利用膜分离技术高效制备一类不均一性安络小皮伞多糖的方法

摘要

本发明公开了利用膜分离技术高效制备一类不均一性安络小皮伞多糖的方法，按照以下步骤进行：一、深层发酵后得到发酵液；二、将发酵液冷冻干燥至恒质量，粉碎机破碎，过60目筛；三、恒温水浴锅浸提；四、无机陶瓷微滤膜浓缩纯化；五、通过截留分子量为4000～9000k的无机陶瓷超滤膜浓缩纯化；六、将步骤五中的不均一性安络小皮伞类多糖溶液用sevage液去除蛋白；七、将步骤六中的不均一性安络小皮伞类多糖溶液经喷雾干燥制成粉末，即得到不均一性安络小皮伞类多糖产品，喷雾干燥的进口温度为170～210℃，出口温度为80～95℃。本发明的制作方法成本低，制作得到的产品质量好，保质期长，密封条件下可保存2年以上不变质。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用膜分离技术从发酵液中分离提取浓缩一类不均一性安络小皮 伞多糖的方法。

背景技术

中国农产品每年因作物病害减产数十亿吨，防治农作物病害对保障国民经济的稳定 发展和不断提高人民生活水平具有重要的意义。使用化学农药是减少作物病害损失的有 效手段，但由于大量使用、滥用以及农药的不可降解性，造成环境污染、生态破坏、食 品污染及人畜毒等事件频发，并导致严重的3R(残留、抗性、再增猖獗)问题。水稻稻 瘟病是全世界稻区危害最严重的水稻病害之一，一般造成水稻减产10％--20％。以我国 为例，20世纪90年代以来，该病的年发生面积均在380万公顷以上，年损失稻谷达数亿 千克。由于稻瘟病菌小种构成复杂，而且变化很快，易导致水稻抗病品种丧失，稻瘟病 菌的多变性也常使其抗农药性发展迅速，因此筛选一种新的杀菌剂是十分必要的。

真菌多糖一般是指各种真菌的子实体和类所产生的一类代谢产物，通常是极性大分 子化合物，能够控制细胞分裂分化，调节细胞生长衰老的一类活性多糖，被誉为21世 纪的健康卫士。与动、植物多糖不同的是真菌多糖分子单体之间，大多以β(1→3)与 β(1→6)糖苷键结合，形成链状分子，具有螺旋状的立体构型。多糖又分为均一性多 糖和不均一性多糖两类。(1)均一性多糖：一般由10个以上的同一种单糖通过糖苷键 连接而成，可分为直链结构，也可有分支结构。(2)不均一性多糖：是由不同单糖分 子缩合而成的多糖，除含有糖链外，还可含有肽链或脂类成份。大部分的多糖都属于不 均一性多糖。安络小皮伞类多糖是安络小皮伞的重要活性成分，它的药用价值较高，我 国民间用它的菌丝来治疗跌打损伤、骨折疼痛、坐骨神经痛、偏头痛、麻风性神经痛和 风湿关节痛等，但是对于防治作物病害方面国内外报道的很少。本课题组通过研究发现 不均一性安络小皮伞类多糖是一个高效、杀菌谱广、对作物和肺靶标生物以及环境安全 的真菌多糖，尤其对稻瘟病菌有良好的防效，经多次试验证明对稻瘟病菌的菌丝生长的 抑制率高达93.5％。

目前多糖提取工艺一般多采用水浴、酶提和层析、精馏、重结晶等工艺过程，其缺 点：一、是工艺繁琐、温度、时间要求特定。二、是没有进行有效组分提纯或生产中无 法实现组分提纯，多是以杂多糖形成制品，其产品中无效的糟粕成分较多、有效功效低， 这局限了其在制药方面的开发和利用。三、是现有工艺成本高，功效低，难以规模化生 产。四、是现有工艺处理步骤中用到的一些化学药品，其既浪费资源，又污染环境，而 且对产品的有效成分还有一定程度的破坏。膜分离技术是国际上公认的20世纪 末至21世纪中期最有发展前途的前沿技术。膜分离是以选择性透过膜为分离介质，当 膜两侧存在推动力时，原料的组分可透过选择膜而对混合物进行分离、提纯、浓缩的一 种分离过程。膜分离技术是当今世界一项先进的精细分离技术，膜技术的分离孔径从纳 米级至微米级，能把一切物质分离开，它的分离比以重力为基础的离心机收得率高30％ 以上。因此，本项目以该技术为基础原理的所研发的一类不均一性安络小皮伞类多糖发 酵后的安络小皮伞类多糖制备工艺具有比以滤布为介质的板框等分离精度高一个数量 级；比化学萃取工序简单，无相变、无污染；比蒸馏分离、蒸发浓缩能耗低80％～90％等 优点。

发明内容

本发明的目的是解决现有的一类不均一性安络小皮伞类多糖制作方法存在的制作 工艺复杂成本高及制作得到的多糖含量低、发酵液杂质多以及使用化学药品对产品的有 效成分造成破坏等。本发明提供一种利用膜分离技术浓缩纯化一类不均一性安络小皮伞 类多糖制作方法。用以解决现有技术中存在的劳动强度大、生产效率低、环境污染严重、 生产成本高、产品质量差、产品收率低等问题。本发明的膜材料是陶瓷无机膜。本发明 所用的陶瓷无机膜与高聚物分离膜相比优点是：(1)热稳定好，适用于高温、高压体 系。试用温度一般都可以达到400℃，有时可以高达800℃。(2)化学稳定性好，能 耐酸和弱碱，pH值试用范围宽。(3)抗微生物能力强，与一般微生物不发生生化及化学 反应。(4)陶瓷膜组件机械强度大。(5)清洁状态好。本身无毒，不会使被分离体系受到 污染。容易再生和清洗。当膜污染被堵塞后、可以进行反吹及冲洗，也可以在高温下进 行化学清洗。(6)陶瓷膜的孔分布窄，分离性能好。

本发明一种利用膜分离技术从发酵液中分离提取浓缩一类不均一性真菌多糖的芽 孢的方法，按照以下步骤进行：一、将产安络小皮伞类多糖的安络小皮伞经深层发酵后 得到发酵液；二、将步骤一中的发酵液冷冻干燥至恒质量，粉碎机破碎，过60目筛；三、 将步骤二中的类干粉加蒸馏水在70℃恒温水浴锅浸提2h；四、将步骤三中的浸提液在操 作温度为25～45℃、膜通量为50～60LMH条件下，经过截留分子量为0.01～0.03um的无机陶 瓷微滤膜和微滤技术来浓缩纯化浸提液中不均一性安络小皮伞类多糖，通过的溶液为安 络小皮伞类多糖溶液，不均一性安络小皮伞类多糖浓缩倍数为6～7倍；五、将步骤四中 的不均一性安络小皮伞类多糖溶液在操作温度为25～45℃、膜通量为35～45LMH条件下通 过截留分子量为4000～9000k的无机陶瓷超滤膜和超滤技术来浓缩纯化浸提液中不均一 性安络小皮伞类多糖，其中被截留的在膜的近侧液的溶液为不均一性安络小皮伞类多糖 溶液，不均一性安络小皮伞类多糖浓缩倍数为10～15倍；六、将步骤五中的不均一性安 络小皮伞类多糖溶液用sevage液去除蛋白；七、将步骤六中的不均一性安络小皮伞类多 糖溶液经喷雾干燥制成粉末，即得到不均一性安络小皮伞类多糖，喷雾干燥的进口温度 为170～210℃，出口温度为80～95℃。

本发明的方法中的膜过滤技术自动化程度高，操作简单，减少了人力成本且不需要 使用过滤剂进行过滤，本发明的制作方法成本低。本发明制作得到不均一性安络小皮伞 类多糖杀菌剂中安络小皮伞类多糖含量高，制作得到的小皮伞真菌多糖杀菌剂不易吸 潮，保质期长。

附图说明

图1利用膜分离技术高效制备一类不均一性安络小皮伞多糖的工艺生产流程框图。

具体实施方式

以下结合具体实施方式，对本发明进行详细说明。

具体实施方式一：

本实施方式一种膜分离技术从发酵液中分离提取浓缩一类不均一性小皮伞真菌多 糖的方法按照以下步骤进行：

一、将产安络小皮伞类多糖的安络小皮伞经深层发酵后得到发酵液；

二、将步骤一中的发酵液冷冻干燥至恒质量，粉碎机破碎，过60目筛；

三、将步骤二中的类干粉加蒸馏水在70℃恒温水浴锅浸提2h；

四、将步骤三中的浸提液在操作温度为25-45℃、膜通量为50-60LMH条件下，经过 截留分子量为0.01-0.03um的无机陶瓷微滤膜来浓缩纯化浸提液中不均一性安络小皮伞 类多糖，通过的溶液为安络小皮伞类多糖溶液，不均一性安络小皮伞类多糖浓缩倍数为 6-7倍；被截留的在膜的近侧液的溶液中主要成分为类和不溶性物等。

五、将步骤四中的不均一性安络小皮伞类多糖溶液在操作温度为25-45℃、膜通量 为35-45LMH条件下通过截留分子量为4000-9000k的无机陶瓷超滤膜来浓缩纯化浸提液 中不均一性安络小皮伞类多糖，其中被截留的在膜的近侧液的溶液为不均一性安络小皮 伞类多糖溶液，不均一性安络小皮伞类多糖浓缩倍数为10-15倍；通过的溶液为盐、氨 基酸等一些小分子物质。

六、将步骤五中的不均一性安络小皮伞类多糖溶液用sevage液去除蛋白；

七、将步骤六中的不均一性安络小皮伞类多糖溶液经喷雾干燥制成粉末，即得到不 均一性安络小皮伞类多糖杀菌剂，喷雾干燥的进口温度为170～210℃，出口温度为80～95 ℃。

本实施方式得到的一类不均一性安络小皮伞类多糖的保质期为2年以上。

本实施方式得到的一类不均一性安络小皮伞类多糖的分子量为180万。13CNMR谱测定：

表1一类不均一性安络小皮伞类多糖的化学移植

表2一类不均一性安络小皮伞类多糖的C-1区解析

表3一类不均一性安络小皮伞类多糖的C-6区解析

表4一类不均一性安络小皮伞类多糖取代后的C-2、C-3、C-4区解析

具体实施方式二：

本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中将一类不均一性小皮伞接种到发 酵罐中进行发酵培养，发酵温度为为25-28℃，发酵时间为60-70h。其它步骤及参数与 具体实施方式一相同。

具体实施方式三：

本实施方式与具体实施方式一或二不同的是步骤四中小皮伞类多糖溶液浓缩倍数 为7倍。其它步骤及参数与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：

本实施方式与具体实施方式三不同的是步骤四中滤液通过截留分子量为0.02um的 微滤膜过滤。其它步骤及参数与具体实施方式三相同。

具体实施方式五：

本实施方式与具体实施方式四不同的是步骤五中小皮伞类多糖溶液浓缩倍数为14 倍。其它步骤及参数与具体实施方式四相同。

具体实施方式六：

本实施方式与具体实施方式五不同的是步骤五中滤液通过截留分子量为7000k的超 滤膜过滤。其它步骤及参数与具体实施方式五相同。

具体实施方式七：

本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤七中喷雾干燥的进口温度为180℃，出 口温度为75℃。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式八：

本实施方式与具体实施方式二不同的是一类不均一性小皮伞接种到发酵罐中进行 发酵培养，发酵温度为28℃，发酵时间为70h。其它步骤及参数与具体实施方式二相同。

具体实施方式九：

本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤五中将发酵液通过截留分子量为 5000～8000k的超滤膜过滤。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式十：

不均一性安络小皮伞类多糖的防治效果，采用抑菌圈法：首先刮取病原菌孢子制成 孢悬液，将孢悬液(1×10⁶个/mL)与融化并冷却至45℃左右的PDA培养基混匀，制平 板。不均一性安络小皮伞类多糖点接于病原菌平板上，28℃培养72h，观测抑菌圈。 也可将不均一性安络小皮伞类多糖和病原菌成十字交叉排列(病原菌在十字的中央，不 均一性安络小皮伞类多糖在十字的两端)。培养3-4天后，观察抑菌圈大小。得出的结 果见表5和表6。

表5不均一性安络小皮伞类多糖的抑菌谱测定结果

  供试病原菌   抑菌强度   供试病原菌   抑菌强度   稻瘟病菌   ++++   烟草赤星病菌   ++   番茄灰霉病菌   +++   梨黑星病菌   ++   番茄叶霉病菌   +   小麦赤霉病菌   +   番茄枯萎病菌   +++   小麦全蚀病菌   +++   番茄早疫病菌   +++   小麦根腐病菌   ++   玉米大斑病菌   +   白菜软腐病菌   +   黄瓜枯萎病菌   +++   茄青枯病菌   +

注：表中每增加一个“+”表示抑制率增加20～25％，“0”表示无明显相关性。

由表5结果可以看出，本发明方法所得的不均一性安络小皮伞类多糖的抑菌谱较广， 对多种病原菌均有很高的拮抗活性，对稻瘟病菌、番茄枯萎病菌、番茄早疫病菌、黄瓜 枯萎病菌及小麦全蚀病菌的抑制效果均达90％以上；对番茄灰霉病菌、烟草赤星病菌、 梨黑星病菌及小麦根腐病菌的抑制率均在60％以上；对番茄叶霉病菌、玉米大斑病菌、 小麦赤霉病菌和茄青枯病菌也有一定的拮抗作用。

表6不均一性安络小皮伞类多糖对不同病原真菌菌丝生长的抑制率(％)

  病原真菌   抑制率   病原真菌   抑制率   稻瘟病菌   93.5   番茄灰霉病菌   91.6   梨黑星病菌   91.26   苹果霉心GL1222   88.05   苹果轮纹病菌   90.47   苹果霉心GL0812   87.45   杨树溃疡病菌   90.55   苹果腐烂病菌   90.75   小麦赤霉病菌   87.34   辣椒疫霉病菌   79.67   棉花枯萎病菌   88.24   小麦根腐病菌   90.63

由表6结果可以看出，本发明方法所得的不均一性安络小皮伞类多糖对病原真菌抑 制作用最强，对稻瘟病菌、番茄灰霉病菌、辣椒疫霉病菌、小麦赤霉病菌、梨黑星病菌 和苹果轮纹病菌等几个病原真菌的抑制菌丝生长作用均在90％以上。

具体实施方式十：

不均一性安络小皮伞类多糖的发酵工艺：

(1)试管斜面培养：在试管内培养斜面菌种

培养基：PDA培养基加5％(重量百分比)的麸皮汁；

培养条件：培养温度26℃，培养时间8天，pH6.5。

(2)摇瓶种子培养

种子培养基(g/L)：玉米粉10，蛋白胨2，黄豆饼粉3，蔗糖20，KH₂PO₄2，MgSO₄.7H₂O 1，VB₁0.1；

培养条件：将以活化的斜面菌种接种于液体种子培养基，500ml三角瓶装液量100ml， 旋转式摇床培养，转速160rev/min，培养温度26℃，pH6.5，培养时间8天。

(3)发酵罐培养

发酵培养基(g/L)：玉米粉20，黄豆饼3，KH₂PO₄3，MgSO₄.7H₂O 0.2，VB₁0.1pH6.0。

培养条件：将培养好的种子培养基按10％(v/v)的接种量接入装有发酵培养基的全 自动发酵罐中，搅拌转速200rev/min，发酵温度26℃，通气量3L/min，发酵时间为65 小时。该培养基缓冲体系的构成为有机酸-有机酸盐系统，可以是苹果酸-苹果酸钠、柠 檬酸-柠檬酸钠、乳酸-乳酸按或草酸-草酸铵的一种或数种。构成缓冲体系的物质占培 养基总量的比例为10-50％(V/V)。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。