使用过氧化物氧化还原酶1(PRX1)作为佐剂的方法和组合物

摘要

本发明提供用于激发针对抗原的免疫反应的组合物和方法。该组合物包括抗原和分离的Prx1蛋白，该抗原激发所需要的免疫反应。Prx1蛋白作为佐剂起作用以使这种包含抗原与Prx1的组合物激发的对该抗原的免疫反应强于仅用该抗原激发的免疫反应。

说明书

相关申请的交叉参考

本申请要求2009年12月8日提交的美国专利申请61/267,647的优先权， 将其揭示的内容通过引用纳入本文。

技术领域

本发明总体上涉及免疫治疗领域，更明确而言，本发明涉及使用Prx1作 为佐剂来增强针对抗原的免疫反应。

发明背景

Prx1是典型的2-半胱氨酸过氧化物氧化还原酶家族的一员，其主要的胞 内功能是通过其过氧化物酶的活性作为过氧化氢信号通路的调控因子和作为 蛋白质的伴侣蛋白。Prx1的表达在各种癌症中会上调，包括食管癌、胰腺癌、 肺癌、甲状腺滤泡癌和口腔癌。Prx1水平的升高与临床结果不理想和病人整体 存活情况降低相关。最近的研究证实Prx1可以由非小细胞肺癌细胞分泌，该 分泌可能通过一种非经典的分泌途径。然而，分泌的Prx1的作用至今尚未知 晓，之前也未就治疗目的加以探索。

发明内容

本发明提供了用于激发免疫反应的组合物和方法。这种组合物包括抗原和 分离的Prx1蛋白。抗原和Prx1蛋白可以以复合物的形式提供，或者它们可以 彼此共价连接。Prx1蛋白在复合物中可以以多聚体的形式存在。在一个实施方 式中，所述多聚体是十聚体。组合物还可以包括接触过抗原和/或Prx1蛋白的 抗原呈递细胞。

抗原可以是用于激发所需要的免疫反应的任何抗原，包括但不限于传染源 或癌细胞表达的抗原。在一个实施方式中，抗原由肿瘤细胞表达。

在个体中激发针对抗原的免疫反应的方法包括给予该个体包含该抗原和 分离的Prx1蛋白的组合物。所激发的免疫反应可强于该抗原在不给予分离的 Prx1蛋白时所激发的免疫反应。激发的免疫反应可包括细胞介导的免疫反应、 体液免疫及其组合。

在一个实施方式中，激发针对抗原的免疫反应的个体是有风险发生、被怀 疑患有或已经诊断患有癌症的个体。

附图简要说明

图1.Prx1刺激巨噬细胞分泌细胞因子

(A)采用流式细胞仪检测TG诱出的巨噬细胞所表达的CD11b、Gr1和 F4/80。示出3次独立分离的代表性柱状图，显示CD11b⁺细胞的Gr1和F4/80 的表达情况。插入框中的数字表明是每个象限中CD11b⁺细胞的百分比。(B)将 TG诱出的巨噬细胞和刺激物共同培养24小时，收获上清液后分析TNF-α(空 心柱)和IL-6(灰色柱)的水平。结果以pg/ml为单位，代表了三组独立试验，误 差线代表标准差。(C)将TG诱出的巨噬细胞分别如下培养24小时：仅用培养 基(黑色柱)；用100nM LPS或2000nM Prx1(空心柱)；用100nM LPS或2000 nM Prx1，经10ug/mL多粘菌素B预孵育20分钟(阴影线柱)；100nM LPS或 变性的2000nM Prx1(灰色柱)。星号表示与仅用Prx1或LPS处理过的细胞相 比p≤0.01。(D)将TG诱出的巨噬细胞分别以单独的培养基、Prx1(50nM)或 LPS(100nM)培养24小时，灰色柱表示培养时添加10%的FBS，空心柱表示 未添加10%的FBS。收获上清液，并分析IL-6的水平。结果以pg/ml为单位， 误差线代表标准差。

图2.Prx1刺激树突状细胞的成熟与激活。(A和B)将未成熟的骨髓来源 的树突状细胞(iBMDC)分别以单独的培养基、20-200nM Prx1或100nM LPS 培养24小时。(A)培养后，通过流式细胞仪分析细胞中CD11c和CD86的表 达情况。结果显示为占所有细胞的百分比，误差线代表标准差。(B)收获上清 液，并对TNF-α进行分析。结果以pg/ml为单位，代表三组独立实验，误差线 代表标准差。(C)将TG诱出的巨噬细胞与如下培养基共同培养：收获自培养 转染有编码对照shRNA(乱序，Scramble)或Prx1特异性shRNA(shPrx1)的cDNA 的前列腺肿瘤细胞系的培养基，或者是收获自培养表达Prx1特异性shRNA的 细胞的培养基(其中添加了50nM外源性的Prx1，shPrx1+Prx1)。培养24小时 后收获上清液，对TNF-α进行分析。结果以pg/ml为单位，代表三组独立试验， 误差线代表标准差。

**：P≤0.01，与仅用培养基培养的细胞所分泌的TNF-α水平相比；##： P≤0.01，与用获自表达对照shRNA的细胞的培养基培养的细胞所分泌的 TNF-α水平相比；与用获自表达Prx1特异性shRNA的细胞的培 养基培养的细胞所分泌的TNF-α水平相比。

图3.Prx1诱导的细胞因子分泌依赖于TLR4。

(A)从C57BL/6小鼠(TLR4^+/+;空心柱)和C57BL/10ScNJ小鼠(TLR4^-/-；实 心柱)分离得到iBMDC，分别用200nM Prx1、100nM LPS或100mM Pam₃Cys 激发。收集上清液，用IL-6ELISA试剂盒分析。(B)从C57BL/6小鼠(TLR4^+/+; 空心柱)和C57BL/10ScNJ小鼠(TLR4^-/-;实心柱)分离得到TG诱出的巨噬细 胞，分别用200nM Prx1、100nM LPS或100mM Pam₃Cys激发。收集上清液， 用IL-6ELISA试剂盒分析。结果以pg/ml为单位；误差线代表标准差，星号表 示P值小于0.01。(C)向未处理的C57BL/6(TLR4^+/+;空心柱)小鼠和 C57BL/10ScNJ(TLR4^-/-;实心柱)小鼠腹腔内注射200nm的Prx1。6小时后， 采集血样，用ELISA分析IL-6的存在。结果以pg/ml为单位；误差线代表标 准差，星号表示P≤0.0002。

图4：Prx1和TLR4的相互作用依赖于CD14和MD2。(A)从C57BL/6 小鼠中分离得到TG诱出的巨噬细胞，在存在或不存在对照或针对Prx1、 CD14或MD2的封闭抗体的情况下用50nM Prx1刺激24小时。收集上清液， 用IL-6ELISA试剂盒分析。结果以pg/ml为单位；误差线代表SEM，星号表 示P值小于0.01。(B)收获TG诱出的巨噬细胞，如材料和方法中所述，用针 对TLR4、TLR2和小鼠/山羊IgG的抗体沉淀细胞裂解物；所得沉淀物经 SDS-PAGE分离并通过蛋白质印迹分析检测Prx1的存在。还用TLR4或TLR2 的抗体检测印迹以作为内参照。(C)收获TG诱出的巨噬细胞，如材料和方法 中所述，将细胞裂解物与针对TLR4或小鼠/山羊IgG的抗体共孵育；所得沉淀 物经SDS-PAGE分离并通过蛋白质印迹分析检测Prx1、CD14和MD2的存在。 还用TLR4抗体检测印迹以作为内参照。

图5：TLR4/Prx1相互作用的动力学。(A)TG诱出的巨噬细胞经200nM 的FITC-Prx1或PE连接的抗TLR4(PE-TLR4)激发。在指定的时间收集样品。 样品和细胞群体通过安尼斯(Amnis)技术分析。图示为在每个时间点下，代表 性的免疫染色细胞和两种染色合并后的图像。最右边的柱状图为通过所分析的 每个细胞的像素统计分析(n=5,000)得出的像素柱状图，其中y轴表示的是细胞 的数目，x轴表示的是Prx1和TLR4之间的相似系数。(B)图示为每个时间点 所有细胞的平均相似系数；误差线表示标准差。

图6.Prx1结合TLR4是结构依赖性。(A)从TLR4^+/+(白色柱)或TLR4^-/-巨噬细胞(实心柱)中分离得到TG诱出的巨噬细胞，然后分别与培养基(无添 加)、200nM的Prx1、200nM的Prx1C52S或200nM的Prx1C83S培养24小时， 收获上清液，分析TNF-α和IL-6的存在。(B)从TLR4^+/+(白色柱)或TLR4^-/-巨 噬细胞(实心柱)中分离得到TG诱出的巨噬细胞，与2000nM的FITC标记的 蛋白质共同培养20分钟，然后用流式细胞仪分析。通过去除7-AAD高表达的 细胞群选取活细胞用于分析。结果经归一化处理，以除去FITC标记中的差异， 结果以每nM蛋白质中的MFI/FITC表示，误差线表示标准差。星号表示P≤ 0.01。(C)TG诱出的巨噬细胞分别与各种浓度的FITC-BSA(正方形)、Prx1(黑 色圆圈)、Prx1C52S(灰色圆圈)和Prx1C83S(空心圆圈)共同培养20分钟，并用 流式细胞仪分析。结果经归一化处理，以除去FITC标记中的差异，结果以每 nM蛋白质中的MFI/FITC表示。每条曲线代表三次独立试验。(D)将TG诱出 的巨噬细胞与1000nM的Prx1共培养，清洗后与递增浓度的如下竞争剂共培 养：OVA(正方形)、Prx1(黑色圆圈)、Prx1C52S(灰色圆圈)、Prx1C83S(空心圆 圈)。结果以对于无竞争剂情况下FITC-Prx1的MFI百分比形式表示；误差线 表示标准差。所有的实验都进行三次，综合后的结果如图所示。

图7.Prx1刺激巨噬细胞依赖于MyD88并导致NFκB的核易位。

(A)包含对照(空心柱)或MyD88DN(实心柱)表达质粒的RAW264.7巨噬 细胞系的稳定感染子用100nM LPS或1000nM Prx1激发24小时，用ELISA 分析得到的上清液中IL-6的表达。在三组独立实验中进行了ELISA分析；误 差线表示标准差。星号表示P值≤0.001。(B)从C3H/HeNCr(TLR4^+/+)和 C3H/HeNJ(TLR4^-/-)小鼠中分离得到TG诱出的巨噬细胞，在完全培养基中用 200nM Prx1激发。在指定的时间点，用FITC连接的抗NFκB p65抗体和 DRAQ5(核染剂)染细胞10分钟，然后用安尼斯(Amnis)技术进行分析。最右边 的柱形显示了基于NFκB和核染色相似性的逐像素统计分析。(C)在每个时间点 下，在C3H/HeNCr(实心圆圈)和C3H/HeNJ(空心圆圈)巨噬细胞中的的总体相 似系数的平均数值；误差线代表标准差。(D)将TG诱出的巨噬细胞与特定浓度 的Prx1共孵育1小时。按照实施例1所述进行EMSA分析。

图8.在PC-3M细胞中表达Prx1特异性shRNA导致Prx1的表达减少。 (A)用凝胶电泳分离从表达对照(乱序)shRNA或Prx1特异性shRNA(shPrx1)的 基因工程化PC-3M细胞(右图)中得到的细胞裂解物，用Prx1特异性抗体进行 印迹和探测。(B)表达Prx1特异性shRNA导致Prx1水平的降低。收获表达对 照shRNA(乱序)或Prx1特异性shRNA的基因工程化PC3-M细胞系，用蛋白 质印迹分析Prx1或Prx2的表达。(C)Prx1激发的TG诱出巨噬细胞分泌IL-6 依赖于CD14和MD2，其中CD14和MD2是TLR4的辅因子。从C57BL/6小 鼠中分离得到TG诱出的巨噬细胞，在存在或不存在对照或者针对CD14或 MD2的封闭抗体的情况下用LPS激发24小时。收获上清液后用IL-6ELISA 试剂盒分析。结果以pg/ml为单位，误差线代表标准差。

图9提供了用于显示动物模型中Prx1抗肿瘤的佐剂效果的图示。

发明描述

本发明是基于以下意想不到的发现：过氧化物氧化还原酶1(Prx1)是Toll 样受体4(TLR4)的配体，并且Prx1的这种功能使得它能作为一种佐剂。本发明 提供增强个体中针对抗原的免疫反应的组合物及方法。该组合物包括分离的 Prx1和抗原。Prx1的氨基酸序列及其DNA和RNA编码序列是本领域技术人 员所熟知的。在一个实施方式中，分离的Prx1蛋白以十聚体的方式提供。这 种分离的Prx1蛋白可包括191个氨基酸的序列或者由191个氨基酸的序列所 组成，这种包括191个氨基酸的序列或由191个氨基酸的序列所组成的蛋白质 具有过氧化物氧化还原酶的活性。在一个实施方式中，Prx1蛋白含有2009年 8月23日登入的NCBI参考序列:NP 859047.1所示的氨基酸序列，该序列通 过引用纳入本文。据信任何的剪接变体和/或Prx1异构体都可以用在本发明中。

本发明的方法包括给予个体该组合物从而激发抗该抗原的免疫反应。这种 激发的免疫反应可具有治疗或预防的效果，可包括细胞介导的反应和/或体液反 应，或其组合。这样激发的免疫反应可强于用单独的抗原激发的免疫反应。

Prx1是一种在大多数细胞类型中都存在的抗氧化剂和伴侣蛋白分子，并 由转化的和活化的细胞分泌。TLR4是Toll样受体(TLR)家族的一员。TLR与 其配体的相互作用启动炎症介质(如促炎细胞因子)的释放以及启动免疫反应细 胞的成熟/活化。炎症和免疫细胞的成熟/活化对于抗原特异性免疫(包括抗肿瘤 免疫)的诱导都是必不可少的。在本领域中，能够触发炎症和免疫细胞成熟/活 化的试剂被称为佐剂。在此，我们证明Prx1与负责诱导抗原特异的免疫反应 的免疫细胞(例如树突状细胞和巨噬细胞)表面上表达的TLR4相互作用。我们 还证明，Prx1和TLR4的相互作用导致产生树突状细胞和巨噬细胞的成熟/活 化并导致分泌促炎细胞因子。因此，认为Prx1是免疫佐剂。重要的是，我们 证实向抗肿瘤疫苗中添加Prx1增强了疫苗在动物中所起的效果。就此，用许 多TLR激动剂来改善抗肿瘤免疫，包括TLR9激动剂CpG基序和TLR7激动 剂咪喹莫特。CpG基序是包含未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤和侧翼核苷酸的DNA 寡脱氧核苷酸序列(ODN)，可以与TLR9相结合。咪喹莫特[1-(2-甲基丙基)-1H- 咪唑并[4,5-c]喹啉-4胺；AlderaTM;R-837,S26308]是合成的TLR7激动剂，其 可以诱导DCs28的成熟与迁移，IFN-α、TNF-α、IL-1α、IL-6、IL-12和IL-8 的表达，以及增强CD8+T细胞的活化。咪喹莫特已成功用于治疗基底细胞癌， 最近的一项临床试验显示局部应用咪喹莫特可以有效清除0期的黑素瘤。这两 种TLR激动剂都已列入美国国家癌症研究所(NCI)进一步开发作为抗癌疫苗用 佐剂的优先列表。

Prx1显示很多与CpG和咪喹莫特相同的活性，然而，Prx1所结合的受体 TLR4的表达比与CpG和咪喹莫特相作用的TLR更广泛。因此，Prx1有成为 更有效的抗癌疫苗佐剂的潜力。

预期本发明可以用于激发任何抗原所引起的免疫反应，因此，该抗原可以 作为免疫源起作用。抗原包括但不限于：蛋白质、多肽或肽抗原。这种抗原可 能已被充分表征，或者可能还未知，除了已知或者怀疑存在于(例如)细胞裂解 物内的抗原，所述细胞裂解物来自包含或者可能包含该抗原的特定的细胞种类 或任何其它生物组织样品。

在一个实施方式中，本发明激发引起的免疫反应所针对的抗原是肿瘤抗 原。肿瘤抗原可以通过传统的技术得到，如通过反复冻融肿瘤细胞/组织来制备 肿瘤细胞裂解物而获得所述肿瘤抗原，所述肿瘤细胞/组织获自新鲜的肿瘤活检 组织或获自体外组织培养所产生的肿瘤细胞。该肿瘤细胞裂解物可以通过离心 和收集上清液得到。该肿瘤细胞裂解物既可以立即使用，也可以冰冻储存备用。 这种抗原可以以纯化的形式、部分纯化的形式或以细胞裂解物形式存在的未纯 化形式使用。或者，可以通过重组DNA技术在众多表达系统中的任何一种中 表达该抗原。因此，本领域技术人员应认识到可提供分离的Prx1蛋白以用 于本发明中，从而使得个别的(discreet)、分离的Prx1蛋白与一种或多种不 同的抗原复合。这样的复合物可以在各种条件下形成，如改变Prx1/抗原的比 例，使用不同的缓冲液、孵育时间以及温度。

在一个实施方式中，Prx1蛋白和抗原在本发明的组合物中以复合物的形 式存在，可以彼此共价或者非共价地连接。例如，Prx1蛋白及抗原可能通过化 学键相互连接，如通过共价键、离子键、氢键和/或范德华键，或上述键的组合。 形成含或不含共价键的蛋白质/抗原复合物的方法在本领域是已知的，并且这些 方法可以用于形成分离的Prx1蛋白和一种或多种抗原的复合物。本发明中的 复合物可包含分离的Prx1蛋白和抗原，或基本由Prx1蛋白和抗原所组成，或 由分离的Prx1蛋白和抗原所组成。“分离的”指Prx1蛋白与其天然存在的环 境相分离。分离的蛋白质不一定是纯化的蛋白质。然而，为用于本发明，分离 的Prx1蛋白仍然可纯化到任何需要的纯度。分离的Prx1蛋白包括通过重组的 方法得到的Prx1蛋白。根据本发明，Prx1多聚体，如十聚体，也被认为是分 离的Prx1蛋白。此外，分离的Prx1蛋白还包括与抗原通过肽键相连的Prx1蛋 白，例如在融合蛋白中。简而言之，为了产生这样的融合蛋白，可使用传统的 技术构建编码Prx1蛋白和该抗原的DNA序列，并用任何适合的表达载体在适 宜的细胞类型中表达。如此，这种融合蛋白即能在细胞内表达，且可使用任何 本领域技术人员熟知的方法分离得到这种融合蛋白。在一个实施方式中，Prx1/ 抗原的融合蛋白可以由接头序列间隔开。

本发明中适合给予个体的组合物可以通过以下方法制备：将分离的Prx1 蛋白和/或抗原与任何合适的药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂混合。 可在下列文献中找到一些适用于混合试剂的组合物的例子：Remington:The  Science and Practice of Pharmacy(《雷明登：药物科学与实践》)(2005)，第21 版,宾夕法尼亚州费城，利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott  Williams & Wilkins)。

在一个实施方式中，根据本发明中的方法激发免疫反应的个体是有风险发 生、被怀疑患有或已经诊断患有癌症的个体。因此，在各种实施方式中，与 Prx1蛋白联用的抗原是在任一种癌细胞中表达的抗原，具体的例子包括但不限 于：纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、 内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、腹膜假性粘液瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、 尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、 前列腺癌、鳞状上皮细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状 癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌，支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒 毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、子宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、 小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、 颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质瘤、脑 脊膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、视网膜成神经细胞瘤、白血病、淋巴瘤、多 发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症和重链病。

在一个实施方式中，个体具有带传染源的风险，或者疑似带有传染源，或 者已被诊断带有传染源。因此，在多种实施方式中，用于本发明中的抗原可以 是由传染源所表达的那些抗原。此类传染源的例子包括但不限于：病毒、细菌、 真菌和其它寄生生物。病毒的例子包括但不限于：乙型肝炎或丙型肝炎病毒、 流感病毒、水痘病毒(vaticella)、腺病毒、I型或II型单纯疱疹病毒、牛瘟病毒、 鼻病毒、艾柯病毒、轮状病毒、呼吸道合胞体病毒、乳头瘤病毒、乳多空 病毒、细胞巨化病毒、棘状病毒、虫媒病毒、汉坦病毒、柯萨奇病毒、腮 腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、骨髓灰质炎病毒、人I型或II型免疫缺 陷病毒。细菌的例子包括但不限于：结核分枝杆菌、分枝杆菌、支原体、奈 瑟氏菌和军团杆菌。其它寄生生物的例子包括但不限于立克次体和衣原体。

本发明的组合物可以通过任何适宜的给药途径给药。一些非限制性的例子 包括：口服、胃肠道外给药、皮下给药、腹膜内给药、肺内和鼻内给药。胃肠 外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内和皮下给药。

本发明的组合物的给药可以和旨在治疗抗原相关的疾病或紊乱的常规治 疗联合进行。例如，组合物可在常规抗癌治疗之前、同时或之后给予。这些治 疗包括但不限于：化疗、手术干预和放疗。

总体而言，适宜的剂量和治疗方案提供有效量的该组合物以激发免疫反 应，从而提供治疗或者预防益处。这种反应可以通过临床结果的改善监测到， 如：抑制肿瘤的生长和/或转移、增强对感染的抵抗力、促进免疫细胞的活化、 和/或对于本领域技术人员而言显而易见的其它参数，取决于所治疗病状。

在此公开的治疗用组合物的给药途径、频率及剂量在不同个体之间各不相 同，但使用标准的技术可以很方便的确定。

在一个实施方式中，本发明提供一种组合物，其包含：分离的抗原呈递细 胞(APC)群和包含分离的Prx1和抗原的复合物。Prx1/抗原复合物可以被用于致 敏APC，如树突状细胞。给予个体经致敏APC可以获得增强的免疫反应。因 此，包含分离的APC群和复合物(所述复合物包含分离的Prx1蛋白和抗原)的 组合物中细胞的全部、基本全部、或者部分是树突状细胞。据此，组合物中的 细胞可以100%是树突状细胞，也可以10%-100%(包括之间所有的整数)是树突 状细胞。

在一个实施方式中，给予个体包含分离的APC群和复合物(所述复合物包 含分离的Prx1蛋白和抗原)的组合物以在该个体中激发预防性或治疗性免疫反 应。给予个体的APC可以是异基因的或同基因的。

以下实施例是为了说明而非限制本发明。

实施例1

本实施例提供了实施本发明具体实施方式中使用的材料和方法的描述。

材料

脂多糖(LPS,大肠杆菌(Escherichia coli)血清型026:B6)多粘菌素B硫 酸盐、牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)购自西格玛奥德里奇公司 (Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯)。7-氨基-放线菌素D(7-AAD)和硫代乙醇 酸盐布氏改良培养基购自BD公司(加利福尼亚州拉霍亚)(Becton Dickinson, La Jolla,CA)。Luminex分析系统中所使用的用于捕获和检测IL-6和TNF-α 的抗体、以及蛋白质标准品购自英杰公司(加利福尼亚州卡尔斯巴 德)(Invitrogen,Carlsbad,CA)。CD11b、Gr-1、F4/80及所有的同种型的特异性 抗体购自法明基公司(加利福尼亚州山景城)(PharMingen,Mountain View, CA)。抗TLR2、TLR4和NFκB亚基的抗体购自圣克鲁斯生物技术公司(加利 福尼亚州圣克鲁斯)(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)。抗MD2和 CD14的封闭抗体购自圣克鲁斯生物技术公司。藻红蛋白(PE)连接的抗TLR4 抗体，购自易生物科学公司(eBioscience，加利福尼亚州圣地亚哥)。抗Prx1 的特异性抗体购自实验室前沿公司(Lab Frontier，首尔，韩国)；这种抗体为Prx1 特异性，在表达Prx1的细胞的蛋白质印迹分析中只检测一条条带(图8A)。

动物和细胞系

C57BL/6NCr(TLR4^+/+和TLR2^+/+)、C57BL/10ScNJ(TLR4^-/-)、 B6.129-Tlr2^tm1Kir/J(TLR2^-/-)、C3H/HeNCr(TLR4^+/+)和C3H/HeNJ(TLR4^-/-)无病原 体小鼠，购自美国杰克逊实验室(The Jackson Laboratory，缅因州巴港)。动物 饲养在置于层流柜中的微小隔离饲育盒中，暴露在环境光下。小鼠饲养在罗斯 维尔帕克癌症研究所(Roswell Park Cancer Institute，美国纽约州布法罗)的无病 原实验室中。动物的护理和实验均得到动物护理和使用委员会(The  Institutional Animal Care and Use Committee)的批准。

Prx1在体内的作用通过向C57BL/6NCr或C57BL/10ScNJ小鼠静脉注射 90ug Prx1(大约为1000nM)来测定。两小时后进行心脏穿刺。如下获得血清： 将血液在4℃下孵育过夜，然后离心样品，收集上清液。

培养的小鼠巨噬细胞系(RAW264.7)于37°C和5.0%的CO₂条件下培养于 达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)中，该培养基包含10%的特级胎牛血清 和100U/ml的青霉素以及100ug/ml的链霉素。RAW264.7细胞转染了 pcDNA3.1质粒，该质粒包含对照或者包含编码MyD88显性阴性突变体(MyD88 dominant negative，DN)的寡核苷酸，根据制造商的实验设计，用FuGENE 6(英 杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)进行转染。然后使用G418筛选转染细胞中 表达对照或MyD88DN的细胞。然后分别用缓冲液、Prx1或LPS发激细胞24 小时，培养基收获后通过ELISA分析IL-6细胞因子。

在肺癌细胞系(A549)中用于产生Prx1敲减的逆转录病毒感染过程和逆 转录病毒短发夹RNA表达构建体是本领域技术人员已知的。(Kim等，(2007) Cancer Res.67:546-554；Park等，Cancer Res.(2007)67:9294-9303;Park等，2006. Cancer Res.66:5121-5129，其内容通过引用纳入本文。

分离巨噬细胞和树突状细胞

小鼠腹腔诱出的巨噬细胞是通过腹腔内注射1.0毫升3.0%(w/v)的硫代乙 醇酸盐培养基(TG)得到的。注射后四天，处死小鼠，灌洗腹腔收集巨噬细胞。 巨噬细胞在完全培养基(DMEM培养基添加10%的特级FBS和100U/ml的青 霉素以及100ug/ml的链霉素)中培养1小时通过贴壁筛选得到富集，然后通过 FACS分析法用标准技术鉴定CD11b、Gr1以及F4/80的表达。CD11b⁺Gr1^-F4/80⁺型的细胞确认为巨噬细胞。

使用标准技术在GM-CSF中培养骨髓来源的细胞从而产生未成熟的骨 髓来源的树突状细胞。表达CD11c的细胞确认为树突状细胞。

蛋白质纯化

重组人Prx1、Prx1C52S和Prx1C83S蛋白的纯化方法如前所述(Kim等， 2006.Cancer Res.66:7136-7142;Lee等，2007.J.Biol.Chem.282:22011-22022, 其各自揭示的内容通过引用纳入本文)。简而言之，将包含有重组蛋白的细菌 细胞提取物上样至DEAE琼脂糖凝胶(GE健康护理公司，GE Healthcare，美 国)，经pH 7.5的20mM Tris-Cl平衡。蛋白质经pH6.5的50mM磷酸钠缓冲 液(包含0.1M NaCl)透析。收集获自DEAE柱的含Prx1、Prx1C52S或Prx1C83S 的未结合蛋白，合并且上样至Superdex 200((16/60，GE健康护理公司，美国)， 经pH7.0的50mM的磷酸钠缓冲液(包含0.1M NaCl)平衡。含有Prx1、Prx1C52S 或Prx1C83S的部分收集后保存在-80摄氏度。根据制造商的指示，使用内毒素 鲎试剂测定法(Limulus Amebocyte Lysate Assay)(龙沙公司，Lonza，马里兰州， 沃克斯维尔)定量纯化蛋白中内毒素的水平。测定后发现，Prx1、Prx1C52S和 Prx1C83S中分别含有14.14±0.050EU/ml、14.07±0.67EU/ml和14.17±0.025 EU/ml。

细胞因子分析

贴壁的TG诱出的巨噬细胞经PBS清洗5至10次，以除去任何非贴壁的 细胞。一经清洗后，即加入含有特定浓度的纯化的Prx1、Prx1C52S、Prx1C83S 或LPS的完全培养基，其中存在或不存在Prx1、MD-2和CD14的封闭或对照 抗体。在指定的实验中，添加前将Prx1蛋白或LPS与多粘菌素B共同孵育或 者先煮沸20分钟。24小时后收集上清液，通过细胞因子特异的ELISA或 Luminex多重分析系统进行分析。血清样品依如上所述的方法收集并使用 ELISA测定IL-6的水平。TNF-α和IL-6ELISA试剂盒购于BD生物科学事业 部(美国新泽西州富兰克林湖市)(BD Bioscience,Franklin Lakes,NJ)，测试依照 制造商的说明书完成。

Luminex分析在研究所流式细胞实验室(Institute Flow Cytometry Facility) 完成，使用具有PVDF膜的96孔微量滴定板(多筛选HV板，Multiscreen HV  plates)(密理博公司，Millipore，美国马萨诸塞州，比莱瑞卡)，以帝肯基因西 斯液体操作机器人(Tecan Genesis liquid handling robot，三角研究园(Research  Triangle Park)，北卡罗来纳州)完成所有的稀释、试剂添加以及微量滴定板的操 作。包被有捕获抗体的微珠组被测试稀释剂稀释，收集，往每孔中加入各组的 约1000枚微珠。从9000到1.4pg/ml的重组蛋白质标准品使用稀释剂用3倍稀 释法进行滴定。将样品和标准品添加至含有珠子的孔中。将平板置于摇床上在 环境温度下孵育120分钟，然后以多歧真空抽滤盒抽吸用稀释剂清洗两次。然 后添加抗各种细胞因子的生物素化测试抗体，孵育平板60分钟，并照之前所 述的方法进行清洗。最后，向每个孔中添加PE连接的链霉亲和素，孵育平板 30分钟并进行清洗。珠子在100μl的清洗缓冲液中重新悬浮，在Luminex 100 系统(路明克斯公司(Luminex Corp.)，得克萨斯州，奥斯汀)上进行分析。每个 样品都测试两次，且从所有读数中减去空白值。采用读珠(BeadView)软件(密理 博)，依据珠子的MFI值对重组蛋白标准品的浓度计算出对数回归曲线。将偏 离最佳拟合曲线的点，即低于测试极限或超过饱和度的点，从曲线中剔除。样 品中的细胞因子的浓度通过将它们的珠子的平均荧光强度内插至所得最佳拟 合曲线中计算得到。值超过测试极限的样品稀释后重新测定。

用FITC标记蛋白质

将BSA、Prx1、Prx1C52S和Prx1C83S蛋白通过FITC连接试剂盒(西格玛 公司，密苏里州，圣路易斯)连接至FITC上。将20倍过量的FITC和单独蛋白 质溶解至0.1M的碳酸氢钠/碳酸钠缓冲液(pH调至9.0)中；混合物在室温下温 和摇动孵育2小时。过量的游离FITC用Sephadex G-25凝胶柱(法玛西亚公司 (Pharmacia)，新泽西州，皮斯卡塔维)移除。蛋白质的量通过标准的Lowry检 测法定量。F:P(荧光强度：蛋白质)比根据制造商的说明书进行计算，FITC吸 收率和蛋白质的吸收率分别为在495nm和280nm下的光学密度。BSA、Prx1、 Prx1C52S和Prx1C83S的每nM蛋白质的FITC值分别为31.00±1.92、38.52± 2.39、74.49±2.64和44.44±2.64。

饱和度分析

FITC连接的BSA、Prx1、Prx1C52S和Prx1C83S用含1.0%的BSA的PBS 稀释至特定浓度，反应的总体积为100μL。这些混合物与1.0×10⁶个细胞 /mL(的细胞)于冰上孵育20分钟，以防止内化。细胞用含1%BSA的PBS清洗 两次，并进行孵育以显示相对于带有7-AAD的无活力细胞的存活性，然后在 少于30分钟内用FACsCalibur检测。数据从至少20,000例细胞中得到，以并 排列表(collateral list)模式储存，并用WinList处理程序(VSH公司(Verity  Software House,Inc.)，缅因州特普杉，Topsham)分析。7-AAD阳性(无活力)的 细胞被排除出事件外。FITC-连接的BSA被用于作为阴性结合对照，对于突变 研究，FITC标记中的变化以每nM蛋白质中的FITC的标记归一化。

竞争试验

将未标记的OVA、Prx1、Prx1C52S和Prx1C83S与和FITC相连的Prx1 以特定浓度在100μl含1.0%BSA的PBS中短暂混合。该混合物在冰上孵育 20分钟，然后用含1.0%BSA的PBS清洗两次。接着，将细胞与7-AAD共孵 育，在30分钟内用流式细胞仪检测。在所有的竞争试验中，OVA都用作阴性 竞争对照。数据从至少20,000例细胞中得到，以并排列表模式储存，并用 WinList处理程序(VSH公司，缅因州特普杉)分析。当使用WinList分析结果时， 7-AAD阳性的细胞被排除出事件外。

免疫沉淀

取500μg细胞裂解物和4μg抗TLR4或抗TLR2在4摄氏度培养过夜进 行免疫沉淀。添加25μL的蛋白G琼脂糖(圣克鲁斯生物技术公司)后，将裂解 物继续孵育4小时。为了验证有特异性蛋白质相互作用，使用山羊IgG(圣克鲁 斯生物技术公司)或小鼠IgG(圣克鲁斯生物技术公司)作为阴性对照。珠子用裂 解缓冲液清洗三次，用SDS-PAGE分离，用Prx1特异性的抗体进行免疫印迹。 使用ECL系统(伯乐公司(Biorad))检测蛋白质。

Prx1/TLR4的共定位及NFκB的易位

如下进行共定位实验：将200nM FITC标记的Prx1和PE连接的抗TLR4 加入含有TG诱出的巨噬细胞的培养基中，置于37摄氏度下，孵育指定的时 间，然后转移至冰上，固定并分析。

免疫染色检测NFκB核易位的方法如下。来源于C3H/HeNCr(TLR4^+/+)和 C3H/HeNJ(TLR4^-/-)小鼠的TG诱出的巨噬细胞经200nM Prx1处理。在37°C 下孵育指定时间后，将细胞刮下并收集至试管中，用清洗缓冲液(含2%FBS的 磷酸盐缓冲盐水)清洗两遍，然后在常温下的固定缓冲液(含4%多聚甲醛的磷酸 盐缓冲盐水)中固定10分钟。清洗后，细胞用含10μg/ml抗NF B p65抗体(圣 克鲁斯生物技术公司)的Perm洗涤缓冲液(含0.1%曲通X-100、3%FBS、0.1% 叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水)于室温下重新悬浮20分钟。细胞再用Perm洗涤 缓冲液进行清洗，并在室温下于含7.5μg/ml FITC接合的F(ab)₂驴抗兔IgG 的Perm洗涤缓冲液中重新悬浮15分钟。细胞再用Perm洗涤缓冲液清洗两次， 于室温下在含5μM DRAQ5核染剂(生物态公司，BioStatus)的1%的多聚甲醛 中重新悬浮5分钟。

图像分析

用多光谱成像流式细胞仪(安尼斯公司，华盛顿州西雅 图)(Amnis Corp.,Seattle,WA)分析Prx1和TLR4的共定位和NF-κB的核转位。 在每种试验条件下，至少获得5000次事件，用软件包分析相应的图 片。采用层级门控(hierarchical gating)策略，使用基于图像的物体对比度(梯度 RMS)特征和面积对长宽比筛选在焦点中的单个细胞。分别使用Prx1和TLR4 图像或NFκB和DRAQ5图像的相似性特征测定各单独细胞中的共定 位和核易位，该相似性特征是对全细胞中空间相关像素强度的对数转换的皮尔 森相关系数。相似性得分是两张图像线性相关的程度的量度。

电泳迁移率变动分析(EMSA)

使用传统技术进行EMSA。简而言之，将10μg的核蛋白与γ-³²P标记的 双链NFκB寡核苷酸共孵育于20μL含10mM HEPES(pH 7.9)、80mM NaCl、 10%甘油、1mM DTT、1mM EDTA、100μg/mL聚(脱氧肌核酸－脱氧胞苷 酸)的结合溶液中。DNA-蛋白质复合物在200V，4°C，非变性条件下在6%聚 丙烯酰胺凝胶中解析2小时。凝胶干燥后进行放射自显影。

统计学分析

为比较各实验组，采用带韦尔奇校正(Welch’s correction)的标准化T测试 进行统计分析，其中不假设方差相等。P值小于等于0.05时认为差异有显著性。

实施例2

本实施例提供对由实施例1中所描述的材料与方法所得结果的描述。

Prx1激发DC和TG-巨噬细胞分泌细胞因子以及Prx1激发DC的成熟依 赖于TLR4

硫代乙醇酸盐(TG)诱出的小鼠巨噬细胞用于评估Prx1激发细胞因子分泌 的能力。通过分析腹腔渗出液细胞群的CD11b、Gr1和F4/80的表达鉴定巨噬 细胞的表型。分离的细胞群中大于99%为CD11b⁺，在这些CD11b⁺细胞群中大 多数为Gr1^-、F4/80⁺(图1A)。用Prx1激发TG诱出的巨噬细胞导致该细胞剂量 依赖地分泌TNF-α和IL-6，其分泌显著高于所有浓度未激发细胞的分泌(P≤ 0.01;图1B)。Prx1与内毒素的灭活剂多粘菌素B一起预孵育对Prx1激发细胞 因子的分泌没有显著影响(图1C)；相反，Prx1的变性显著降低其激发细胞因子 分泌的能力(P<0.01)。

在无血清的条件下，与Prx1共孵育后对TG诱出的巨噬细胞分泌细胞因 子的激发显著降低(P≤0.01;图1D)；然而，即使在无血清的条件下，将Prx1 与TG诱出的巨噬细胞共孵育也能显著增高IL-6的分泌(P≤0.005，与在无血清 培养基中培养的细胞的分泌相比)。Prx1同样能够激发培养的树突状细胞系 DC1.2和鼠巨噬细胞系RAW264.7分泌细胞因子(数据未显示)。

外源性的Prx1可以诱导未成熟的骨髓来源的树突状细胞(iBMDC)的成熟 与活化。将iBMDC与浓度递增的Prx1共培养24小时，检测细胞表面共刺激 分子的表达和TNF-α的分泌。在所有测试剂量下，添加Prx1导致细胞表面共 刺激分子CD86的表达(图2A)和TNF-α的分泌(图2B)呈显著的剂量依赖性增 加(与对照相比P≤0.01)。

添加外源重组Prx1增强iBMDC和TG诱出的巨噬细胞分泌细胞因子可能 是重组蛋白的现象，而无生理相关性。为了开始检测Prx1是否能在生理条件 下促进细胞因子的分泌，将TG诱出的巨噬细胞与收集自分泌Prx1的肿瘤细胞 上清液或收集自表达Prx1特异性shRNA的基因工程化肿瘤细胞上清液共培养 24小时。shRNA的表达导致Prx1而非Prx2的表达降低(图8B)。将TG诱出的 巨噬细胞与表达非特异性shRNA的基因工程化肿瘤细胞的上清液共培养将导 致TNF-α表达的增强(Sc,图2C;P≤0.0001，与培养基组相比)。相反，将TG 诱出的巨噬细胞与收集自Prx1表达水平降低的肿瘤细胞的上清液共培养使得 分泌的TNF-α水平显著降低(P≤0.0001，与收获自表达对照shRNA的细胞的 上清液组相比；图2C)；向这些上清液中添加外源性的Prx1恢复TG诱出的巨 噬细胞的TNF-α分泌(shPrx1+Prx1;P≤0.003，与收获自表达Prx1特异性 shRNA的细胞的上清液组相比)。

为了检测Prx1激活iBMDC和TG诱出的巨噬细胞是否依赖于TLR4，从 C57BL/6NCr(TLR4^+/+)和C57BL/10ScNJ(TLR4^-/-)小鼠中分离得到iBMDC和 TG诱出的巨噬细胞，用Prx1、LPS或Pam₃Cys(一种TLR2激动剂)激发。结果 提示Prx1、LPS和Pam₃Cys激发从C57BL/6NCr小鼠中分离得到的iBMDC(图 3A)和巨噬细胞(图3B)分泌细胞因子，但只有Pam₃Cys激发从C57BL/10ScNJ 小鼠中分离得到的iBMDC和巨噬细胞分泌细胞因子(P≤0.01，与从C57BL/NCr 小鼠中分离得到的细胞所分泌的细胞因子相比)。

通过向C57BL/6NCr(TLR4^+/+)或C57BL/10ScNJ(TLR4^-/-)小鼠腹腔注射重 组Prx1来检测Prx1诱导体内TLR4依赖性炎症的能力。注射后2小时采集血 样，通过检测全身IL-6的水平评估全身性炎症的程度(图3C)。注射Prx1导致 C57BL/6NCr(TLR4^+/+)小鼠的全身性IL-6水平显著升高(P≤0.0002)，但对 C57BL/10ScNJ(TLR4^-/-)小鼠的全身性IL-6水平并没有显著影响。

在无血清条件下，TG诱出的巨噬细胞与Prx1共培养后细胞因子表达减少 (图1D)，这提示血清蛋白可能有助于Prx1/TLR4的最优化相互作用。很多的 TLR4配体与TLR4相互作用时是作为一个更大的复合物的一部分，其可包括 CD14和/或MD2。为了测定Prx1增强TG诱出的巨噬细胞分泌细胞因子是否 涉及CD14或MD2，在针对MD2、CD14或对照IgG的封闭抗体存在的情况 下，将细胞与Prx1或LPS共培养(图4A)。与存在对照IgG时Prx1所诱导的相 比，添加针对Prx1、CD14或MD2的封闭抗体显著抑制Prx1激发TG诱出的 巨噬细胞分泌IL-6的能力(P≤0.01)。针对CD14和MD2的封闭抗体也阻断LPS 激发的细胞分泌细胞因子(图8C)。

为了进一步证实Prx1和TLR4/MD2/CD14之间的相互作用，将TG诱出 的巨噬细胞的裂解物与同种型的对照抗体或者TLR4或TLR2特异的抗体共培 养(图4B)。分离抗体复合物，用Prx1抗体进行免疫印迹；仅在用TLR4免疫 沉淀的裂解物中发现Prx1(图4B)。Prx1处理过的细胞中分离得到的TLR4/Prx1 复合物也包含CD14和MD2(图4C)，确证了Prx1与包含CD14和MD2的复合 物中的TLR4相互作用的这一发现。

使用成像流分析(image stream analysis，安尼斯(Amnis))确定Prx1与TLR4 相互作用的动力学，检测这两种分子的共定位。将TG诱出的巨噬细胞与FITC 标记的Prx1和PE连接的抗TLR4抗体共培养。代表性的细胞的合并图像表明 Prx1和TLR4在5分钟内共定位到巨噬细胞的膜上，30分钟时TLR4和部分 Prx1分子已内化(图5A)。合并图像右边的柱状图是在逐像素基础上，在5000 例细胞上得到的FITC-Prx1和PE-抗-TLR4的相似性的统计分析。该分布右移 说明有更大程度的相似性。每个时间点平均的相似系数显示于图5B中。在每 个时间点上，Prx1和TLR4的染色都有高度的相似性(相似系数>1)，表明Prx1 和TLR4共定位。这些结果证实Prx1和TLR4在细胞表面相互作用，并且至少 部分Prx1随TLR4内化。

激发细胞因子的分泌以及与TLR4结合依赖于Prx1的结构

Prx1既是过氧化物酶，也是蛋白质伴侣蛋白(Wood等(2003)Trends  Biochem.Sci.28:32-40)。为检验Prx1激发TG诱出的巨噬细胞分泌细胞因子的 能力是否与其过氧化物酶的活性和/或伴侣蛋白的活性有关，检测两种Prx1突 变体。Prx1C52S突变体缺乏过氧化物酶的活性，但保留伴侣蛋白活性所需的 十聚体结构；Prx1C83S主要以二聚体的形式存在，其伴侣蛋白的活性降低但 保留完整的过氧化物酶活性。Prx1C52S激发TG诱出的巨噬细胞后的细胞因子 分泌与用Prx1激发后观察到的结果没有显著差异(图6A)；然而，Prx1C83S激 发的TG诱出的巨噬细胞的细胞因子分泌显著降低(P≤0.01)。

Prx1结合TG诱出的巨噬细胞依赖于TLR4的存在，因为在TLR4不存在 的情况下，Prx1和无酶活性突变体(Prx1C52S)的结合显著降低(图6B)。 Prx1C83S的结合无论在TLR4表达还是不表达的巨噬细胞上都是最小的，确证 Prx1与TLR4的相互作用是非过氧化物酶依赖性的，但却是结构依赖性的。

采用饱和结合实验(图6C)和竞争分析(图6D)测定Prx1结合到TG诱出的 巨噬细胞表面的K_d与K_i值。Prx1结合到TG诱出的巨噬细胞的K_d值为1.6mM， K_i值为4.1mM(表1)。

Prx1激发细胞因子的分泌依赖于MyD88，并导致TLR4依赖的NFκB的核 易位

配体介导的TLR4活化的后续下游信号传导事件可能是MyD88依赖性或 非MyD88依赖性的。用Prx1激发RAW264.7细胞表达细胞因子，该细胞表 达显性阴性突变(DN)的MyD88蛋白。Prx1激发后的IL-6分泌依赖于MyD88 的功能(图7A)，表明Prx1激活了MyD88信号传导级联，该级联导致NFκB的 激活。

为测定Prx1/TLR4的相互作用是否导致了NFκB的激活，分析从 C3H/HeNCr和C3H/HeNJ小鼠中分离得到的巨噬细胞中Prx1激发后的NFκB 核易位。C3H/HeNJ小鼠的TLR4配体结合域中存在阻止配体结合的突变。将 从C3H/HeNCr和C3H/HeNJ小鼠中得到的TG诱出的巨噬细胞在37°C下与200 nM的Prx1共孵育指定的时间，转移至冰上，与抗NFκB p65的抗体共孵育； 在用图像流分析前15分钟加入核染剂DRAQ5。Prx1在与从C3H/HeNCr小鼠 中分离得到的巨噬细胞共培养的5分钟内即可触发NFκB的易位，并且核定位 直至60分钟依然显著(图7B)。相反，Prx1与从C3H/HeNJ小鼠中分离得到的 巨噬细胞共培养并不触发NFκB的易位(图7B)。合并图像右边的柱状图显示以 逐像素为基础的NFκB与核染剂的相似性。Prx1激发导致NFκB以TLR4依赖 性方式易位至核，这已通过用Prx1激发C3H/H3NCr的TG诱出的巨噬细胞后 所观察到的正相似系数所证实，而用Prx1激发C3H/HeNJ的TG诱出的巨噬细 胞后该相似系数降低(图7C)。用EMSA法确证Prx1激活NF-κB的能力，该法 表明将巨噬细胞与Prx1共孵育导致NFκB DNA结合活性呈现剂量依赖式的升 高(图7D)。

本领域的技术人员会认识到前述的结果强有力地证明Prx1激发TG诱出 的巨噬细胞和DC的TLR4依赖性TNF-α和IL-6分泌。细胞因子的分泌是TLR4 激发MyD88依赖性信号传导级联的结果，并导致NFκB的激活和易位。Prx1 是一种由肿瘤细胞和活化的T细胞所分泌的胞内蛋白。Prx1和TLR4相互作用 并激发促炎细胞因子释放的能力提示它还可能作为内源性的损伤相关分子模 式分子(DAMP)。

HSP72和HMGB1都被归入内源性DAMP，这两者均被显示与TLR4相互 作用。饱和与竞争性研究表明Prx1的K_d大约为1.3mM，K_i大约为4.1mM； 由Binder等(Binder等，2000.J.Immunol.165:2582-2587)提供的数据外推提示 HSP72的K_d值介于2.1-4.4mM，K_i值介于10-21.8mM，这表明与HSP72相比， Prx1与TLR4有更强的相互作用。HMGB1的结合亲和力尚不可得。

TLR4鉴定为重组蛋白受体可能因重组蛋白制品中可能存在的LPS而变得 复杂。为解释在此呈现的结果中的这种可能性，在所有进行过的实验中都包括 两组对照。在第一组对照中，在加至免疫细胞之前，重组蛋白先与多粘菌素B 混合。多粘菌素B是一种强效的LPS的灭活剂；重组的Prx1与多粘菌素B的 预孵育对Prx1激发细胞因子表达的能力没有影响(图1)。然而，将LPS与相同 浓度的多粘菌素B预孵育后显著抑制LPS激发细胞因子释放的能力。作为第 二组对照，在加至免疫细胞之前，将Prx1和LPS煮沸，变性的Prx1显著抑制 其激发细胞因子释放的能力，但煮沸对LPS激发细胞因子释放的能力没有影 响。最后，本研究中用到的所有重组蛋白均以同样制备方式得到，并且纯化后 都发现包含相同水平的内毒素(大约为14EU/ml)，尽管如此，Prx1C83S激发所 分泌的细胞因子量显著要低，且看来不与表达TLR4的细胞结合。因此，结果 似乎证明Prx1与TLR4的相互作用与LPS污染的存在无关。

Prx1、HSP72和HMGB1没有显示显著的结构相似性，这些分子与LPS 也并没有显示出同源性。Prx1、HSP72和HMGB1都是分子伴侣蛋白，并且 HSP72/HMGB1和其它TLR4配体之间不存在结构同源性，使得有人推测TLR4 识别的不是伴侣蛋白本身而是伴侣蛋白运载物(cargo)。支持该假设的有：最近 的研究表明HMGB1结合至TLR9是TLR9识别HMGB1/DNA复合物的结果。 胞外Prx1以十聚体的形式存在，该十聚体与Prx1的伴侣蛋白活性相关(Wood 等，2002.Biochemistry 41:5493-5504,其内容通过引用纳入本文)，而我们的研 究表明Prx1与TLR4的结合依赖于它形成十聚体的能力(图3和图4B)。因此， Prx1与TLR4的结合可能是由于对运载物而不是Prx1本身的识别。尽管如此， 预期本发明所述干扰Prx1结合TLR4的试剂会抑制血管发生。

Prx1C83S突变体缺乏伴侣蛋白的活性，且主要以二聚体的形式存在(Wood 等，2002.Biochemistry 41:5493-5504)，看来不结合TLR4(图4B)；然而，这种 纯化的突变蛋白能激发巨噬细胞分泌细胞因子(图4A)。惯例上，生物功能的检 测要比结合测试更敏感，因此二聚体形式的Prx1和TLR4的相互作用可能低于 这些研究中所用的结合测试所能检测到的水平。一小部分的Prx1C83S以四聚 体的形式存在，这种四聚体也可能可以和TLR4相互作用，其水平低于可检测 到的水平，但足以激发细胞因子的分泌。

Prx1激发细胞因子的分泌依赖于TLR4和MyD88(图3、图4和图5)；然 而，FITC标记的Prx1确实有结合到从TLR4^-/-(B10ScNJ)小鼠中分离到的巨噬 细胞上(图4B)，尽管结合水平低于结合到从TLR4^+/+(B6)小鼠中分离到的巨噬 细胞上的水平。对Prx1和TLR4在细胞水平上的相互作用的检测显示尽管大多 数的TLR4在Prx1结合后均被内化，至少有部分Prx1依然留在细胞表面上(图 3B/C)。这些发现可能是由于Prx1过量所致或者Prx1结合其它受体的结果。其 它与TLR4结合的DAMP已显示与多种危险受体相结合，并且在一些情况下， DAMP与TLR4的结合需要辅助受体。PbA是Prx1的疟疾同源物，其需要MD2 来与TLR4相结合；我们的研究表明，Prx1在有血清存在的情况下能最好地激 发细胞因子的分泌，并且CD14和MD2的抗体能阻断受Prx1激发细胞分泌细 胞因子。另外，TLR4和Prx1的免疫沉淀复合物中包含有MD2与CD14，提示 这些蛋白质有助于Prx1结合TLR4。

实施例3

我们测试了使用Prx1作为抗肿瘤疫苗的佐剂的效力。结果显示于图9中， 证明Prx1增强抗肿瘤疫苗的效力。

为得到图9所示数据，对无处理小鼠用全细胞肿瘤裂解物进行单独接种或 者用全细胞肿瘤裂解物与20nM重组Prx1的混合物进行接种。休息一周后，通 过注射活的肿瘤细胞攻击小鼠。监测肿瘤生长60天；每组10只小鼠。如图9 所示，Prx1激发抗肿瘤疫苗抵御结肠26(Colon 26)肿瘤的效力，该肿瘤是在小 鼠中使用结肠26鼠结肠癌细胞诱发的。