤酵母的构建

以实施例1.1制备的枝孢霉基因组为模板，以lipcs-U和lipcs-D为引物对，进行PCR扩增，以克隆脂肪酶基因，其中lipcs-U和lipcs-D序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

PCR反应体系为：rTaq（购自Takara公司）0.25μl，10×PCR缓冲液5μl，dNTP混合物（购自Takara公司）4μl，lipcs-U1μl，lipcs-D1μl，基因组0.1μl，加水补齐至50μl。

PCR程序为：95℃30s，（95℃30s，51℃30s，72℃1min30s）28个循环，72℃7min。

将使用Omega胶回收试剂盒回收的PCR产物，使用Takara公司限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ酶切，并与经用相同酶处理的pPIC9k质粒连接，将获得的连接产物转化DH5α感受态细胞，于37℃过夜培养至转化子长出。挑取转化子接种到LB液体培养基中，于37℃、160rpm下培养14-16h，收集菌体。根据厂商提供的方法，用Axygen质粒小量提取试剂盒（购自上海百赛公司）抽提质粒，用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切实验，将酶切验证正确的阳性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，所述序列如SEQ ID NO.41所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.42所示。用限制性内切酶BglⅡ将质粒线性化，线性化产物用Axygen清洁试剂盒纯化，并通过电泳验证线性化质粒的浓度为300ng/μl。

参考Shixuan W.,Geoffrey J.L..High efficiency transformation by electroporationof Pichia pastoris pretreated with lithium acetate and dithiothreitol.Biotechniques,2004,36:152-154的方法，通过山梨醇清洗法准备毕赤酵母GS115感受态细胞。

取1μg线性化质粒，加入100μl GS115感受态细胞，转入电击杯，电击杯在冰上静置5分钟后，置于电转仪上电击，条件：电压2000v、时间5s。迅速加入1ml1mol/l山梨醇溶液，吸打均匀后，将菌液涂布RBD平板（1.34%酵母基础氮源，4×10^-5%生物素，2%葡萄糖，1mol/l山梨醇，1.5%琼脂）。于28℃培养数天，直至转化子长出。

挑取RBD平板上的转化子，接种至脂肪酶鉴定平板上，于28℃培养数天，直至出现颜色圈，获得具有脂肪酶活力的转化子，将该转化子命名为“wt”，该转化子株所表达脂肪酶命名为“Lipwt”。挑取单克隆，接种至YPD液体培养基，28℃、200rpm培养24h，将600μl菌液和400μl50%甘油（w/v%）混合制成甘油管，保存于-80℃。

1.3、377位赖氨酸突变为苯丙氨酸

以枝孢霉基因组为模板，以Lipcs-U、F-D（序列如SEQ ID NO.3所示）、F-U（序列如SEQ ID NO.4所示）、和Lipcs-D为引物，经PCR扩增，制备377位突变为苯丙氨酸的脂肪酶突变体，具体过程如下：

第一轮PCR，以枝孢霉基因组为模板，分别以Lipcs-U和F-D或F-U和Lipcs-D为引物对，进行PCR扩增，分别获得PCR产物，其中，PCR体系为：Primstar（购自Takara公司）0.25μl，5×缓冲液10μl，dNTP混合物4μl，lipcs-U1μl，F-D1μl（或者是F-U1μl，Lipcs-D1μl），基因组0.1μl，加水补齐至50μl。PCR程序为：95℃30s，（95℃30s，51℃30s，72℃1min）28个循环，72℃7min。

第二轮PCR，将第一轮PCR产物稀释10倍，等体积混合作为模板，以Lipcs-U/Lipcs-D作为引物对，进行PCR扩增，其中PCR体系为：Primstar（购自Takara公司）0.25μl，5×PCR缓冲液10μl，dNTP混合物4μl，lipcs-U1μl，lipcs-D1μl，模板0.5μl，加水补齐至50μl。PCR程序为：95℃30s，（95℃30s，51℃30s，72℃1min30s）28个循环，72℃7min。

将PCR产物使用Omega胶回收试剂盒回收，用Takara公司限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ酶切，与用相同酶处理的pPIC9k质粒连接，将连接产物转化DH5α感受态细胞，37℃过夜，转化子长出。挑取转化子接种到LB液体培养基中，于37℃、160rpm下培养14-16h，至转化子长出。取数个转化子，10000rpm、4℃、5min离心收集菌体，按照实施例1.2方法提取质粒，用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切实验，将酶切验证正确的阳性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。结果显示，获得377位赖氨酸突变为苯丙氨酸的克隆。

采用实施例1.2的方法，培养所得克隆、抽取质粒、进行质粒线性化、电转毕赤酵母，获得重组毕赤酵母，并制作其甘油管菌液。

1.4、377位突变脂肪酶制备

按实施例1.3的方法，分别制备获得377位赖氨酸突变为其他氨基酸的脂肪酶突变体的克隆，并制作相应克隆的甘油管菌液，其中，脂肪酶突变体及其引物对如表1所示。

表1、枝孢霉脂肪酶377位点突变体及其突变引物

突变氨基酸上游引物序列编号下游引物序列编号LL-USEQ ID NO.5L-DSEQ ID NO.6SS-USEQ ID NO.7S-DSEQ ID NO.8YY-USEQ ID NO.9Y-DSEQ ID NO.10

CC-USEQ ID NO.11C-DSEQ ID NO.12WW-USEQ ID NO.13W-DSEQ ID NO.14PP-USEQ ID NO.15P-DSEQ ID NO.16HH-USEQ ID NO.17H-DSEQ ID NO.18QQ-USEQ ID NO.19Q-DSEQ ID NO.20RR-USEQ ID NO.21R-DSEQ ID NO.22II-USEQ ID NO.23I-DSEQ ID NO.24MM-USEQ ID NO.25M-DSEQ ID NO.26TT-USEQ ID NO.27T-DSEQ ID NO.28NN-USEQ ID NO.29N-DSEQ ID NO.30VV-USEQ ID NO.31V-DSEQ ID NO.32AA-USEQ ID NO.33A-DSEQ ID NO.34DD-USEQ ID NO.35D-DSEQ ID NO.36GG-USEQ ID NO.37G-DSEQ ID NO.38EE-USEQ ID NO.39E-DSEQ ID NO.40

1.5、wt和各饱和突变子的表达

分别取100μl wt和各饱和突变子的甘油管菌液接种至YPD液体培养基，28℃培养24h后，以0.1%接种量接种于生长培养基BMGY，于28℃培养至菌体生长至OD₆₀₀为2-6，1500g、4℃、离心发酵液5min，去除上清，用原培养基体积的诱导培养基BMMY重悬菌体，每天补加0.5%甲醇，诱导3天后，15000rpm、4℃离心15分钟，收集发酵上清。

1.6、表面活性剂的耐受性检测

将实施例1.5中制备的发酵上清液进行蛋白电泳，并通过Millipore离心过滤装置（购自国药集团化学试剂有限公司）进行蛋白浓缩，将目的蛋白浓度调整至0.05μg/μl。

向检测发酵上清的脂肪酶酶活的测定体系中加入终浓度为0.5%的SDS，并加等体积水的反应管作为对照，测试脂肪酶的SDS耐受性。具体过程如下：

将50mM Tris-Cl（pH8.0）缓冲液和6mg/ml pNPP底物以9:1比例配置成混合液。取400μl混合液至2ml Eppendorf管，加入SDS至终浓度为0.5%，振荡混合。在45℃孵育5分钟，加入1μl发酵上清进行反应。反应15分钟后，加入乙醇至终体积为2ml，12000rpm离心2分钟，测试405nm光吸收值。在本实验中设置两个对照，其中第一个对照为将SDS换成等体积水，其他测试条件不变。第二个对照为开始不加酶液，待反应结束乙醇加入后，再添加等量酶液，其他测试条件不变。

具体计算方法是：按照上述pNPP法，计算在添加了0.5%SDS的反应条件下酶的活力和将SDS置换成等体积水的反应条件下酶的活力，二者的比值乘以一百即为酶的剩余活力百分比。以测定Lipwt（K）脂肪酶的剩余活力百分比为100%，计算其他脂肪酶的剩余活力百分比，即为图1。

根据图1的结果，当377位氨基酸为碱性氨基酸，如精氨酸（R）、赖氨酸（K）、组氨酸（H）时耐受性下降，当377位氨基酸为酸性氨基酸及其酰胺，如谷氨酸（E）、天冬氨酸（D）、谷氨酰胺（Q）和天冬酰胺（N）时耐受性上升，特别是当377位氨基酸为谷氨酸（E）、天冬氨酸（D）时，耐受性达到最高。当377位氨基酸为中性脂肪族氨基酸，如甘氨酸（G）、丙氨酸（A）和亮氨酸（L）等时耐受性下降。当377位氨基酸为羟基或硫氨基酸，如丝氨酸（S）、苏氨酸（T）等时耐受性略微提高。当377位氨基酸为芳香族氨基酸，如酪氨酸（Y）、色氨酸（W）时耐受性略微上升，但突变为苯丙氨酸（F）时耐受性下降。特别的，当377位氨基酸突变为脯氨酸时，将蛋白浓度与Lipwt调整一致（0.05μg/μl），比酶活降至Lipwt的1/50。说明脯氨酸影响了脂肪酶的活性中心。

本发明中，与Lipwt相比，当377位氨基酸为谷氨酸（E）、天冬氨酸（D）时，阴离子表面活性剂耐受性提高幅度最大，其中谷氨酸最优。根据上述饱和突变的结果，分析原因如下：377位氨基酸位于Lipcs蛋白三维结构表面，遇到环境中的阴离子表面活性剂，碱性氨基酸表现亲和作用，致使蛋白遭到损害，酸性氨基酸变现排斥作用，致使蛋白在一定程度上得到保护。

将377氨基酸为谷氨酸的毕赤酵母重组菌株命名为“496”，其表达的突变脂肪酶命名为“Lip496”。

实施例2、表面活性剂的耐受性检测

制备质量浓度为10%的阳离子表面活性剂（CTAB）、非离子表面活性剂（AEO-9，Triton X-100和Tween-80）和阴离子表面活性剂（LAS，AOS，AES和SDS）贮存液。

按照实施例1.6的方法，测试来自实施例1.5的Lip496对各种表面活性剂耐受性，结果如图2-6所示。其中具体的计算方法是：按照上述pNPP法，计算在添加了表面活性剂的反应条件下酶的活力和将表面活性剂置换成等体积水的反应条件下酶的活力，二者的比值乘以一百即为酶的剩余活力百分比。

根据图2的结果，与野生型脂肪酶相比，脂肪酶突变体496对阳离子表面活性剂耐受性降低，对非离子表面活性剂Triton X-100、Tween-80和AEO-9的耐受性基本变化不大，其中Triton X-100略有下降。

根据图3-6的结果，脂肪酶突变体496对LAS、AOS、AES和SDS的耐受性优于野生型脂肪酶，其中对LAS、AOS和SDS的耐受性是野生型脂肪酶的两倍以上，对AES的耐受性是野生型脂肪酶的1.5倍以上。对阴离子表面活性剂耐受性大大提高。

由于目前洗涤剂组分中阴离子表面活性剂占大部分，而脂肪酶突变体496对阴离子耐受性大大增强，因此，可作为洗涤剂的酶制剂使用，具有良好的工业应用前景。Lip496作为洗涤剂酶制剂使用的优点表现在两方面：（1）本发明脂肪酶能够提高含酶洗涤剂的酶制剂活力，改善洗涤效果，而且酶活力损失的降低，导致价格高昂的脂肪酶的成本相对降低；（2）随着科技进步，液体洗涤剂的市场范围将不断扩大，对表面活性剂耐受性提高的脂肪酶的需求将更为迫切，Lip496顺应了市场发展的需要，解决脂肪酶容易失活的技术难题，为液体洗涤剂的进一步推广应用铺平道路。