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法律状态
2017-12-29
授权
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2015-05-27
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N27/62 申请日:20150106
实质审查的生效
2015-04-29
公开
公开
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别是涉及一种基体中蛋白质酶切效率的准确测定方法。
背景技术
随着生命科学的发展和生物技术的进步,蛋白质检测已经在临床检验、食品安全、生物 医药等领域得到了广泛的应用。例如,肿瘤标志物、心脑血管疾病标志物、内分泌疾病标志 物等,80%以上都是蛋白质;食品过敏原的检测和标识、重组蛋白药物的质量评价,同样离 不开蛋白质的准确定量。为了保证各领域蛋白质检测结果的准确可比,需要研制相应的蛋白 质标准物质作为分析定量时的标准,蛋白质标准物质通常采用比常规分析更为准确的技术手 段作为定值方法,如同位素稀释质谱法等。
对于血清、食品等复杂基质中蛋白质的同位素稀释质谱定量过程一般如下:首先对目标 蛋白质进行生物信息学分析,筛选出对应于目标蛋白的特异性肽段。接着通过化学法合成同 位素标记及非标记的特异性肽段,并采用基于氨基酸分析的方法对非标记肽段进行准确定量, 然后将同位素标记肽段添加到待测样品中,混匀后进行酶切。酶切结束后以非标记肽段为标 准,以合成的同位素标记肽段为内标,对酶解液中的特异性肽段浓度进行同位素稀释质谱分 析,根据酶解液中特异性肽段的浓度计算样品中蛋白质的浓度。计算公式见公式一:
式中,
cpeptide——通过同位素稀释质谱法测定的酶解中特异性肽段的浓度,单位g/g;
cprotein,true——酶解液中蛋白质的真实浓度,单位g/g;
Mprotein——目标蛋白的分子量;
Mpeptide——特异性肽段的分子量;
n——一个目标蛋白中含有的特异性肽段的个数,通常情况下n=1;
x——酶切效率,当完全酶解时x=1。
通常计算时,酶切效率按照100%进行计算,但事实上在进行蛋白质酶切时,受到化学平 衡、基质中的蛋白酶抑制剂等影响,酶切效率很难达到100%,总会存在漏切的肽段。因此, 根据公式一,要准确定量基质中的蛋白质,必须准确的测定出酶切效率,才能得到准确的基 质中蛋白质的含量。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种高准确度、可溯源的基体中蛋白质酶切效率的准确 测定方法。
一种基体中蛋白质酶切效率的准确测定方法,包括如下步骤:
(1)对目标蛋白进行特异性肽段筛选,采用蛋白酶对目标蛋白进行理论酶切,得到各条 理论酶切肽段;将得到的理论酶切肽段逐条利用Blast工具检索,确定出目标蛋白的特异性酶 切肽段;
(2)通过化学合成的方法采用氨基酸合成出特异性肽段;采用同位素标记的氨基酸合成 出同位素标记的特异性肽段,通过反相高效液相色谱法对合成的肽段进行纯化得到纯品,采 用基于氨基酸分析的同位素稀释质谱方法测定出合成肽段中目标肽段的质量分数Ppeptide;
(3)获得待测目标蛋白的纯品,并采用基于氨基酸分析的同位素稀释质谱方法测定出蛋 白质纯品中蛋白质的质量分数Pprotein;称取蛋白纯品,配制成标准蛋白母液,计算其浓度;
(4)对待测基质样品中的目标蛋白浓度进行初步测定,得到样品中目标蛋白的粗测浓度 c1;
(5)对样品中的蛋白进行酶切,根据目标蛋白的粗测浓度c1,添加适量的同位素标记特 异性肽段,并以合成的非标记特异性肽段为标准,采用同位素稀释质谱法对样品酶解液中特 异性肽段浓度进行测定,浓度测定结果为cpeptide;
(6)根据粗测浓度c1,在质量为w0的样品中添加浓度为c0或其稀释液的待测目标蛋白 溶液w1,使其浓度略有增加,添加的母液体积应当尽可能少,从而不会对基质浓度产生明显 的影响;接着按照步骤(4)对添加后的样品进行酶切和特异性肽段浓度的同位素稀释质谱测 定,测定结果为cpeptide1;
(7)根据测定的酶解液中特异性肽段的浓度,计算蛋白浓度;
(8)计算添加目标蛋白为w1时的酶切效率;
(9)重复步骤(6)到步骤(8)的过程,每次添加不同的蛋白量,得到一系列的酶切效 率值ηn;
(10)以蛋白添加质量浓度为横轴、酶切效率为纵轴作图,通过拟合得到酶切效率与蛋 白添加量的关系图,将蛋白添加量外推至0,得到原始样品中蛋白质的准确酶切效率。
本发明所述的基体中蛋白质酶切效率的准确测定方法,其中步骤(1)中所述蛋白酶为胰 蛋白酶或Glu-C。
本发明所述的基体中蛋白质酶切效率的准确测定方法,其中步骤(3)中所述标准蛋白母 液的浓度通过公式二计算;
式中,
c0——蛋白母液浓度,单位g/g;
m——称取的蛋白纯品的质量,单位g;
w——溶液的质量,单位g;
Pprotein——目标蛋白的质量分数。
本发明所述的基体中蛋白质酶切效率的准确测定方法,其中步骤(4)中对待测基质样品 中的目标蛋白浓度进行初步测定的方法采用ELISA、HPLC或HPLC-MS方法。
本发明所述的基体中蛋白质酶切效率的准确测定方法,其中步骤(5)中cpeptide的计算通 过公式三进行:
式中,
Ppeptide——非标记肽段的质量分数,单位g/g;
ms——样品中添加的同位素标记肽段的质量,单位g;
Rs——样品分析结果中非标记肽段和同位素标记肽段的峰面积比;
I1——高标中非标记肽段和同位素标记肽段的质量比;
I2——低标中非标记肽段和同位素标记肽段的质量比;
R1——高标中非标记肽段和同位素标记肽段的峰面积比;
R2——低标中非标记肽段和同位素标记肽段的峰面积比;
ws——称取的样品质量,单位g。
本发明所述的基体中蛋白质酶切效率的准确测定方法,其中步骤(7)蛋白浓度的计算采 用公式四和公式五分别计算蛋白的浓度;由肽段浓度cpeptide计算的蛋白浓度为cprotein,由肽段 浓度cpeptide1计算的蛋白浓度为cprotein1;
式中,
cpeptide——通过同位素稀释质谱法测定的酶解液中特异性肽段的浓度,单位g/g;
cpeptide1——通过同位素稀释质谱法测定的酶解液中特异性肽段的浓度,与cpeptide的数值不 同,单位g/g;
cprotein——当肽段浓度为cpeptide时酶解液中未经酶解效率校正时的蛋白质浓度,单位g/g;
cprotein1——当肽段浓度为cpeptide1时酶解液中未经酶解效率校正时的蛋白质浓度,单位g/g;
Mprotein——目标蛋白的分子量;
Mpeptide——特异性肽段的分子量;
n——一个目标蛋白中含有的特异性肽段的个数,通常情况下n=1。
本发明所述的基体中蛋白质酶切效率的准确测定方法,其中步骤(8)中酶切效率的计算 采用公式六进行:
式中,
η1——添加目标蛋白为w1时的酶切效率;
w0——样品质量,单位g;
w1——蛋白母液质量,单位g;
cprotein1——添加后样品采用同位素稀释质谱测定的样品中蛋白浓度,单位g/g;
cprotein——未添加时采用同位素稀释质谱测定的样品中蛋白浓度,单位g/g;
c0——蛋白质母液的浓度,单位g/g。
采用本发明所述的基体中蛋白质酶切效率的准确测定方法测定奶粉中β-乳球蛋白酶切 效率,包括如下步骤:
(1)通过生物信息学的手段进行数据库检索,选择TPEVDDEALEK,即TK-11作 为β-乳球蛋白同位素稀释质谱定量的特异性肽段;
(2)采用氨基酸固相合成手段,合成出肽段TK-11,以及同位素氨基酸标记的肽段 TK*-11,通过反相高效液相色谱手段进行纯化,使其反相高效液相色谱纯度达到99% 以上;以国家缬氨酸、脯氨酸和亮氨酸有证标准物质为标准,以同位素标记缬氨酸、脯 氨酸和亮氨酸为内标,采用同位素稀释质谱法对合成的标准肽段进行准确定量,得到合 成肽的质量分数为0.786g/g;
(3)获取纯化后的β-乳球蛋白,并采用基于氨基酸分析的同位素稀释质谱方法测定 出蛋白中β-乳球蛋白的质量分数为0.8296g/g;称取1.014mgβ-乳球蛋白,用1.002g含 有0.1%的甲酸-水配制成标准蛋白溶液,其浓度通过公式二计算:
式中,
c0——蛋白母液浓度,单位g/g;
m——称取的蛋白纯品的质量,单位g;
w——溶液的质量,单位g;
Pprotein——目标蛋白的质量分数;
计算结果为8.388×10-4g/g;
(4)采用德国拜发β-乳球蛋白ELISA检测试剂盒对奶粉中β-乳球蛋白进行测定, 按照试剂盒操作使用说明,测定结果为7×10-5g/g;
(5)样品处理及酶切:称取0.1g奶粉样品溶于0.8g的PBS-T磷酸缓冲盐溶液中, 进行如下处理:在60℃下水浴加热15min,并且每2min摇晃一次样品溶液;水浴结 束后,加入15.2g 50mM的NH4HCO3溶液,混匀;将样品溶液在大约8000g离心力下 离心20分钟;取出3g上清液,加入6g 50mM的NH4HCO3溶液稀释三倍;取2.7g 溶液进行超滤,超滤管截留分子量为3kDa,离心力为6500g,离心15分钟;加入1mL 50mM的NH4HCO3溶液进行淋洗,离心力为6500g,离心15分钟,共淋洗5次,然 后加入100μL浓度为0.095mg/g的同位素标记TK-11溶液并称重;加入35μL 0.1M的 DTT溶液在60℃水浴中加热15min;加入35μL 0.1M的碘IAA,在封闭抽屉里反应 40min;加入105μL 0.1M的DTT还原多余的IAA;加入5μL 0.5mg/mL的Trypsin 溶液在37℃进行酶切,酶切16小时后加入200μL 0.1M HCl溶液终止酶切反应;用0.22 μm滤膜过滤后采用质谱进行选择性离子扫描分析;
液质分析条件:色谱柱:ZORBAX SB-Aq,3.5μm,2.1mm×150mm;柱温:40℃; 进样量为10μL;流速为0.2mL/min;流动相中A相为含0.1%甲酸的水,B相为含0.1% 甲酸的乙腈;梯度条件见表1;
表1HPLC-IDMS分析酶解肽段的液相梯度条件
质谱采用ESI电离源,在正电荷条件下,采用选择性离子扫描的模式SIM进行目标 离子捕获;监测离子为TK-11,m/z=623,以及同位素标记的TK-11,m/z=625;壳气 流速为30au,辅助气流速为10au;毛细管温度设为270℃,喷涂电压为3000V;
根据样品中β-乳球蛋白的浓度初步测定结果7×10-5g/g,在奶粉样品中添加同位素标 记TK-11肽段,并以合成的非标记TK-11为标准,采用同位素稀释质谱法对样品酶解液中 TK-11肽段浓度进行测定,采用公式三浓度测定结果为cpeptide;
式中,
Ppeptide——非标记肽段的质量分数,单位g/g;
ms——样品中添加的同位素标记肽段的质量,单位g;
Rs——样品分析结果中非标记肽段和同位素标记肽段的峰面积比;
I1——高标中非标记肽段和同位素标记肽段的质量比;
I2——低标中非标记肽段和同位素标记肽段的质量比;
R1——高标中非标记肽段和同位素标记肽段的峰面积比;
R2——低标中非标记肽段和同位素标记肽段的峰面积比;
ws——称取的样品质量,单位g;
根据公式四算出酶解液中未经酶切效率校正的β-乳球蛋白浓度cprotein为8.7×10-6g/g;
式中,
cpeptide——通过同位素稀释质谱法测定的酶解液中特异性肽段的浓度,单位g/g;
cprotein——酶解液中未经酶解效率校正时的蛋白质浓度,单位g/g;
Mprotein——目标蛋白的分子量;
Mpeptide——特异性肽段的分子量;
n——一个目标蛋白中含有的特异性肽段的个数;
(6)称取0.1g奶粉样品,添加1.206×10-3g的浓度为8.388×10-4g/g的β-乳球蛋白 标准物质溶液,混合后溶于0.8g PBS-T磷酸缓冲盐溶液中;然后按照步骤(5)进行样 品处理和酶解,并进行同位素稀释质谱的测定,采用公式五计算出酶解液中蛋白质的浓 度为9.705×10-6g/g;
式中,
cpeptide1——通过同位素稀释质谱法测定的酶解液中特异性肽段的浓度,与cpeptide的数值不 同,单位g/g;
cprotein1——当肽段浓度为cpeptide1时酶解液中未经酶解效率校正时的蛋白质浓度,单位g/g;
Mprotein——目标蛋白的分子量;
Mpeptide——特异性肽段的分子量;
(7)采用公式六计算添加目标蛋白为1×10-5g/g时的酶切效率:
式中,
η1——添加目标蛋白为w1时的酶切效率;
w0——样品质量,单位g;
w1——蛋白母液质量,单位g;
cprotein1——添加后样品采用同位素稀释质谱测定的样品中蛋白浓度,单位g/g;
cprotein——未添加时采用同位素稀释质谱测定的样品中蛋白浓度,单位g/g;
c0——蛋白质母液的浓度,单位g/g;
酶切效率计算结果为10.1%;
(8)分别添加3×10-5g/g、5×10-5g/g、7×10-5g/g、9×10-5g/g的β-乳球蛋白,添加后按照 步骤(5)到步骤(7)处理样品并计算相应添加量下的酶切效率,当β-乳球蛋白添加量分别 为3×10-5g/g、5×10-5g/g、7×10-5g/g、9×10-5g/g时,测定的酶切效率分别为10.0%、10.0%、 9.9%、9.7%;
(9)以蛋白添加质量浓度为横轴、酶切效率为纵轴作图,将数据点进行线性拟合,并 外推至加入量为0,得到样品中蛋白的酶切效率为10.2%。
本发明基体中蛋白质酶切效率的准确测定方法与现有技术不同之处在于:本发明基 体中蛋白质酶切效率的准确测定方法克服了现有的基于肽段的蛋白质含量同位素稀释 质谱定量过程中酶切效率的计算问题,提供了一种高准确度、可溯源的基质中蛋白质酶 切效率的测定和计算方法。该方法有助于血清、食品中蛋白质标志物含量的准确测定及 标准物质研制,从而保证各个检测实验室、医院检验科蛋白质标志物检测结果的准确可 比。
下面结合附图对本发明的基体中蛋白质酶切效率的准确测定方法作进一步说明。
附图说明
图1为本发明方法中不同酶切β-乳球蛋白添加量下的酶切效率。
具体实施方式
实施例1
一种基体中蛋白质酶切效率的准确测定方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)对目标蛋白进行特异性肽段筛选,采用蛋白酶对目标蛋白进行理论酶切,得到各条 理论酶切肽段;将得到的理论酶切肽段逐条利用Blast工具检索,确定出目标蛋白的特异性酶 切肽段;
(2)通过化学合成的方法采用氨基酸合成出特异性肽段;采用同位素标记的氨基酸合成 出同位素标记的特异性肽段,通过反相高效液相色谱法对合成的肽段进行纯化得到纯品,采 用基于氨基酸分析的同位素稀释质谱方法测定出合成肽段中目标肽段的质量分数Ppeptide;
(3)获得待测目标蛋白的纯品,并采用基于氨基酸分析的同位素稀释质谱方法测定出蛋 白质纯品中蛋白质的质量分数Pprotein;称取蛋白纯品,配制成标准蛋白母液,计算其浓度;
(4)对待测基质样品中的目标蛋白浓度进行初步测定,得到样品中目标蛋白的粗测浓度 c1;
(5)对样品中的蛋白进行酶切,根据目标蛋白的粗测浓度c1,添加适量的同位素标记特 异性肽段,并以合成的非标记特异性肽段为标准,采用同位素稀释质谱法对样品酶解液中特 异性肽段浓度进行测定,浓度测定结果为cpeptide;
(6)根据粗测浓度c1,在质量为w0的样品中添加浓度为c0或其稀释液的待测目标蛋 白溶液w1,使其浓度略有增加,添加的母液体积应当尽可能少,使得添加后的浓度与添加前 的浓度处于同一个数量级,从而不会对基质浓度产生明显的影响;接着按照步骤(4)对添加 后的样品进行酶切和特异性肽段浓度的同位素稀释质谱测定,测定结果为cpeptide1;
(7)根据测定的酶解液中特异性肽段的浓度,计算蛋白浓度;
(8)计算添加目标蛋白为w1时的酶切效率;
(9)重复步骤(6)到步骤(8)的过程,每次添加不同的蛋白量,得到一系列的酶切效 率值ηn;
(10)以蛋白添加质量浓度为横轴、酶切效率为纵轴作图,通过拟合得到酶切效率与蛋 白添加量的关系图,将蛋白添加量外推至0,得到原始样品中蛋白质的准确酶切效率。
步骤(1)中所述蛋白酶为胰蛋白酶或Glu-C。
步骤(3)中所述标准蛋白母液的浓度通过公式二计算;
式中,
c0——蛋白母液浓度,单位g/g;
m——称取的蛋白纯品的质量,单位g;
w——溶液的质量,单位g;
Pprotein——目标蛋白的质量分数。
步骤(4)中对待测基质样品中的目标蛋白浓度进行初步测定的方法采用ELISA、HPLC 或HPLC-MS方法。
步骤(5)中cpeptide的计算通过公式三进行:
式中,
Ppeptide——非标记肽段的质量分数,单位g/g;
ms——样品中添加的同位素标记肽段的质量,单位g;
Rs——样品分析结果中非标记肽段和同位素标记肽段的峰面积比;
I1——高标中非标记肽段和同位素标记肽段的质量比;
I2——低标中非标记肽段和同位素标记肽段的质量比;
R1——高标中非标记肽段和同位素标记肽段的峰面积比;
R2——低标中非标记肽段和同位素标记肽段的峰面积比;
ws——称取的样品质量,单位g。
步骤(7)蛋白浓度的计算采用公式四和公式五分别计算蛋白的浓度;由肽段浓度cpeptide计算的蛋白浓度为cprotein,由肽段浓度cpeptide1计算的蛋白浓度为cprotein1;
式中,
cpeptide——通过同位素稀释质谱法测定的酶解液中特异性肽段的浓度,单位g/g;
cpeptide1——通过同位素稀释质谱法测定的酶解液中特异性肽段的浓度,与cpeptide的数值不 同,单位g/g;
cprotein——当肽段浓度为cpeptide时酶解液中未经酶解效率校正时的蛋白质浓度,单位g/g;
cprotein1——当肽段浓度为cpeptide1时酶解液中未经酶解效率校正时的蛋白质浓度,单位g/g;
Mprotein——目标蛋白的分子量;
Mpeptide——特异性肽段的分子量;
n——一个目标蛋白中含有的特异性肽段的个数,通常情况下n=1。
步骤(8)中酶切效率的计算采用公式六进行:
式中,
η1——添加目标蛋白为w1时的酶切效率;
w0——样品质量,单位g;
w1——蛋白母液质量,单位g;
cprotein1——添加后样品采用同位素稀释质谱测定的样品中蛋白浓度,单位g/g;
cprotein——未添加时采用同位素稀释质谱测定的样品中蛋白浓度,单位g/g;
c0——蛋白质母液的浓度,单位g/g。
实施例2
1、使用的仪器:
分析天平:(METTLER TOLEDO XS205型,最大称量为81g,精度为0.01mg,美 国);(METTLER TOLEDO XP56型,最大称量为52g,精度为0.001mg,美国);
恒温摇床(S16R-2型,SHEL LAB,美国);
烘箱(UFE500型,MEMMERT,美国);
液相色谱-质谱联用仪(TSQ Vantage Triple Quard LC/MS,Thermo,美国);
高速离心机(3K15型,Sigma,德国);
超纯水系统(Milli-Q型,MILLIPORE,美国);
离心超滤管(Amicon ultra-4型,Millipore,美国)。
2、奶粉中β-乳球蛋白酶切效率的准确测定,包括如下步骤:
(1)通过生物信息学的手段进行数据库检索,选择TPEVDDEALEK(TK-11)作为β- 乳球蛋白同位素稀释质谱定量的特异性肽段。
(2)采用氨基酸固相合成手段,合成出肽段TK-11,以及同位素氨基酸标记的肽段 TK*-11,通过反相高效液相色谱手段进行纯化,使其反相高效液相色谱纯度达到99% 以上。以国家缬氨酸、脯氨酸和亮氨酸有证标准物质为标准,以同位素标记缬氨酸、脯 氨酸和亮氨酸为内标,采用同位素稀释质谱法对合成的标准肽段进行准确定量,得到合 成肽的质量分数为0.786g/g。
(3)获取纯化后的β-乳球蛋白,并采用基于氨基酸分析的同位素稀释质谱方法测定 出蛋白中β-乳球蛋白的质量分数为0.8296g/g。称取1.014mgβ-乳球蛋白,用1.002g含 有0.1%的甲酸-水配制成标准蛋白溶液,其浓度可以通过公式二计算:
式中,
c0——蛋白母液浓度,单位g/g;
m——称取的蛋白纯品的质量,单位g;
w——溶液的质量,单位g;
Pprotein——目标蛋白的质量分数;
计算结果为8.388×10-4g/g;
(4)采用德国拜发β-乳球蛋白ELISA检测试剂盒对奶粉中β-乳球蛋白进行测定, 按照试剂盒操作使用说明,测定结果为7×10-5g/g。
(5)样品处理及酶切:称取0.1g奶粉样品溶于0.8g的PBS-T磷酸缓冲盐溶液中, 进行如下处理:在60℃下水浴加热15min,并且每2min摇晃一次样品溶液。水浴结 束后,加入15.2g 50mM的NH4HCO3溶液,混匀。将样品溶液在大约8000g离心力下 离心20分钟。取出3g上清液,加入6g 50mM的NH4HCO3溶液稀释三倍。取2.7g 溶液进行超滤,超滤管截留分子量为3kDa,离心力为6500g,离心15分钟。加入1mL 50mM的NH4HCO3溶液进行淋洗,离心力为6500g,离心15分钟。共淋洗5次。然 后加入100μL浓度约为0.095mg/g的同位素标记TK-11溶液并称重。加入35μL 0.1M 的二硫苏糖醇(DTT)溶液在60℃水浴中加热15min。然后加入35μL 0.1M的碘乙酰胺 (IAA),在封闭抽屉里反应40min。加入105μL 0.1M的DTT还原多余的IAA。加入5 μL 0.5mg/mL的Trypsin溶液在37℃进行酶切,酶切16小时后加入200μL 0.1M HCl 溶液终止酶切反应。用0.22μm滤膜过滤后采用质谱进行选择性离子扫描分析。液质分 析条件:色谱柱:ZORBAX SB-Aq(3.5μm,2.1mm×150mm;安捷伦,美国);柱温: 40℃;进样量为10μL;流速为0.2mL/min。流动相中A相为含0.1%甲酸的水,B相 为含0.1%甲酸的乙腈。梯度条件见表1。质谱采用ESI电离源,在正电荷条件下,采用 选择性离子扫描的模式(SIM)进行目标离子捕获。监测离子为TK-11(m/z=623)以及同位 素标记的TK-11(m/z=625)。壳气流速为30au,辅助气流速为10au。毛细管温度设为 270℃,喷涂电压为3000V。
表1HPLC-IDMS分析酶解肽段的液相梯度条件
根据样品中β-乳球蛋白的浓度初步测定结果7×10-5g/g,在奶粉样品中添加同位素标 记TK-11肽段,并以合成的非标记TK-11为标准,采用同位素稀释质谱法对样品酶解液中TK-11 肽段浓度进行测定,公式三浓度测定结果为cpeptide;
cpeptide的计算通过公式三进行:
式中,
Ppeptide——非标记肽段的质量分数,单位g/g;
ms——样品中添加的同位素标记肽段的质量,单位g;
Rs——样品分析结果中非标记肽段和同位素标记肽段的峰面积比;
I1——高标中非标记肽段和同位素标记肽段的质量比;
I2——低标中非标记肽段和同位素标记肽段的质量比;
R1——高标中非标记肽段和同位素标记肽段的峰面积比;
R2——低标中非标记肽段和同位素标记肽段的峰面积比;
ws——称取的样品质量,单位g。
接着,根据公式四算出酶解液中未经酶切效率校正的β-乳球蛋白浓度cprotein为8.7×10-6g/g;
式中,
cpeptide——通过同位素稀释质谱法测定的酶解液中特异性肽段的浓度,单位g/g;
cprotein——酶解液中未经酶解效率校正时的蛋白质浓度,单位g/g;
Mprotein——目标蛋白的分子量;
Mpeptide——特异性肽段的分子量;
n——一个目标蛋白中含有的特异性肽段的个数;
(6)称取0.1g奶粉样品,添加1.206×10-3g的浓度为8.388×10-4g/g的β-乳球蛋白 标准物质溶液,混合后溶于0.8g PBS-T磷酸缓冲盐溶液中。然后按照(5)中的步骤进 行样品处理和酶解,并进行同位素稀释质谱的测定,采用公式五计算出酶解液中蛋白质 的浓度为9.705×10-6g/g;
式中,
cpeptide1——通过同位素稀释质谱法测定的酶解液中特异性肽段的浓度,与cpeptide的数值不 同,单位g/g;
cprotein1——当肽段浓度为cpeptide1时酶解液中未经酶解效率校正时的蛋白质浓度,单位g/g;
Mprotein——目标蛋白的分子量;
Mpeptide——特异性肽段的分子量;
(7)采用公式六计算添加目标蛋白为1×10-5g/g时的酶切效率:
式中,
η1——添加目标蛋白为w1时的酶切效率;
w0——样品质量,单位g;
w1——蛋白母液质量,单位g;
cprotein1——添加后样品采用同位素稀释质谱测定的样品中蛋白浓度,单位g/g;
cprotein——未添加时采用同位素稀释质谱测定的样品中蛋白浓度,单位g/g;
c0——蛋白质母液的浓度,单位g/g。
酶切效率计算结果为10.1%。
(8)分别添加3×10-5g/g、5×10-5g/g、7×10-5g/g、9×10-5g/g的β-乳球蛋白,添加后按照 步骤(5)-步骤(7)处理样品并计算相应添加量下的酶切效率,当β-乳球蛋白添加量分别 为3×10-5g/g、5×10-5g/g、7×10-5g/g、9×10-5g/g时,测定的酶切效率分别为10.0%、10.0%、 9.9%、9.7%;
(9)以酶切效率-添加量作图,如图1所示,将数据点进行线性拟合,并外推至加 入量为0,得到样品中蛋白的酶切效率为10.2%。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述,并非对本发明的范围进行 限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的 各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
机译: 包含相陶瓷的金属陶瓷复合材料的生产方法;用于在基体金属中沉淀相陶瓷的方法;均匀分散金属蜡ICA的方法在金属基体中至少一种金属间化合物沉淀就地“沉淀”的方法;至少一种将它们分散在基体金属材料陶瓷中的沉淀方法,
机译: 过滤器中酶切结果的测定方法
机译: 使用选自以下的化合物:蛋白酶体抑制剂,自噬抑制剂,溶酶体抑制剂,高尔基体蛋白转运抑制剂,hsp90伴侣蛋白抑制剂,热休克反应激活剂,α和组蛋白脱乙酰酶抑制剂,使用11 -顺式-视黄醛或9-顺式-视黄醛以及选自蛋白酶体抑制剂,自噬抑制剂,核糖体抑制剂,高尔基体蛋白er,hsp90伴侣蛋白抑制剂,热休克反应激活剂,糖苷酶的化合物抑制剂和组蛋白脱乙酰基酶抑制剂,一种增加细胞中蛋白质的生化功能构象量的方法,用于治疗眼pcd的组合物药物,用于治疗色素性视网膜炎的药物组合物,用于治疗视网膜色素变性的试剂盒眼用pcd,用于治疗色素性视网膜炎的试剂盒,用于鉴定可用于治疗具有眼用pcd的个体的化合物的方法,