一种离体组织培养紫萁的方法

摘要

离体组织培养紫萁的方法，剪取紫萁孢子囊穗顶端未成熟的绿色孢子囊穗；外植体消毒

说明书

技术领域

本发明涉及蕨类植物的组织培养，尤其涉及一种离体组织培养紫萁的方法。

背景技术

紫萁是一种分布广泛的蕨类植物，其嫩叶可食， 称“薇菜”，为著名的山珍。其根茎可入药，有清热解毒、抑菌等功效，具有一定的应用价值。近年来，因为人为过度采摘，自然资源逐渐枯竭。在自然环境中，蕨类植物主要通过孢子进行繁衍，或通过根、根状茎、叶等部位产生无性孢和顶端分生组织产生新植株。然而，自然条件下孢子成苗率很低，不能满足市场和社会发展的需要，不利于种群的扩大和人工栽培。本发明是对紫萁孢子离体培养各阶段的培养基配方和培养条件，为其工厂化育苗提供技术手段。

紫萁（薇菜）作为蕨类植物，在其生活史中，要经历孢子体和配子体两个世代，其配子体有性生活世代的授精过程中需要水作为介质，用常规的离体培养方法很难获得成功，本发明根据蕨类植物的这一特点，探索出一套紫萁（薇菜）离体培养方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种离体组织培养紫萁的方法，具体步骤如下：

1：外植体的选择

紫萁孢子体生殖叶植株顶端未成熟的绿色孢子囊穗。

2：消毒

将外植体放在漏网中，用自来水冲洗30分钟，然后将洗净的外植体放入培养瓶中，在超净工作台上用75%的酒精表面消毒60秒，然后用无菌水冲洗3次，再用0.1%升汞消毒8分钟，无菌水冲洗3次。

3：接种

在超净工作台上取出已消毒的紫萁孢子切成小段，每段约0.5cm长，接种于孢子萌发琼脂培养基中培养；培养条件：温度23-26℃，光照时间12h/d，光照强度2300-2500 lx。

4：原叶体的增殖培养

将萌发的幼原叶体转接于原叶体增殖琼脂培养基中培养：培养条件：温度23-26℃，光照时间12h/d，光照强度2300-2500 lx。

5：诱导原叶体受精萌发孢子体，

将已增殖的原叶体取出放入装有液体培养基的无菌三角瓶中，在摇床上振荡4-10min（振荡的目的是为了促进原叶体的授精），然后分别取适量的原叶体接入放置有滤纸桥或者棉花的培养瓶中，并倒入20ml的MS液体培养基，放入培养室培养。培养条件：温度23-26℃，光照时间12h/d，光照强度2300-2500 lx。

6：孢子体增殖培养

将萌发的孢子体转接于放置有滤纸桥或者棉花的培养瓶中，并倒入20ml的孢子体增殖液体培养基中培养；培养条件：温度23-26℃，光照时间12h/d，光照强度2300-2500 lx。

本方法有很多优势，曾经有人研究采用仿生态栽培的方法，即无性繁殖的方法和有性繁殖的方法，无性繁殖中将采取的紫萁贯众的根状茎在湿沙中保存，到4月或10月将每段保持1-2个芽的若干段，保持一定量的须根，栽培入土。同时受自然条件的影响较大，不利于紫萁大规模的培养。有性繁殖中培养基是砂石与土壤、草炭土等要严格控制其比例和大棚的温度、湿度、光照和培养基的酸碱度和肥力。这些方法都需要大量的采掘野生蕨类资源作为母种，对于水土保持和野生资源的保护都是不利的，本发明的方法可以大规模培养紫萁试管苗，不需花大量的人力、劳力。对野生资源的采掘非常有限，用几株孢子体就可以繁殖几千上万株试管苗，且不受蚯蚓、蝼蛄等地下害虫的危害，占用场地小，保护野生资源，避免过度采掘，本发明有利于对紫萁的大规模工厂化生产提供条件。

具体实施方式

本发明由以下的实施例加以说明：

材料与方法

材料选取

紫萁孢子体生殖叶植株顶端未成熟的绿色孢子囊穗。

取紫萁孢子囊穗的成熟度为：成熟度Ⅰ是紫萁孢子叶顶端未成熟孢子囊穗，成熟度Ⅱ是稍微展开的紫萁孢子叶中段的黄褐色中等成熟孢子囊穗，成熟度Ⅲ是紫萁孢子叶的最下端的完全展开的深褐色紫萁已成熟孢子囊穗。

诱导孢子体萌发形成原叶体的培养

配制诱导孢子体萌发形成原叶体养基配方为：MS稀释一定浓度添加不同浓度激素的组合琼脂培养基配方，经高压蒸汽灭菌锅灭菌，灭菌条件为高压0.1Kpa，温度为121℃，时间为20min，然后取出待其冷却凝固后备用。

培养方法

将未成熟的紫萁的孢子囊穗剪取放在漏网中，用自来水冲洗30分钟，然后将洗净的紫萁孢子囊穗放入培养瓶中，在超净工作台上用75%的酒精表面消毒60秒，然后用无菌水冲洗3次，再用0.1%升汞消毒8分钟，无菌水冲洗3次。在超净工作台上取出已消毒的紫萁孢子囊穗切成小段，每段约0.5cm长，接种于诱导孢子体萌发形成原叶体的培养基中培养；培养条件：温度25±1℃，光照时间12h/d，光照强度2500 lx。孢子成活率= ( 萌发的孢子数/ 接种的总孢子数) ×100%。

原叶体(配子体)增殖培养

选取萌发的原叶体，接种到原叶体(配子体)增殖培养基配方的培养基中培养。培养基高压蒸汽灭菌备用（灭菌条件为高压0.1Kpa，温度为121℃，时间为20min）。培养条件：温度25±1℃，光照时间12h/d，光照强度2500 lx。培养时间为一个月。

诱导原叶体受精萌发孢子体

培养条件:振荡后在液体MS培养基上培养一个半月至三个半月。

在超净工作台上将继代培养出的原叶体取出接入三角锥瓶中，放在摇床上振荡，振荡时间有5min--10min。然后接种在放有棉花或者滤纸桥的培养瓶中，再加入诱导原叶体受精萌发孢子体液体培养基20mL。培养条件：温度25±1℃，光照时间12h/d，光照强度2500 lx。

孢子体增殖培养

紫萁原叶体大约培养20天左右，表面开始出现绿色原叶体团或原叶体簇。在显微镜下可见孢子体在其中萌发，此时将萌发的孢子体转接于放置有滤纸桥或者棉花的培养瓶中，并倒入20ml的孢子体增殖液体培养基中培养；培养条件：温度23-26℃，光照时间12h/d，光照强度2300-2500 lx。