跌打丸中成药内非法添加染色剂808猩红的检测方法

摘要

本发明涉及一种跌打丸中成药内非法添加染色剂808猩红的检测方法。具体采用三氯甲烷超声提取，浓缩蒸干，甲醇定量溶解后得到去除很多干扰成分的、且能够顺利进样于配有DAD检测器的高效液相色谱仪，从而达到微量检测成分808猩红从成分极为复杂的大蜜丸中提取出来并顺利准地进行检测。应用HPLC-DAD法定性、定量测定跌打丸中成药内非法添加的染色剂808猩红。本发明有效解决了跌打丸成药因组方大，成分复杂所导致的提取，以及测定808猩红时干扰多的问题，具有操作简便，精密度好，重复性高的特点，有望成为跌打丸中成药质量控制的标准方法。

说明书

技术领域

本发明涉及中药质量检测领域，具体涉及一种跌打丸中成药内非法添加染 色剂808猩红的检测方法。

背景技术

跌打丸是由三七、当归、白芍、赤芍、桃仁、红花、血竭、北刘寄奴、烫 骨碎补、续断、苏木、牡丹皮、乳香(制)、没药(制)、姜黄、醋三棱、防风、 甜瓜子、枳实(炒)、桔梗、甘草、木通、煅自然铜、土鳖虫共24味中药饮片组 成的大处方中药制剂。具有活血散瘀，消肿止痛的功效。用于跌打损伤，筋断 骨折，瘀血肿痛，闪腰岔气等症。其制备方法是将所有24味中药饮片分别粉碎 成细粉，过筛，混匀，每100g粉末加炼蜜100～120g制成大蜜丸。

组方中的血竭是一种名贵中药，为棕榈科植物麒麟竭Daemonorops draco Bl. 果实渗出的树脂经加工制成。血竭长期依赖于进口，由于进口药材来源有限， 价格昂贵，一些不法分子为了追求经济利益，常以松香等树脂类物质经过染色 冒充血竭或将质量较差的血竭染色后出售，而808猩红为常用的染色剂之一。

808猩红(808Scarlet)为偶氮类红色化工染料，常用于涂料、油墨、油漆、 皮革等化工产品的着色，并非食用色素，具有强致癌和致突变性，误食后会导 致皮下组织生长肉瘤，诱发癌症，人体即使摄入极少量的808猩红，也会严重 损害身体健康。跌打丸组方中血竭占处方比例的3.9％，血竭原料药材的质量会 直接影响跌打丸成药的质量。

目前，在中药检测领域中检测非法添加染色剂808猩红的方法的检测对象 均为单一的中药材。如赵江红(中医研究.24(8)：17-19)“高效液相色谱法鉴 定29批血竭中非法添加的3种化学成分”，“国家食品药品监督管理局：药品检 验补充检验方法和检验项目批准件血竭(批准件编号：2008004)”，“国家食品 药品监督管理局：药品检验补充检验方法和检验项目批准件朱砂(批准件编号： 2008003)”，邹耀华等(中国卫生检验杂志.20(11)：2724-2725,2728)“HPLC-PDA 法检测西红花和红花中十一种非法添加色素”，可见这些方法仅用于检测中药 材，而非中成药中非法添加的染色剂808猩红。因为中成药是由多种中药材按 照相应的比例进行组方，并按照一定的生产工艺加工制成的，所含成分比单一 的中药材要复杂得多，而中成药跌打丸的剂型为大蜜丸，不但组方药味极多， 成分复杂，而且跌打丸中的血竭仅占处方比例的3.9％，因此很难从跌打丸中提 取并准确检测染色剂808猩红，检测过程极易产生假“阳性”干扰，从而导致 无法明确地判定结果。显然如何从跌打丸成药中提取并准确检测染色剂808猩 红，保障人民群众用药安全，是当前亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种跌打丸中成药中非法添加染色剂808猩红的检测 方法，准确快速地检测出中成药跌打丸中非法添加的染色剂808猩红，以弥补 现有技术的不足。

本发明考虑到跌打丸是一个由24味中药饮片组成的大处方中药制剂，化学 成分十分复杂，加之剂型为大蜜丸，炼蜜所占比例高达50％，是一个比例相当 大的、极为严重的干扰污染源，测定时极易出现假“阳性”干扰。又，由于跌 打丸组方中血竭仅占处方比例的3.9％，使用伪劣血竭为原料制成的跌打丸中808 猩红的含量又非常低，仅为1μg·g^-1，不进行浓缩富集是无法进行检测的。

已有技术通常选用的诸种溶剂如甲醇，乙醇，乙腈等溶剂直接超声提取808 猩红，则提取溶液蒸干后所得的残渣量较大，又需要添加甲醇将残渣溶解，但 所得溶液的粘性较大，因此不能利用高效液相色谱法检测。本发明的选用三氯 甲烷作为溶剂以达到极易溶解大蜜丸中的染色剂808猩红，且该溶剂对大蜜丸 中炼蜜的溶解度极低，而且提取溶液蒸干后所得残渣量极少(即意味着很多不 明的干扰成分通过该步骤得到剔出了)，其后溶解，所得溶液就可以用于高效液 相色谱法检测。

另外，还考虑到小活络丸是大蜜丸，其粘性很大，如不进行分散，上述选 取的提取溶剂三氯甲烷也难以渗入到样品中，也就不能充分提取808猩红。因 此选用一种分散剂，既能保证防止样品结块，又能增加样品与提取溶剂的接触 面，还能保证提取溶剂三氯甲烷充分渗入到样品中去，而充分实现染色剂808 猩红的完全提取，从而达到微量检测成分808猩红从成分极为复杂的大蜜丸中 提取出来并顺利准确地进行检测。

本发明的技术方案包括：

(1)对照试剂溶液的制备：精密称取808猩红对照试剂5.68mg，置于100mL 量瓶中，加甲醇定容至100mL，制成对照试剂浓溶液。再精密量取对照试剂浓 溶液5mL，置于50mL量瓶中，加甲醇定容至50mL，制成每1mL含808猩红 对照试剂5.68μg的溶液作为对照试剂溶液。

(2)供试品溶液的制备：取跌打丸样品6g，剪碎，精密称定重量，加硅藻土 3g，研匀，精密加入三氯甲烷20mL，称定重量，超声处理20分钟，放冷，再 加三氯甲烷补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液10mL，蒸干，残渣加甲醇 溶解，转移至1mL量瓶中，加甲醇至1mL，摇匀，制成供试品溶液。

(3)含量测定方法：分别精密吸取对照试剂溶液、供试品溶液各10μL，注 入配有DAD检测器的高效液相色谱仪进行正常测定。

(4)结果判定：如样品呈现与对照试剂保留时间相同的色谱峰，则对比样品 中与808猩红对照试剂保留时间相同的色谱峰的吸收光谱与808猩红对照试剂 的吸收光谱，如吸收光谱一致，则可判定样品中含有808猩红。

显然，本发明有效解决了跌打丸成药因组方大，成分复杂所导致的提取， 以及测定808猩红时干扰多的问题，具有操作简便，精密度好，重复性高的特 点，有望成为跌打丸中成药质量控制的标准方法。

附图说明

图1：本发明的808猩红对照试剂的HPLC-UV色谱图。

图2：本发明的跌打丸阳性样品溶液的HPLC-UV色谱图。

图3：本发明的跌打丸阴性样品溶液的HPLC-UV色谱图。

图4：本发明的808猩红对照试剂的光谱图。

图5：本发明的跌打丸阳性样品溶液的光谱图。

具体实施方式

下面给出详细的实施例。

本发明采用：仪器与试药：岛津LC-20AT高效液相色谱系统(日本，岛津公 司，配DAD检测器)；Waters 2695/Quattro Micro液相色谱/串联四极杆质谱联 用系统(美国，Waters公司)；BP211D电子天平(德国，Sartoris公司)；AUTO  SCIENCE AS10200BT型超声波清洗器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。乙腈 为色谱用试剂，其它试剂均为分析纯；808猩红对照试剂(中国食品药品检定研 究院，批号为：111940-201201)。

色谱条件：色谱柱：Agilent Eclipse Plus C₁₈(250×4.6mm，5μm)；以乙腈 为流动相A，0.02mol·L^-1醋酸铵溶液为流动相B，梯度洗脱(0～15min，15％B～ 5％；15～25min，5％B)；柱温30℃；流速1.0mL·min^-1；检测波长为516nm； 理论板数按808猩红色谱峰计算应不低于4000。

对照试剂溶液的制备：取808猩红对照试剂5.68mg，精密称定(精密至 0.1mg)，置于100mL量瓶中，加甲醇定容至100mL，制成对照试剂浓溶液。再 精密量取对照试剂浓溶液5mL，置于50mL量瓶中，加甲醇定容至50mL，制 成每1mL含808猩红对照试剂5.68μg的溶液作为对照试剂溶液。

供试品溶液的制备：取跌打丸样品6g，剪碎，精密称定重量(精密至1mg)， 加硅藻土3g，研匀，精密加入三氯甲烷20mL，称定重量(精密至0.1g)，超声 处理(功率300W，频率40KHz)20分钟，放冷，再加三氯甲烷补足减失的重 量(精密至0.1g)，滤过，精密量取续滤液10mL，蒸干，残渣加甲醇溶解，转 移至1mL量瓶中，加甲醇至1mL，摇匀，制成供试品溶液。

专属性试验：分别精密吸取对照试剂溶液、供试品溶液各10μL，注入液相 色谱仪测定，记录各溶液的色谱图和光谱图，色谱图见图1、2、3，光谱图见图 4、5。

结果表明，阳性样品呈现与对照试剂保留时间相同的色谱峰，而阴性样品 则无相对应的色谱峰。阳性样品中与808猩红对照试剂保留时间一致的色谱峰 的吸收光谱与808猩红对照试剂的吸收光谱一致。通过专属性实验，可有效定 性808猩红。

线性关系考察：分别精密吸取808猩红对照试剂溶液2、4、6、8、10、15、 20μL，按上述色谱条件进行测定，以峰面积积分值为纵坐标，以进样量(μg) 为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，得到回归方程为Y＝3774523.29X– 136.00r＝1，线性范围为0.01136～0.11360μg。

检测限考察：根据808猩红对照试剂溶液S/N＝3时的溶液浓度，计算出测 定方法的检出限(LOD)，结果808猩红的检测限为1ng·g^-1。

精密度试验：精密吸取对照试剂溶液10μL，连续进样6次，测定峰面积积 分值，结果测得峰面积积分值的RSD为0.71％(n＝6)，表明仪器具有良好的精 密度。

重复性试验：取同一批跌打丸样品，按供试品溶液的制备方法平行制备6 份供试品溶液，分别在上述色谱条件下进行测定，计算跌打丸样品中808猩红 的含量(μg·g^-1)，含量的RSD为1.24％(n＝6)。结果表明，本方法具有良好的重 复性。

稳定性试验：取同一份供试品溶液，在上述色谱条件下于0、1、12、24h 进样，测定峰面积积分值，808猩红峰面积积分值的RSD为0.62％(n＝6)。结 果表明，供试品溶液在24小时内基本稳定。

加样回收率试验：取阴性样品6g，剪碎，精密称定重量(精密至1mg)，精 密加入浓度为5.68μg·mL^-1的808猩红对照试剂溶液2mL，按照供试品溶液的制 备方法制成加样供试液6份。精密吸取加样供试液10μL，按上述方法测定，计 算加样回收率，结果808猩红的平均回收率为96.82％，RSD＝1.06％(n＝6)， 表明加样回收率良好。

以上实验表明，本发明的定性、定量检测结果准确，可有效控制跌打丸中 非法添加的808猩红的检测。

为了进一步对含有808猩红的阳性样品进行确证，又采用了HPLC/MS/MS 方法进行验证。

质谱条件：色谱柱：Waters ACQUITY UPLCTM BEH C₁₈(2.1×100mm，1.7 μm)；柱温：30℃；流速：0.2mL·min^-1；以乙腈为流动相A，5mmol·L^-1醋酸铵 溶液为流动相B，梯度洗脱(0～3min，70％B；3～8min，70％B～20％；8～ 10min，20％B～5％；10～14min，5％B；14.0～14.5min，5％B～70％；14.5～ 16min，70％B)；进样量：10μL。质谱检测参数：扫描方式：ESI+；检测方式： 多反应监测(MRM)模式；毛细管电压：4.0KV；萃取锥孔电压：6V；RF Lens： 4.0V；源温度：110℃；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流量：600L·h^-1；锥孔 气流量：50L·h^-1；碰撞室入口电压：-2；出口电压1；MS1和MS2高、低分辨 率均为13.0。

检测结果：采用ESI正离子扫描模式，808猩红易形成m/z 368[M+H]⁺准分 子离子峰，以m/z 368为母离子进行子离子调谐，形成m/z 275和77的两个丰 度较强的碎片，组成两对离子对，进行多反应监测(MRM)模式定性和定量检 测。定量离子对和定性离子对的丰度比为6.5，范围为±30％。阳性样品色谱中， 与808猩红相应色谱峰具有相同的质谱特征。

综上，本发明所建立的高效液相色谱-质谱检测法可以有效定性、定量检测 中成药跌打丸中非法添加的染色剂808猩红，避免了假“阳性”与定量检测不 准确的问题，方法操作快速准确，不仅大大地提高了工作效率，可以更全面、 更有效地控制和监查中成药跌打丸的质量。