一种用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的核苷酸序列及检测方法与检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的核苷酸序列及检测方法与检测试剂盒，其中核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，检测方法为首先提取待测样品的基因组DNA；然后以该基因组DNA为模板，与特异性引物Lm16、PCR缓冲液、MgCl

说明书

技术领域

本发明涉及的是食源性致病菌检测技术领域，是一种用于检测单核细胞增生李斯特氏菌 (Listeria monocytogenes，简称单增李斯特菌)的核苷酸序列及检测方法与检测试剂盒。

背景技术

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,LM)是一种人畜共患病的病原菌， 属于李斯特菌属(Listeria spp.)，在自然界中的广泛存在，当牲畜感染后，通过食物链最后 导致人类的感染。据WHO报道，健康人的粪便中单增李斯特菌携带率为0.6％～16％，有 70％的人可短期带菌。人类受感染后可导致胃肠炎、败血症、脑膜炎、流产等疾病，其中 孕妇、婴儿、老年人及免疫力低下者为易感人群，人类感染单增李斯特菌后有高达20％～30％ 的致死率。因此，2002年WHO将单增李斯特菌列为仅次于大肠杆菌O157、沙门氏菌、志 贺氏菌后的第四大重要的食源性致病菌。单增李斯特在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏 食品威胁人类健康的主要病原菌之一。国际国内食品标准规定食品中致病菌不得检出，为 有效控制原菌的发生和扩散，有效控制和预防食品中单增李斯特菌污染至关重要。

目前，单增李斯特菌的检测方法以传统的鉴别培养为基础，通过分离培养、生化反应、 溶血试验、动物试验等进行分离鉴定。实验设备要求不高，可操作性强，但检验周期长， 需6-7d。一些快速单增李斯特菌检测方法除了ELISA法应用于实际检测外，分子生物学方 法大多数处于科学研究阶段，尚未广泛应用。因此单增李斯特菌急需特异性和敏感度高的 快速诊断方法。

发明内容

本发明的目的在于为了克服以上现有技术的不足而提供一种用于检测单核细胞增生李 斯特氏菌的核苷酸序列及检测方法与检测试剂盒；检测试剂盒具有特异性好、灵敏度高、 检测时间短的单核细胞增生李斯特氏菌的特点，提高其检测效率和精确度。

技术方案

一种用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的核苷酸序列，包括1623bp，序列为SEQ ID  NO.1所示。

一种检测检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样品的基因组DNA；

(2)以步骤(1)所提取的基因组DNA为模板，与特异性引物Lm16、PCR缓冲液、MgCl₂溶液、脱氧三磷酸核苷混合物和Taq-DNA聚合酶混合配置PCR反应体系，进行PCR反应；

其中特异性引物Lm16为Lm16F：5’-CTGTTCGTCGGTCCGTGGTA-3’，

                    Lm16R：5’-CAATGCTCTAATGCGGTGGT-3’；

(3)检测PCR产物是否为权利要求1所述的大小为1623bp的单一扩增产物。

以上检测方法的步骤(1)中，提取基因组DNA的方法为分子生物学领域常用方法， 各种市售细菌基因组DNA提取试剂盒均可实现相同提取目的。

在本发明种扩增产物的判定原则为PCR反应之后，通过琼脂糖凝胶电泳检测，若步骤(2) 所得PCR反应扩增产物在1623bp位置有对应产物，则判定结果为阳性，若所得PCR产物 无扩增条带或在1623bp位置无对应产物，则判定结果为阴性。

进一步地，以上所述的检测检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，步骤(2)中PCR 反应体系包括10×PCR buffer，5.0～10.0mM MgCl₂，1.0～2.0mM dNTP，10～20μM引物Lm16F， 10～20μM引物Lm16R，1～10ng/μL基因组DNA，0.5～1U Taq DNA聚合酶，双蒸水补齐至 25μL；PCR反应过程为：①94℃，3min；②94℃，30s；③60℃，30s；④72℃，75s；步骤 ②至④循环35次；⑤72℃，10min；⑥4℃保存。

进一步地，以上所述的检测检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，步骤(3)中PCR 反应产物通过琼脂糖凝胶电泳检测。

一种用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的检测试剂盒，包括特异性引物Lm16、PCR缓 冲液、MgCl₂溶液、脱氧三磷酸核苷混合物和Taq-DNA聚合酶，所述特异性引物Lm16序 列如下：

上游引物Lm16F：5’-CTGTTCGTCGGTCCGTGGTA-3’

下游引物Lm16R：5’-CAATGCTCTAATGCGGTGGT-3’。

进一步地，所述的用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的检测试剂盒，所述试剂盒还包 括含有以上所述的核苷酸序列的单增李斯特氏菌标准菌株的DNA标准品。

进一步地，所述的用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的检测试剂盒，PCR缓冲液为 10×PCR buffer，MgCl₂溶液浓度为5.0～10.0mM，脱氧三磷酸核苷混合物浓度为1.0～2.0mM， 引物Lm16F浓度为10～20μM，引物Lm16R浓度为10～20μM，TaqDNA聚合酶活为0.5～1U。

本发明适用于食品样品，尤其是液态乳制品、新鲜禽肉、水产品及冷冻食品。

有益效果

本发明提供的单核细胞增生李斯特氏菌检测试剂盒及检测方法，具有特异性好、灵敏 度高、抗干扰性强、检测效率高、结果判定简单的优点。

附图说明

图1为实施例1中引物对Lm16以李斯特菌属内六个种为模板进行PCR反应的2％琼脂糖凝 胶电泳检测结果。图中，M:DS 2000DNA marker。CK：空白对照(ddH₂O)。泳道1–16 依次为:单增李斯特菌(CICC21662，CICC21632，CICC21633，CICC21634，CICC21635， CICC21637，CICC21638，CICC21639，CICC21533及CICC21583)，英诺克李斯特菌 (CICC10417，CICC10416)，伊氏李斯特菌(CICC21663)，格氏李斯特菌(CICC21670)， 斯氏李斯特菌(CICC21671)，威氏李斯特菌(CICC21672)。

图2为实施例1中测定基因组检测灵敏度和细胞培养物检测灵敏度的PCR产物2％琼脂糖 凝胶电泳结果。图中，M：DNA ladder I marker。CK：空白对照(ddH₂O)。图(A)对应于 基因组检测灵敏度，泳道1-10分别对应不同基因组DNA浓度：11.9ng/μL，1.19ng/μL，119.0 pg/μL，11.9pg/μL，1.19pg/μL，119.0fg/μL，11.9fg/μL，1.19fg/μL，119.0ag/μL，11.9ag/μL。 图(B)对应于细胞的检测灵敏度，泳道1-10分别对应细胞浓度1.89×10⁹cfu/mL，1.89×10⁸cfu/mL，1.89×10⁷cfu/mL，1.89×10⁶cfu/mL，1.89×10⁵cfu/mL，1.89×10⁴cfu/mL，1.89×10³cfu/mL，189cfu/mL，18.9cfu/mL，1.89cfu/mL。

图3为实施例1中测定抗干扰能力的PCR产物2％琼脂糖凝胶电泳检测结果。M:DS^TM 2000  DNA marker。N:阴性对照(ddH₂O)。图中：泳道1-5对应单增李斯特菌CICC21635和大肠杆 菌O157 CICC21530的混合物，单增李斯特菌CICC21635和肠炎沙门氏菌CMCC50041的 混合物，单增李斯特菌CICC21635和金黄色葡萄球菌ATCC27217的混合物，单增李斯特 菌CICC21635和英诺克李斯特菌CICC10417的混合物，单增李斯特菌和其它四种菌的混合 物。

具体实施方式

下面通过实施例和附图的方式来说明和解释本发明，但本发明并不只是限制在所述的 实施例范围。本实例中，所有引物均交付上海生工生物工程技术服务有限公司合成，所使 用的DNA标准分子量DS^TM 2000DNA marker及DNA ladder I购置广州东盛生物科技有限 公司。

实施例1：对单核细胞增生李斯特菌标准菌株CICC21635的检测

(1)采用本发明的一对引物Lm16对单核细胞增生李斯特菌标准菌株CICC21635进行 PCR检测。

所用引物对Lm16的序列如下：

Lm16F：5’-CTGTTCGTCGGTCCGTGGTA-3’(SEQ ID NO.2)；

Lm16R：5’-CAATGCTCTAATGCGGTGGT-3’(SEQ ID NO.3)。

所对应的PCR扩增产物大小为1623bp。

本发明所使用的PCR反应体系如下：

所述优化的PCR反应体系包括10×PCR buffer，5.0～10.0mM MgCl₂，1.0～2.0mM dNTP， 10～20μM引物Lm16F，10～20μM引物Lm16R，1～10ng/μL基因组DNA，0.5～1U TaqDNA 聚合酶，双蒸水补齐至25μL；所述最适的PCR反应程序为：①94℃，3min；②94℃，30s； ③60℃，30s；④72℃，75s；步骤②至④循环35次；⑤72℃，10min；⑥4℃保存。

在最适的反应条件下，均能够获得单一的，清晰的1623bp大小条带。

因此本发明所建立的PCR检测方法如下：

在PCR反应管中依次加入10×PCR buffer 2.5μL，20mM MgCl₂1.5μL，2.0mM dNTP  1μL，10μM引物Lm16F 1μL，10μM引物Lm16R 1μL，10ng/μL基因组DNA 1μL，1U/μL Taq  DNA聚合酶1μL，其余以双蒸水补齐，总体积为25μL，并设置空白对照。将PCR反应管 放入离心机离心混匀反应体系后，放入PCR仪，按照如下条件进行反应：①94℃，3min； ②94℃，30s；③60℃，30s；④72℃，75s；步骤②至④共35个循环；⑤72℃，10min；⑥4℃ 保存。PCR扩增产物通过2％琼脂糖凝胶电泳检测。图1即为Lm16的PCR检测结果，其 条带大小为1623bp，清晰可见，经测定，该1623bp大小的条带的序列为SEQ ID NO.1所 示。

(2)特异性评价试验

将10株单核细胞增生李斯特菌标准菌株和5株单核细胞增生李斯特菌食品分离株，以 及同属于李斯特菌属的其他5个种标准菌株，接种于BHI培养基中，于37℃，180rpm过 夜培养；取1mL菌液于1.5mL离心管中，按照常规的基因组提取方法提取并纯化基因组 DNA；基因组DNA放置于-20℃备用。5株单核细胞增生李斯特菌食品分离菌株通过生理 生化鉴定到种。表1中所示的李斯特菌属外的其他细菌的基因组DNA提取和纯化类似。本 发明所涉及的菌株均可以通过公开途径获得。

将提取的基因组DNA稀释至10ng/μL后各取1μL作为模板进行PCR反应。反应完毕 之后，2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，根据是否在1623bp处有单一条带来判断结 果为阴性还是阳性。详细的PCR结果见表1。

表1中共涉及41株菌株，李斯特菌属标准菌株共计16株，其中，单核细胞增生李斯 特菌10株，英诺克李斯特菌2株，伊氏李斯特菌、格氏李斯特菌、斯氏李斯特菌和威氏李 斯特菌各1株。单核细胞增生李斯特菌食品分离菌株5株。李斯特菌属外共20株菌株，其 中，沙门氏菌属6株，克诺罗杆菌属6株，大肠杆菌1株，耶尔森氏菌1株，志贺氏菌1 株，金黄色葡萄球菌1株，蜡样芽胞杆菌1株，奇异变形杆菌1株，荧光假单胞菌1株， 副溶血弧菌1株。表1为特异性评价试验的PCR结果，结果表明除单核细胞增生李斯特菌 标准菌株外，其余PCR结果均为阴性，这表明本发明中的检测方法具有较高的特异性。

表1引物特异性评价实验采用的菌株及其PCR结果

表1中+表示PCR结果为阳性；－表示PCR结果为阴性

(3)灵敏度评价试验

A、基因组灵敏度测定

接种单核细胞增生李斯特菌CICC21635标准菌株于BHI培养基中，37℃，180rpm过 夜培养后，提取并纯化基因组DNA。提取的基因组DNA使用超微量核酸测定仪测定其浓 度为11.9ng/μL。10倍梯度稀释基因组DNA，共稀释10个梯度。从各个稀释梯度取2μL基 因组DNA加入总体积为25μL的PCR反应体系，进行PCR反应。PCR反应结束以后，2％ 琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，其结果如图2-A所示。从图中可以看出，泳道8为可 观察到的下限，其对应的浓度为1.19fg/μL，因此判定基因组的最低检测下限为1.19fg/μL， 灵敏度较高。

B、细胞浓度灵敏度测定

接种单核细胞增生李斯特菌标准菌株CICC21635于BHI培养基中，37℃，180rpm过 夜培养后10倍梯度稀释，并通过涂布计数确定其细胞浓度。从细胞浓度10⁹cfu/mL-10⁰cfu/mL10个梯度中各取10mL细胞培养物，采用水煮法提取基因组，其过程如下：12000rpm 离心10min，弃上清，加入200μL TE缓冲液重悬菌体，沸水浴10min后，立即置于-20℃保 存20min，8000rpm离心5min取上清，上清液即为基因组DNA的粗提物。取2μL各个稀 释梯度的基因组DNA粗提物加入25μL的PCR反应体系进行PCR反应。PCR反应结束以 后，2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，其结果如图2-B所示，从图中可以清楚的看出， 泳道10为可观察到的最低下限，对应的细胞浓度为1.89cfu/mL。因此，细胞检测下限为 1.89cfu/mL，灵敏度较好.

(3)抗干扰试验

将单核细胞增生李斯特菌标准菌株CICC21635、大肠杆菌标准菌株CICC21530、肠炎 沙门氏菌CMCC50041、金黄色葡萄球菌ATCC27217和英诺克李斯特菌CICC10417，分别 接种至BHI和LB培养基中，37℃，180rpm过夜培养。按照常规方法提取各菌株基因组DNA， -20℃保存备用。将单核细胞增生李斯特菌基因组DNA分别与大肠杆菌标准菌株 CICC21530、肠炎沙门氏菌CMCC50041、金黄色葡萄球菌ATCC27217和英诺克李斯特菌 CICC10417基因组DNA等量混合，取基因组DNA混合液2μL，作为模板进行PCR反应。 PCR反应结束以后，2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，其电泳结果如图3所示，从图 中可以看出，其他四个菌株与单核细胞增生李斯特菌单独混合及共同混合的情况下，PCR 结果均保持了一致性，且无杂带出现，这说明本发明中的检测方法具有较强的抗干扰能力。

实施例2：单核细胞增生李斯特菌人工污染实验

将单核细胞增生李斯特菌标准菌株CICC21635接种在BHI培养基中，37℃，180rpm 过夜培养。通过梯度稀释和涂布计数计算单核细胞增生李斯特菌的细胞浓度。将不同稀释 梯度的菌液1mL与9mL无菌牛乳混合，使人工污染牛乳的接种量达到10^-1-10³cfu/mL，然 后将不同接种量的人工污染牛乳分别加入90mL BHI培养基中，37℃，180rpm培养。从0h 至12h，每两个小时取一次样，置于在-20℃下保存。使用水煮法提取样品中所含的基因组 DNA。以所提的基因组DNA为模板进行PCR。检测结果见表2。在接种低至1.63×10^-1cfu/mL 单核细胞增生李斯特菌后，经过8h的培养，即可检测到。

表2人工污染牛乳的PCR检测结果

实施例3：使用本发明中的试剂盒进行市售样品检测

按照本发明中优化反应体系所得的最佳体系构建单增李斯特菌检测试剂盒，并以此为 基础进行市售样品检测，以SN/T 1869-2007食品中多种致病菌快速检测方法第一法的普通 PCR法进行对照。

本发明中所构建的试剂盒中主要包括特异性引物对10μM Lm16F和Lm16R各200μL、 10×PCR缓冲液500μL、20mM MgCl₂溶液300μL、2.0mM dNTP 200μL和1U/μL Taq-DNA 聚合酶200μL。本试剂盒理论检测次数为200次。

本发明中构建的试剂盒使用说明如下：

(1)在无菌条件下称取样品25g，加入225mL BHI培养基中，37℃，180rrpm过夜培养。

(2)对于上述培养的增菌液，可直接取该增菌液1mL加到无菌小离心管中，12000rpm离 心10min，尽量倒尽上清液；加入200μL TE缓冲液，混匀后沸水浴10min，12000rpm离心 10min，取上清保存于-20℃备用待检测。-70℃可长期保存。也可使用等效的商业化DNA 提取试剂盒并按其商品说明提取制备模板DNA。

(3)按照以下体系和参数进行PCR：

表3PCR检测反应体系

将PCR反应管放入离心机离心混匀反应体系后，放入PCR仪，按照如下条件进行反应： ①94℃，3min；②94℃，30s；③60℃，30s；④72℃，75s；步骤②至④共35个循环；⑤72℃， 10min；⑥4℃保存。

(4)PCR产物通过2％琼脂糖凝胶电泳检测，并在凝胶成像系统中观察是否存在大小为 1623bp的扩增条带，若存在，即为阳性；若不存在，则为阴性。

65份样品均购置于南京各大超市，按照本发明中试剂盒的使用说明和SN/T 1869-2007 食品中多种致病菌快速检测方法第一法的普通PCR法进行对照检测，检测结果见表4。

表4行业标准检测方法和本发明中试剂盒对市售样品的检测结果

如表4中所示，行业标准检测方法共检出13个样品呈单增李斯特菌阳性，而本发明中 所构建的试剂盒，共检出12个单增李斯特菌阳性样品。两者结果基本一致，说明本发明中 试剂盒检测结果具有较好的可靠性。

序列表

<110>  南京农业大学

<120>  一种用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的核苷酸序列及检测方法与检测试剂盒

<130>  1

<160>  3    

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  1623

<212>  DNA

<213>  核苷酸序列

<400>  1

ctgttcgtcg gtccgtggta tacacaaacc gatagcttgt tagttaaaac agaagctgtg     60

attcgcaact tactttatgg ttataaaatg ggcgaagaat tcggccatag catgagtatc    120

ggttattccc cagatatttt tgggcaacat gcttatctgc cagctattta taaatcattt    180

aatatggagc atagcatttt ccagcgtggt gtttataacg atcaagtgca agatgacctt    240

aacttccact ggacatctcc agacaacaag tccatcccaa ccaacaatat tttcttcggt    300

tatggacccg gcaaattttt aagcagtgaa aaaagctatg tagaaactcg tcttctgcca    360

attttagatc gacttgctga aatgaacaca catacagatg tccttctttt accagcaggc    420

ggcgaccaag tacttgtgcg cgaaaacttc ccagaaattg tcgcggaatt gaacgagatg    480

gacttaggtt ataccttcat tctgtccgat tacgaagcat ttatgaatga tgcttggact    540

tctactttcc cgaacgaaat cactggtgaa ctgcttgctt gccaaaaatc acgaatccac    600

catacatgtc gttcagaacg ctacgatatt aaacgtctta attacttagt agaaaataga    660

ttagtcaaca ttctagaacc acttgcaaca atggccaata aattcggaat caaatatcct    720

aaaccttggt tagatattat ttggaaaaaa ttatttgata gccacgctca taacggtatt    780

ggtgcttcaa attcagatga cgcaaaccat gacatcgtag ttcggctaac tagcgcactt    840

cggatgacag atggcttaat taaccttttg aaaaaacaaa ttacgaaggc cgttagtcag    900

caaatgggcg acgaaaatat tgcgctatta ttcaatacta acccagtggc agaagaaaga    960

actgcaaaac taacattatt cactcctgaa aaatcattcc aactgttctc aggtgatgcg   1020

gaagtgactt tcagcgttgt acatcaagaa aaattagacg gtggacggaa agtaatcgta   1080

actgcaaaag gcgaaaaaga agttgctgtt cctgattatt atcgtacaga aatctacttg   1140

aaaagcggcc taatccctgc acttggttac aaaacattgc aagtgaaagc cgttactaca   1200

gaaatggacc aattaatcag catttccaaa caaacaattg aaaatgaaaa aatcattgtt   1260

caattcgaaa acgggaaaat caatctttta aataaagaac aacaaagcat tataaatgac   1320

cttattcgct tcgaaaatgt ggctgacgct ggggattctt ttgacttctc accacttgaa   1380

ggcgaccaag ccatctatat cgaaacaagc gaattactaa ccgttgaaaa aaatcatcta   1440

tatagcaaaa tgatgttaaa acatactgct ttagttccga aagatttaga agcccgcgca   1500

caaaaaacaa gtacagaaac atttgaaatt ttaacagaaa tcgaactttt tgacggtgaa   1560

gaattcgtcc gtgttcgcca tactattgac aataaagtaa aagaccaccg cattagagca   1620

ttg                                                                 1623

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  2

ctgttcgtcg gtccgtggta                                                 20

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  3

caatgctcta atgcggtggt                                                 20