微型核糖核酸作为癌症进展的预测因子及其治疗癌症的应用

摘要

本发明涉及一种微型核糖核酸作为癌症进展的预测因子及其治疗癌症的应用。本发明基于所发现的miR142-3p的新颖功能，其新颖功能在于miR142-3p可调控Sox2、腺苷酸环化酶9（adenylyl cyclase 9，AC9）、及CD133的表达，以及进而调控复发性的GBM细胞及CSCs细胞的整体干细胞性（stemness），并且在复发性GBM细胞中，该miR142-3p可调节其肿瘤诱发特性。本发明进一步提供一种以微型核糖核酸（miRNA）为主的新颖疗法，可用以治疗脑瘤。

说明书

技术领域

本发明是关于微型核糖核酸(microRNA)作为癌症进展的预测因子及其治疗癌症的应用。 

背景技术

多形性神经胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme，GBM)、第IV级神经胶质瘤为恶性度最高的主要脑部肿瘤，且具有相当不良的预后；尽管结合多种疗法，其平均存活年数仍约为12个月(Dehdashti，A.R.，Hegi，M.E.，Regli，L.，Pica，A.，and Stupp，R.2006.Neurosurg Focus 20，E6.；Stupp，R.，Hegi，M.E.，Gilbert，M.R.，and Chakravarti，A.2007.J Clin Oncol 25，4127-4136.)。为了提高病患的存活，故需要了解GBM的肿瘤形成机制。部分研究指出癌干细胞(cancer stem cell，CSC)的亚细胞群是使癌细胞具抗放射线性的一个主要因素，并且也与肿瘤发展，以及经传统疗法后的癌症周期性复发有关系。然而，迄今仍无适当的指标(marker)可用以分离癌细胞的该等重要的亚细胞群，根据CSC的肿瘤形成假说，该等亚细胞群在活体内(in vivo)具有重新形成新肿瘤的能力，且与肿瘤复发为恶性神经胶质瘤有关系。 

微型核糖核酸(miRNAs)为高度保守的小型RNA分子，其可调控基因表达-可做为癌症的标记、致癌基因或肿瘤抑制剂。miRNAs可能可标靶致癌基因、细胞周期调控子及转录因子，并且可调控脑部肿瘤的发展。在脑部肿瘤中，多种miRNAs，包括miR7、miR21、miR26a、miR124、miR137、miR184、及miRNA 221/222与GBM致病机理有关连。多种miRNAs可能可作为预后的指标，像是miR10b及miR26a可为高度的神经胶质瘤作为预后的指标。miRNAs涉及脑部肿瘤发展的许多方面，包括神 经胶质瘤恶性化发展。miR125b、miR326、及miR324-5p可于小脑神经性前驱物及肿瘤中作为标记型miRNAs，其有助于预测预后及病患症状。再者，过量表达miR34可降低脑部肿瘤及胰脏癌干细胞(CSCs)的自我更新能力。近来，miR145被发现可调控胚胎干细胞的分化；该单一的miRNA同时地可调控多种干细胞性基因，包括KLF4、Oct4、及Sox2(Xu，N.，Papagiannakopoulos，T.，Pan，G.，Thomson，J.A.，and Kosik，K.S.2009.Cell137，647-658.)。然而，目前对于GBM的复发，以及藉由调控干细胞性(stemness)以调控二次的GBM复发、肿瘤诱发能力、或间充质转化，miRNAs是否在其中扮演该等角色皆尚未明了。 

miR142是首个被报告具有可用于调控造血作用及T细胞发育的功能的基因(Chen，C.Z.，Li，L.，Lodish，H.F.，and Bartel，D.P.2004.Science 303，83-86.)。miR142-3p的表达是藉由LMO2结合至miR142基因的推测的启动子区域而调控(Yuan，W.，Sun，W.，Yang，S.，Du，J.，Zhai，C.L.，Wang，Z.Q.，Zhang，J.，and Zhu，T.H.2008.Leukemia 22，1067-1071.)。该miR142基因位于t(8；17)易位交界处，可能与惰性淋巴瘤发展为急性的B细胞淋巴瘤有关，这可能归因于c-Myc高度地向上调控。Qian等人(2008)发现于老鼠肺脏的支气管肺泡干细胞(bronchioalveolar stem cell，BASCs)的miR142-3p及miR142-5p是向上调控的；异常的miR142表达可能与将BASCs转变为肺癌干细胞有关。近来，Sun等人(Sun，W.，Shen.，W.，Yang，S.，Hu，F.，Li，H.，and Zhu，T.H.2010.Cell Res 20，1158-1169.)指出miR-142可用于弱化造血细胞的增生作用，是藉由miR-223-CEBP-β-LMO2轴调控。分离自神经胶质瘤或GBM之CSCs具有提高表达的干细胞性基因，该基因像是Sox2(Gangemi，R.M.，Griffero，F.，Marubbi，D.，Perera，M.，Capra，M.C.，Malatesta，P.，Ravetti，G.L.，Zona，G.L.，Daga，A.，and Corte，G.2009.Stem Cells 27，40-48.)。Sox2为高移动性群组的DNA结合蛋白，为神经干细胞的重要指标，并且对维持该神经干细胞处于未分化状态十分重要。相同地，推测Sox2的表达可作为神经胶质瘤及神经管胚细胞瘤，以及维持CSC干细胞性的指标。重要的是，神经胶质母细胞瘤干细胞具有高度的 Sox2表达，且将Sox-2剔弱(knockdown)可进一步抑制致肿瘤性及神经胶质瘤CSCs的干细胞性(Decarvalho，A.C.，Nelson，K.，Lemke，N.，Lehman，N.L.，Arbab，A.S.，Kalkanis，S.，and Mikkelsen，T.Stem Cells 28，181-190.)。 

发明内容

本发明是基于发现miR142-3p的新颖功能，其新颖功能在于miR142-3p可调控Sox2、腺苷酸环化酶9(adenylyl cyclase 9，AC9)、及CD133的表达，以及进而调控复发性的GBM细胞及CSCs细胞之整体干细胞性，且在复发性GBM细胞中，该miR142-3p可调节其肿瘤诱发特性。本发明进一步提供一种以微型核糖核酸(miRNA)为主的新颖疗法，可用以治疗脑瘤。 

因此，在一方面，本发明提供一种利用有效量的miR142-3p制备抑制细胞中目标基因表达的医药制剂的应用，其中该目标基因为CD133、SOX2、或AC9。 

在一具体实施例中，该miR142-3p直接与目标基因的mRNA的3’端非转译区(3’UTR)连结。 

在另一具体实施例中，该细胞为复发性多形性神经胶质母细胞瘤(GBM)细胞。 

在另一方面，本发明提供一种检测个体在治疗后是否具有或具有发展为复发性多形性神经胶质母细胞瘤的风险的套组，其包含miR142-3p反义寡核苷酸及可检测样本中miR142-3p表达量的试剂。 

在某些具体实施例中，该可检测一样本中miR142-3p表达量的试剂为聚合酶链锁反应(PCR)、荧光原位杂交反应、或薄膜上的Northern blot中所使用的反应缓冲液及酵素。 

在另一具体实施例中，该套组可用于检测下列组织样本的miR142-3p的表达水平：(a)患有原发性GBM的个体的对照组样本；及(b)经治疗后，该相同个体的试验组样本，其中(b)试验组样本中miR142-3p的 水平低于(a)对照组样本中miR142-3p的水平，代表经治疗后，该个体具有或具有发展为复发性多形性神经胶质母细胞瘤的风险。 

在一具体实施例中，该个体接受之治疗为外科手术治疗、化学治疗、放射性治疗、或其组合。 

在另一具体实施例中，该个体为患有第I、II、III、或IV级神经胶质瘤的病患。 

在另一方面中，本发明提供一种利用医药上有效量的miR142-3p制备治疗多形性神经胶质母细胞瘤的医药制剂的应用。该医药制剂可藉由立体定位装置以投放至肿瘤所在位置。该多形性神经胶质母细胞瘤可为复发性多形性神经胶质母细胞瘤。该miR142-3p可为具有经LNA-及硫代磷酸酯-修饰骨架修饰的微型核糖核酸(microRNA)，其中该修饰的微型核糖核酸可被包埋于微脂体中。 

在一具体实施例中，本文所用之miR142-3p由核酸所编码。该核酸是位于载体上，其中该载体是选自由质体、黏质体、噬菌质体、及病毒所组成之群组。 

在另一方面中，本发明提供一种用以产生多形性神经胶质母细胞瘤模式动物的方法，包含： 

(a)准备原发性神经胶质瘤细胞； 

(b)将miR142-3p反义寡核苷酸导入该原发性神经胶质瘤细胞，以得到miR142-3p缺失的细胞； 

(c)将该miR142-3p缺失的细胞植入动物中，以得到患有多形性神经胶质母细胞瘤的动物。 

在另一方面中，本发明提供一种利用miR142-3p制备用以增加多形性神经胶质母细胞瘤细胞对于放射性疗法敏感性的医药制剂的应用。 

附图说明

为了阐述本发明的目的，将具体实施例以优选方式呈现于图中。但是，本发明并非局限于所展示的优选具体实施例。 

在图中： 

图1显示miR142-3p作为复发性GBM指标之一反向的预测因子。 

图2显示低量miR142-3p以及高量Sox2及AC9表达水平的情况，其为复发性GBM及低总存活率的预测指标。 

图3显示miR-142-3p直接标靶GBM细胞中的Sox2、ADCY9、及CD1333′UTRs区域。 

图4显示miR142-3p弱化GBM细胞的自我新生能力及致肿瘤性。 

图5显示miR142-3p SPONGE恢复原发性GBM细胞的干细胞性及肿瘤诱发能力。 

图6显示miR142-3p及Sox2/AC9表达可调控GBM的间充质转化以及原神经(proneuronal)转变。 

图7显示miR142-3p、Sox2及AC9调控GBM细胞的肿瘤诱发能力及放射线敏感性。 

图8显示miR142-3p调控复发性GBM细胞的致肿瘤性及放射线的敏感性。 

图9A和图9B显示对于原发性（N=70）及复发性（N=30）GBM病患的22个miRNAs表达量的定量RT-PCR分析，包括在复发性GBM中miR223、miR451、miR181a、miR9、miR142-3p、miR195、miR145、miR181c、miR132、及miR497的下降的表达量，其中以miR142-3p的p值（p=0.0016），于原发性（第一次发生）及复发性（第二次发生）GBM之间，最为显著（此处数据显示三次独立试验的平均值±SD的结果）。 

图10显示将Sox2(A)、AC9(B)、及CD133(C)的野生型(wild-type，WT)或突变的(mutated，mut)3’UTR报信子，与(或不与)对miR142-3p 反义的miRNA及SPONGE一起共同转染，其中测量每一个报信子质体的荧光酵素(luciferase)活性，其显示无论是突变的3’UTR、反义的miR142-3p、或SPONGE-miR142-3p皆可消除miR142-3p对于Sox2、AC9、及CD1333’UTR的抑制作用(*p＜0.05)。 

图11显示Sox2及AC9在GBM细胞的致肿瘤性的探讨。(A、B、C、D)建立pGBM/pLV、pGMB/Sox2、pGBM/AC9、rGBM/shScr、rGBM/shSox2、及rGBM/shAC9细胞株，并将之进行软琼脂细胞聚落形成试验(A、B)及聚球形成试验(C、D)；(E)过量表达的Sox2或AC9可增加pGBM的非贴附性及自我更新的能力，而Sox2或AC9的剔弱则会减少该rGBM的两种能力；该rGBM/miR142-3p细胞进一步被用以生成rGBM/miR142-3p/shSox2+shAC9及rGBM/miR142-3p/Sox2+AC9细胞株；并藉由Western blot法分析Sox2及AC9的蛋白量；(F)测量异种移植的肿瘤大小，其中该异种移植肿瘤是源自植入所指细胞的老鼠。Sox2/AC9共同过量表达会增加rGBM/miR142-3p肿瘤的大小(*p＜0.05)。 

图12显示CD133于GBM细胞中的致肿瘤性的研究：(A)pGBM/CD133细胞株是自病患GBM1及GBM2的细胞衍生而得；并藉由Western blot法评估于每个细胞株之CD133蛋白表达量；(B、C、D)将pGBM/CD133、rGBM/shCD133及其对照组细胞进行软琼脂聚落形成试验(B)、聚球试验(C)及细胞侵袭/转移试验(TransWell invation/migration)(D)；CD133的存在与否对于两种pGBM细胞株的非贴附性、自我更新以及侵袭/转移能力仅有轻微的影响；(E)评估经异种移植rGBM/shScr及rGBM/shCD133的NOD-SCID小鼠的脑纹状体中肿瘤生长及体积。经观察无显著差异；以及(F)经植入所指细胞的NOD-SCID小鼠的肿瘤体积，于移植后28天测量；其中在rGBM/shScr与rGBM/shCD133肿瘤之间，以及在pGBM/pLV与pGBM/CD133肿瘤之间，皆无显著差异。 

图13显示自7个GBM病患分离之癌类干细胞的miR142-3p表达情形：(A)左图：两个个别的GBM细胞株(GBM1及GBM2)的球形体的显微镜影像，其中右图：显示7个病患的球形体形成GBMs中的 miR142-3p表达量是降低的；(B)左图：miR142-3p的内源性表达，是藉由FISH(荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization)；箭头：代表miR142-3p有表达；GBM1)测量。右图：在7个病患组中，相较于CD133-GBM细胞，结果显示CD133阳性(CD133+)GBM细胞的miR142-3p表达为向下调控的；(C)左图：将GBM细胞的侧群细胞(Side populations)分离，并藉由细胞分类器(GBM1)分离。右图：7个病患中侧群细胞(SP)为阳性的GBM细胞的降低的miR-142-3p表达。*p＜0.05。 

图14显示胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESCs)及GBMs中转录体图谱的生物信息分析结果：该多维度分析说明了于ESCs、rGBM、具有miR142-3p的rGBM、pGBM、及具有miR142-3p SPONGE的pGBM之间的平均谱是转录体距离(average lineage transcriptome distance)。 

图15显示分离自5个病患之pGBM细胞经具有SPONGE的miR142-3p剔弱方法处理后的肿瘤诱发能力的评估；以及分别将50、100、1000、及10000的细胞数量同位(orthotopically)注射入所指的SCID小鼠的脑纹状体中；miR142-3p SPONGE的肿瘤诱发能力，于pGBM细胞中藉由Sox2/AC9双重基因静默被进一步弱化。 

图16显示Sox2及AC9涉及miR142-3p所调控的间充质转化：(A)将、pzGBM/Spg、pGBM/Spg/shSox2+shAC9、rGBM/pLV、rGBM/miR142-3p、及rGBM/miR142-3p/Sox2+AC9细胞进行qRT-PCR，分析间充质倾向的标记(YKL40、波形蛋白(vementin)、纤维粘连蛋白(fibronectin))的表达情形；(B)伤口愈合移动试验是以所指细胞进行；(C)计算不同组的移动活性，并以相对值呈现于表中；*：p＜0.05，pLV v.s.pLV-miR142/Vector；#：p＜0.05，pLV-miR142/Vector v.s.pLV-miR142/Sox2+AC9。 

具体实施方式

为了使本发明目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合各种具体实施例及申请专利范围的详细说明及图，对本发明进行进一步详细 说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，以使属于本发明领域的具有通常知识者，可基于本文的叙述，并且不需进一步阐述，即可实施本发明，并将其应用至最宽广的范围，而非用以限制本发明。 

神经胶质母细胞瘤(GBM)为最常见的主要的脑部肿瘤，且其预后通常不佳。此外，在多数病患中，经放射化疗后会在数月内复发。在本发明中，在复发性GBM的miR142-3p表达量较原发性GBM低，且具有同时表达(co-expression)的Sox2和AC9以及被抑制的miR142-3p之GBM病患会导致较差的预后及存活率。藉由标靶Sox2及AC9，MiR142-3p可调控复发性GBM的肿瘤诱发能力及间充质转化。在复发性GBM中增加的miR142-3p可降低致肿瘤性、间充质转化及抗放射线性；当在原发性GBM中miR142-3p为向下调控时，则会促进肿瘤诱发、抗放射线性及间充质转化，此点可能可用于GBM病患之病症发展及复发的指标。因此，miR142-3p可能涉及CSC重新程序设计改造(reprogramming)的转录网络，以及涉及于脑部肿瘤中调控间充质转化。更重要地，LNA-修饰的miR142-3p寡核苷酸可有效地阻断复发性GBM所衍生的原位异种移植物的肿瘤的生长以及间充质转化特性，以及可协同增强放射疗法的功效。本发明为第一个发现及证明miR142-3p可作为癌症类干细胞特性(cancer stem-likeproperty)及GBM复发的一重要调控因子，并且该miR142-3p可能为一具潜力的临床预后指标，以及一种新颖的以miRNA为基础的GBM疗法。 

对于miRNAs用于致肿瘤性的应用日趋被重视，越来越多的证据指出miRNAs涉及类CSC特性。例如，异位表达let-7、miR200c、及miR30可抑制乳房的CSCs的致肿瘤性(Shimono，Y.，Zabala，M.，Cho，R.W.，Lobo，N.，Dalerba，P.，Qian，D.，Diehn，M.，Liu，H.，Panula，S.P.，Chiao，E.，et al.2009.Cell 138，592-603.；Yu，F.，Deng，H.，Yao，H.，Liu，Q.，Su，F.，and Song，E.2010.Oncogene 29，4194-4204.)。近来，Iliopoulos及其同僚报告miR200b可透过直接标靶Suz12以调控CSC特性，该Suz12为一多齿梳抑制子复合物(polycomb repressor complex)的次单位(Iliopoulos，D.，Lindahl-Allen，M.，Polytarchou，C.，Hirsch，H.A.，Tsichlis，P.N.，and Struhl，K.2010.Mol Cell 39，761-772.)。在本发明中，miR142-3p可直接标靶Sox2、AC9、及CD1333′UTRs，以及藉由抑制复发性GBM细胞的Sox2及AC9表达来压抑其干细胞性及致肿瘤性。更重要地，将miR142-3p表达剔弱，可明显地活化GBM-CSC自我更新能力，以及抑制多能性基因的表达。再者，本人证实SPONGE-miR142-3p可在活体内(in vivo)增加原发性GBM的肿瘤诱发能力约10至10000倍(图5H及图15)。此证据支持了于GBM中向下调控miR142-3p表达时，会导致类干细胞特性，此即给予GBM细胞诱发及重新生成新肿瘤的能力。再者，已知Sox2于调控神经胶质瘤干细胞的肿瘤诱发能力上扮演一重要角色。过量表达Sox2会促进神经管胚细胞瘤肿瘤诱发细胞生成，以及与神经管胚细胞瘤病患存活率呈现负相关性(Sutter，R.，Shakhova，O.，Bhagat，H.，Behesti，H.，Sutter，C.，Penkar，S.，Santuccione，A.，Bernays，R.，Heppner，F.L.，Schuller，U.，et al.2010.Oncogene 29，1845-1856.)。数据进一步证实同时剔弱(co-knockdowm)Sox2及AC9，而没有剔弱CD133，会抑制GBM细胞的肿瘤诱发能力及抗放射线性，此点可藉由miR142-3p之向下调控诱发(图4、图7及图15)。miR142-3p可负调控干细胞性基因之表达，而降低miR142-3p表达会促进CSC相关的自我更新及抗放射线性。进一步探讨miR142-3p所调控的GBM或GBM-CSC的去分化作用(de-differentiation)或重新程序设计改造，将可更深入了解miR142-3p在GBM发展上所扮演的角色。 

癌干细胞(CSCs)已于尤文氏肉瘤(Ewing sarcoma)家族性肿瘤中被发现，其仍保有间充质干细胞(MSC)的可塑性；EWS-FLI-1及miRNA-145是以相互抑制的回馈循环方式互动、辨识其共同标靶基因Sox2，并接着诱发MSC重新程序设计改造以转变成尤文氏肉瘤CSCs(Riggi，N.，Suva，M.L.，De Vito，C.，Provero，P.，Stehle，J.C.，Baumer，K.，Cironi，L.，Janiszewska，M.，Petricevic，T.，Suva，D.，et al.Genes Dev 24，916-932.)。在自我新生之人类胚胎干细胞中miR145表达为低的，且内源性miR145会抑制多能性因子Oot4、Sox2、及Klf4之3′UTRs(Xu，N.，Papagiannakopoulos，T.，Pan，G.，Thomson，J.A.，and Kosik，K.S.2009.Cell 137，647-658.)。近来，完整的基因体分析显示异常的基因表达会决定GBM之典型、间充质型及原神经的类型，且进一步发现神经胶质瘤特异性的调控网络，其中涉及一转录模块，其可活化恶性神经胶质瘤的间充质基因表达。因此，miRNAs可能调控脑肿瘤及GBM-CSCs的自我新生及间充质特性。此资料证实，miR142-3p表达与GBM的发展为负相关性，且将原神经型GBM细胞的内源性miR142-3p静默可诱导该等细胞重新程序设计改造以转变为间充质型态或GBM的CSCs。再者，同时表达Sox2及AC9亦可调控GBM之间充质特性。于复发性M型GBM细胞中，同时消除Sox2及AC9则会促进间充质性特征性改变为原神经性的外表型，而当Sox2及AC9同时过量表达于原发性GBM细胞时，将重新程序设计改造原神经性的外表型转变为间充质的特征性。因此，miR142-3p可能为Sox2及AC9之上游调控因子，以调控间充质及原神经性的转变。此外，高度GBM的分子指标包括葡萄糖作为主要神经元细胞能量的来源，以及IDH1基因之突变(Zhao，S.，Lin，Y.，Xu，W.，Jiang，W.，Zha，Z.，Wang，P.，Yu，W.，Li，Z.，Gong，L.，Peng，Y.，et al.2009.Science 324，261-265.)。既然cAMP可调控丙酮酸盐脱氢酵素(Pyruvate dehydrogenase)，cAMP可能可调控糖解路径以及改变脑部之葡萄糖依赖性。cAMP的生成以及糖解代谢路径的改变是否与IDH1所调控的TCA循环阻断相互作用仍属未知。然而，cAMP及IDH1皆涉及糖解路径，且cAMP为二级讯息传递者。因此，若能发现GBM的AC9受器，将可有助于找到新颖的GBM疗法。 

CD133，一5-穿膜糖蛋白，为造血干细胞及内皮前驱物的指标，且可能涉及血管新生作用。CD133表达已被推测可作为神经胶质瘤的肿瘤再生长、恶性发展、及肿瘤状况的预后指标(Zeppernick，F.，Ahmadi，R.，Campos，B.，Dictus，C.，Helmke，B.M.，Becker，N.，Lichter，P.，Unterberg，A.，Radlwimmer，B.，and Herold-Mende，C.C.2008.Clin Cancer Res 14，123-129.)。近来由Pallini等人所提出的存活率报告(Pallini，R.，Ricci-Vitiani，L.，Montano，N.，Mollinari，C.，Biffoni，M.，Cenci，T.，Pierconti，F.，Martini，M.，De Maria，R.，and Larocca，L.M.2010.Cancer.)，提出相较于原发性 GBM的CD133阳性细胞百分比，复发性GBM的CD133阳性细胞百分比增加4.6倍，而增加CD133的表达与肿瘤复发后之较长的存活率有明显的相关性。于本研究中，免疫组织化学分析显示，相较于原发性GBM，复发性GBM的CD133阳性细胞的百分比明显的增加。然而存活率分析显示，CD133表达量与GBM的存活率并无明显相关性(图2)。值得注意的是，于原神经型GBM的CD133cDNA过量表达或于间充质型GBM以siRNA静默的CD133，于活体外(in vitro)及活体内(in vivo)并不会影响间充质的外表型表达或致肿瘤能力。值得注意的是，相较于CD133⁺GBM细胞，CD133^-细胞被发现于神经球诱发效率及细胞聚落生成性上具有相似的CSC特性，以及部分PTEN缺乏的GBM肿瘤被发现可产生自我新生的肿瘤诱发CD133⁺及CD133^-细胞型态(Chen，R.，Nishimura，M.C.，Bumbaca，S.M.，Kharbanda，S.，Forrest，W.F.，Kasman，I.M.，Greve，J.M.，Soriano，R.H.，Gilmour，L.L.，Rivers，C.S.，et al.2010.Cancer Cell 17，362-375.)。因此，进一步亟需探讨以判定CD133表面抗原或CD133相关的路径是否参与类干细胞特性的调控，以及CD133是否可做为预测GBM病患存活率的指标或神经胶质瘤CSCs的治疗目标。 

总结，miR142-3p可调控GBM的肿瘤诱发特性及间充质转化能力。升高的miR142-3p表达会降低癌症类干细胞特性及干细胞性；抑制miR142-3p会增加GBM的致肿瘤特性。因此，miR142-3p可能为治疗脑部肿瘤的一种新颖的治疗实施例。 

试验方法 

细胞培养、自GBM组织中分离初代细胞以及试剂 

所有取得组织的程序皆依照赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)，并且经台北荣民总医院科学研究与伦理审查委员会评估后才进行。简言之，将GBM组织手术摘除后，以含有HBSS之葡萄糖冲洗该组织三次，接着将样本以300mm厚度进行切片，并将切好的组织浸泡于含有葡萄糖及HBSS的0.1％(w/w)的胶原蛋白酶中，于37℃作用15分钟，并用摇晃震荡机以125rpm速度进行震荡培养。将GBM初代培养及GBM细胞株 培养于含有10％胎牛血清的MEM(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中，且向MEM中添加1mM丙酮酸钠、非必需胺基酸、2mM L-谷胺酸、100units/mL青霉素、及100μg/mL链霉素，并于标准培养环境下进行培养(37℃、95％潮湿空气、5％CO2)。 

富集癌症类干细胞及分离CD133阳性细胞 

所有取得组织之程序皆依照赫尔辛基宣言，且经台北荣民总医院科学研究与伦理审查委员会评估后始进行。简言之，将头颈部之癌组织以手术摘除，并以含有HBSS之葡萄糖冲洗该组织三次，接着将样本以300mm之厚度进行切片，并将切好的组织浸泡于含有葡萄糖及HBSS之0.1％(w/w)之胶原蛋白酶中，于37℃作用15分钟，并用摇晃震荡机以125rpm速度进行震荡培养。接着将经胶原蛋白酶消化后之细胞，以100xg之速度进行离心10分钟，并将该等细胞重新悬浮于癌症干细胞富集培养基中以培养GBM细胞，其中该富集培养基为添加有无血清DMEM/F12(GIBCO)培养基、N2补充物(R&D)、10ng/mL人类重组的bFGF(R&D)及10ng/ml EGF之DMEM/F12培养基。 

为了分离CD133阳性细胞，其分离步骤如下所示：将自GBM病患的肿瘤样本所分离的细胞以1mL CD133/l的微磁珠/106细胞进行标记，其是使用CD133细胞分离套组(MACS，Miltenyi Biotec)。将CD133⁺细胞培养于添加有N2补充物(R&D)、10ng/mL人类重组的bFGF(R&D)及10ng/ml EGF的无血清DMEM/F12(GIBCO)培养基。 

供细胞存活分析的放射线疗法 

以Theratronic cobalt unit T-1000(Theratronic International，Inc.，渥太华，加拿大)传送伽玛放射线(游离辐射；IR)，剂量为1.1Gy/min(SSD＝57.5cm)。将对照组之细胞及IR组的细胞暴露在不同剂量下(0、2、4、6、8、及10Gy)。经10天培养后，将细胞聚落(每个细胞聚落超过50个细胞)固定，并以结晶紫及甲醇溶液进行染色20分钟。以细胞聚落形成试验分析细胞存活率。培养效率(Plating efficiency，PE)及存活部 分是以下式计算：PE＝(细胞聚落数目/接种细胞数目)×100％；SF＝计算而得的细胞聚落数目/(接种细胞数目×(PE/100))。 

肿瘤球形成分析 

分离肿瘤细胞，并于2×10⁶活细胞/75cm²角瓶中，培养于添加有N2补充物(R&D)、10ng/mL表皮生长因子(EGF，Invitrogen)、10ng/mL碱性纤维母细胞生长因子(bFGF，Invitrogen)、及青霉素/链霉素的改良的DMEM/F-12，使成为肿瘤球。经14天后，计算肿瘤球数目。 

定量RT-PCR 

根据制造商的操作手册(Invitrogen)，自细胞或组织中以Trizol试剂制备全部的RNA。用于qRT-PCRs的mRNAs以Superscript III第一股合成是统进行反转录后，以进行RT-PCR(Invitrogen)。将所得之cDNAs于ABI 7900HT(Applied Biosystems)进行qRT-PCR反应。所用到之引物序列分列于表1中(SEQ ID NOS.1-24)。 

表1用于定量RT-PCR的引物序列 

对于miRNAs，使用TaqMan miRNA试验及特异性引物对进行qRT-PCR。所有试剂及试验方法皆来自Applied Biosystems，且以7900HT快速实时PCR是统进行侦测。所使用的引物对皆列于表2(SEQ ID NOS.1-24)。 

质体构建 

所有的质体皆被评估验证及定序过。SOX2、ADCY9、及CD133 3′UTRs是以PCR扩增，并将之构建于pMIR-REPORT载体(AppliedBiosystems)上。并藉由Sox2(SEQ ID NOS.25-29)、ADCY9(SEQ ID NOS.30-35)、及CD133 3′UTRs之引物组(SEQ ID NOS.36-41)生成各种序列缺失的构建体(表3)。 

藉由PCR及具有校正功能的Taq以扩增各种不同的SOX2、ADCY9、及CD133 3′UTR区域。藉由引物对将额外的限制酶切位(MluI/HindIII或SpeI/PmeI)引入；再以MluI/HindIII或SpeI/PmeI将扩增区域酶切后，将之再构建于pMIR-荧光酵素报信子质体上。至于miR142-3p sponge的寡核苷酸，miR142-3p反义及不规则的(scramble)构建已列于表3(SEQ IDNOS.42-52)。如同Gangemi et al.，2009所述方式，将寡核苷酸黏合后将之接合至BLOCK-iT Pol II miR RNAi表达表达载体上。标靶人类SOX2序列之寡核苷酸序列皆已设计于Invitrogen网站上。选定其中一个寡核苷酸，将之如同Gangemi et al.，2009所述的方式构建入BLOCK-iT Pol II miRRNAi表达载体。构建用引物对(SEQ ID NOS.42-52)皆列于表3。该pcDNA 6.2-GW/EmGFP-miR-neg对照组质体含有一插入子，其可形成发夹结构，可修饰成成熟的miRNA，但其被设计为不会标靶任何已知脊椎动物基因。无5’突出端(overhang)的负对照组序列列于表3。所有构建方法皆按照制造商的操作手册执行。 

流式细胞仪 

根据制造商的操作方式进行细胞标记，以含有藻红蛋白(MiltenyiBiotech.，Auburn，CA，USA)的抗CD133抗体将细胞染色。以FACSCalibur (Becton Dickinson)及CellQuest软件测量受蓝色(488nm)激发光照射的10,000的细胞的红色(＞650nm)荧光发射光。于细胞分选试验中，将细胞标记并以FACSAria(BD Biosciences)进行分选。 

miR142-3p Angomir及微脂体媒介的运输方式 

以如同miR142-3p的序列合成带有修饰的miR142-3p RNA寡核苷酸。将硫代磷酸酯骨架修饰为磷酸二酯骨架，且将核糖以锁核酸(lock-nucleic-acid，LNA)核糖取代之。miR142-3p angomir的运送是的藉由微脂体为主的核酸运输方法所调控。简言之，将miR142-3p溶解于D5W(5％葡萄糖水)中，并以特定的脂质成分包埋入微脂体中。将包好的微脂体(miR142-3p angomir之最终浓度为10ng/μL)送入颅内异种移植的肿瘤诱发细胞的相同位置。 

miRNA北方墨点法 

以miVana miRNA分离套组(Ambion)或Trizol(Invitrogen)将microRNAs萃取出来。将50ng之分离的小型RNAs，置入每一个孔中进行电泳，其中该电泳是于含有7M尿素之15％聚丙烯酰胺凝胶的0.5X TBE中进行。经电泳后，藉由半干式转移机将小型RNAs转移至Hybond-N+膜上，并藉由UV交联机进行交联。以miVana探针及标记套组合成RNA标记(decade marker)，并藉由相同套组将对于miR142-3p特异性的LNA-RNA寡核苷酸(SEQ ID NO.52)(表3)进行标记，以引入5’端的放射性标记。将膜片先进行前杂交(prehybridized)，再以杂交缓冲液进行杂交处理24小时，再以冲洗缓冲液进行冲洗三次。杂交讯号曝露于X光片48小时。 

荧光原位杂交(FISH) 

将细胞于室温下固定于含4％三聚甲醛之PBS中15分钟，接着以含有0.1％NP-40及0.1％X-100Triton的PBS将细胞进行通透化。经以10％驴血清，于室温封闭(blocking)2小时后，将LNA修饰的，及FITC共轭结合的miR142-3p反义寡核苷酸(SEQ ID NO.52)置入杂交缓冲液中，于42℃作用整夜，接着以5X SSPE及2X SSPE清洗。染色影像是以 Olympus影像是统(Silahtaroglu，A.N.，Nolting，D.，Dyrskjot，L.，Berezikov，E.，Moller，M.，Tommerup，N.，and Kauppinen，S.2007.Nat Protoc 2，2520-2528.)拍摄。寡核苷酸序列(SEQ ID NO.52)列于表2。 

表2 

北方墨点法用以检测miR142-3p表达 

锁核酸修饰的反义miR142-3p 

 miR142-3p反义   5′-UCCAUAAAGUAGGAAACACUACA-3’(SEQ ID NO.52)

原位杂交用以检测miR142-3p表达 

锁核酸修饰的反义miR142-3p，其与FITC共轭结合 

 miR142-3p反义   5′-UCCAUAAAGUAGGAAACACUACA-3’(SEQ ID NO.52)

以慢病毒为基础的Sh-RNA的标靶序列 

免疫墨点法 

细胞蛋白萃取及免疫墨点法分析是根据(Kao et al.，2009)所述实行。将15μL样本于95℃煮沸5分钟，并于10％SDS-PAGE上分离。将该等蛋白藉由湿转渍方式(wet-transfer)转渍至Hybond-ECL硝化纤维纸或PVDF膜上(Amersham，Arlington Heights，IL，USA)。添加所述之一级抗体及二级抗体。有反应的蛋白条带是由ECL检测系统(Amersham)检测。所用到的抗体如表3所列。 

表3 

缩写：WB，西方墨点法；mmab，老鼠单株抗体；rpab，兔多株抗体 

免疫荧光染色 

将细胞再培养于盖玻片上，以4％三聚甲醛固定，再以0.1％TritonX-100将细胞进行通透化，并以所述抗体进行免疫染色，再以FITC-或PE-标记的二级抗体进行染色影像化。 

GBM组织的免疫组织化学分析 

将病患的组织样本置于玻片上以进行免疫组织化学染色。经脱蜡及复水后，将1X Trilogy稀释于H₂O中后(Biogenics)，加热以使组织切片进行抗原修复。将切片浸泡于3％H₂O₂ 10分钟，且以PBS冲洗三次。将组织切片以血清封闭(blocking)(Vestastain Elite ABC套组，VectorLaboratories，Burlingame，CA，USA)30分钟，接着在室温下于PBS溶液中将之与一级抗体的抗人CD133及鼠抗人的Sox2(Cell SignalingTechnology)培养2小时。以PBS冲洗组织切片，并与生物素标记的二级抗体进行培养30分钟，接着以标记有卵白素-辣根过氧化酶之结合物进行培养30分钟，并以PBS冲洗三次。将组织切片浸泡于染料3-3’-二胺基苯啶及H₂O₂受质溶液( DBA/Ni受质套组，SK-4100，VectorLaboratories)中作用10分钟。使用苏木精(Hematoxylin)以进行对比染色(Sigma Chemical Co.)。最后，将肿瘤切片以 (BDH LaboratorySupplies，UK)固定于盖玻片上，并以显微镜观察。病理专家在不知临床数据情况下，将免疫组织化学结果进行计分。经观察每张切片的五个高解析视野后以进行解读，且每个视野计算100个细胞供分析。 

活体外软琼脂分析法 

使用带有聚碳酸酯滤膜(8-μm孔径大小；Corning，英国)之24孔盘 系统。将细胞悬浮液种于Transwell的上方反应室，以1×10⁵细胞密度种于100μL无血清培养基。将该滤膜的反面，朝向下方反应室，以Hoechst 33342染色3分钟，接着以倒立式显微镜观察移动中的细胞。为了进行软琼脂分析，将6孔培养皿的每个孔洞(35mm)的底部，以2-mL琼脂培养基混合物(DMEM，10％(v/v)FCS，0.6％(w/v)琼脂)包覆。经底层琼脂固化后，将含有2×10⁴细胞的2-mL上层琼脂培养基混合物(DMEM，10％(v/v)FCS，0.3％(w/v)琼脂)加入，并于37℃培养4周。将该等培养盘以0.5mL 0.005％结晶紫进行染色，并以解剖显微镜计算细胞聚落数目。 

活体外细胞侵入分析 

使用带有聚碳酸酯滤膜8-μm孔径大小(Corning，英国)的24孔盘 系统进行细胞侵入能力评估。将该膜以Matrigel^TM(BDPharmingen，NJ，USA)进行包覆。将癌细胞悬浮液，以1×10⁵细胞密度种于100μL无血清培养基，种于Transwell上方反应室。下方反应室则以无血清培养基，或带有10％血清培养基进行冲填。经24小时培养后将培养基移除，并将该滤膜以4％福尔马林固定1小时。接着，将滤膜上朝向下方反应室的剩余细胞以Hoechst 33258(Sigma-Aldrich)进行染色。再以倒立显微镜，于100倍倍率下，自5种不同视野观察及计算移动的癌细胞。 

活体内分析肿瘤生长及转移 

所有动物操作皆按照台北荣民总医院的国际动物福祉规范进行。将2×10⁵GBM细胞注入8周龄SCID小鼠(BALB/c株)的脑部纹状体中。藉由使用显影发光装置(LT-9500 Illumatool TLS，装有激发光源[470nm]及滤片[515nm])(Kao et al.，2009)观察活体内GFP影像。使用卡尺测量肿瘤大小。再以下式计算肿瘤体积：(长度×宽度²)/2，并以影像Pro-plus软件进行分析(Kao et al.，2009)。 

生物发光影像(BLI)及3T-MRI 

所有涉及动物的操作皆按照台北荣民总医院的国际动物福祉规范进行。将8周龄裸鼠(BALB/c株)原位注射不同数量的细胞。接着使用IVIS50动物影像系统(Xenogen Corp.)以进行BLI。由于从标靶部位所发射出来的光子可穿过哺乳动物组织，因此可使用敏感的光化影像是统以从外部检测该光子并定量。该影像拍摄时间为1分钟。可使用活体影像软件(LivingImage software)(Xenogen Corp.)以描绘肿瘤位置所呈现之影像，且可以每秒的光子数量定量。使用具有小型正交线圈(mini quadrature coil)(内直径12cm)之3T MR影像Biospect系统(Bruker)，以每周测量每只小鼠的肿瘤大小，该小型正交线圈可射频穿透及接收MR影像讯号(Chiou etal.，2006)。根据下式：(长度×宽度²)/2，以计算体积，接着以Image-ProPlus软件分析。 

微数组分析及生物信息 

使用Trizol试剂(Life Technologies，Bethesda，MD，USA)自细胞中萃取所有的RNA，并以Qiagen RNeasy(Qiagen，Valencia，CA，USA)管柱进行纯化。以Superscript II RNase H反转录酶(Gibco BRL)将所有的RNA进行反转录以生成有Cy3-及Cy5-标记(Amersham BiosciencesCo.，Piscataway，NJ，USA)的cDNA探针，以分别作为对照组及试验组样本。将有标记的探针与含有10,000基因殖株固化cDNA片段的cDNA微数组进行杂交。分别使用GenePix 4000B数组扫瞄机(Axon Instruments，Burlingame，Ca，USA)以测量及扫瞄Cy3及Cy5标靶物的荧光强度。使用GenePix Pro 3.0.5.56(Axon Instruments，USA)及GeneSpring GX 7.3.1软件(Agilent，Palo Alto，CA)进行数据分析。以下详述如何使用平均链接距离(average-linkage distance)以评估两组基因表达图谱间的相似性。对于第三者而言，两组样本表达图谱间的距离差异是藉由比较相对应的平均链接距离(所考虑的两组成员间的所有成对距离(pair-wise distances)(链接)的平均)来评估。对于此种比较中的差异，可藉由结合有关连的平均链接距离的标准偏差(成对连结的标准偏差除以连结数的平方根)来 估计。使用R程序的标准功能以执行经典多维标度法(multidimensionalscaling，MDS)，以提供一视觉印象以使人得知该等不同样本之间是如何相关连的。 

统计分析 

数据皆以平均值±SD方式呈现。视适用情况，使用Student’s t测试或变方分析(analysis of variance，ANOVA)试验以比较组间的连续变异性。使用卡方检定(chi-square test)或费雪精确性检定(Fisher′s exact test)以比较类别变项(categorical variable)。使用Kaplan-Meier法以估计存活率，及藉由对数等级检定(log-rank test)比较。P＜0.05被认为具统计上显著差异。 

实施例 

实施例1：于复发性GBM的miR142-3p表达表达的临床意义 

多形性神经胶质母细胞瘤(GBM)的预后通常都不佳，即便是经过手术完全切除接着佐以化学放射性治疗，仍常于第1年内伴随着病况快速发展及复发。部分研究指出该等侵略性及复发性GBM可能是由于癌症干细胞(CSC)(或常称为肿瘤诱发细胞(TIC))的持续性所造成。近期研究显示微型核糖核酸(microRNA)可用以调控或活化恶性癌症的CSC特性。然而，微型核糖核酸究竟如何于GMB中调控或产生CSCs，以导致GMB对于传统疗法的抗性及复发，仍不清楚。本发明试着藉由厘清微型核糖核酸于复发性GBM中的角色以探讨此一机制。一开始，比较来自4个独立案例的相同病患的原发性及复发性GBM的miRNA表达图谱，吾人发现，于原发性及复发性样本间(总共四种病患组，图1A)，有22个miRNAs的表达有分歧性(向上或向下表达)。为了进一步评估微数组数据，收集70个原发性及30个复发性GBM病患样本(表4)，并藉由定量RT-PCR分析其22个miRNAs表达程度(图9)。于原发性及复发性GBM间，发现miR142-3p的表达最具显著不同的差异(图1B；图9A)。 

表4GBM病患的临床特征 

以荧光原位杂交(FISH)检测出原发性GBM的miR142-3p具高表达量，然而以FISH于复发性GBM肿瘤组织中则无法测得miR142-3p(图1C)。再者，以北方点墨法分析7组(先前所述的4组加上额外3组)原发性及复发性GBM组织(从7个GBM病患的第一次手术及第二次手术中所切下的肿瘤样本)的miR142-3p表达。相较于第一次手术取得的样本 (图1D)，第二次手术所切得的肿瘤样本的miR142-3p的表达较低，暗示低的miR142-3p表达量与肿瘤复发及发展呈现逆相关性。 

经发现miR142-3p的低表达量与GBM复发的相关性后，可推测miR142-3p可能调控GBM细胞的干细胞性或类CSC性，此可能透过下游与干细胞机制或标记有关的目标来调控。为了探讨miR142-3p可能的下游目标，是使用一软件筛选策略(Targetscan program，www.targetscan.org)来探究。发明人发现，仅CD133的3’UTR区，(一种穿膜蛋白，已广为被应用于分离各种癌症类型中的可能的CSC细胞群)高度吻合为miR142-3p的目标。进一步，搜寻NCI60肿瘤数据库(60种国家癌研所细胞株的基因表达及微型核糖核酸图谱的数据库)，且筛选目标的表达量是与miR142-3p呈现负相关性者，结果显示Sox2(一种转录因子，常表达于胚胎干细胞及多种肿瘤类型的CSCs中)；及ADCY9(AC9)(一种与细胞膜结合的腺苷酸环化酶，于脑部高度表达)；其表达图谱是与miR142-3p者相反，即：相较于数据库中其他细胞株，Sox2及AC9于NCI60数据库的脑部肿瘤细胞株中高度表达，然而miR142-3p表达则为低落的(图1E)。Sox2、AC9及CD133mRNA量于70个原发性及30个复发性GBM病患样本的qRT-PCR分析，显示miR142-3p在原发性GBM组织中表达较高，而该三种miR142-3p可能的目标的确则会优先表达于复发性GBM组织中(图1F)。值得注意的是，统计分析该等基因于7组原发性及复发性GBM样本的mRNA表达，显示miR142-3p与该三个可能目标间的强烈的负相关性(图1G)。综论而言，以上资料指出miR142-3p表达是与Sox2、AC9及CD133的水平及GBM发展或复发呈现逆相关性。 

实施例2：结合Sox2及AC9高度表达程度以预测GBM病患的预后、存活及复发 

既然miR142-3p与Sox2、AC9、CD133及GBM发展或复发的间为逆相关性，下一个要探讨的是，该等分子表达水平与GBM病患的病况的间的关联性。Sox2、AC9、CD133及miR142-3p的表达，分别藉由免疫组织化学染色法及FISH，将来自7个GBM病患以样本数组表方式呈现而分析 (图2A，其中一具代表性示例呈现于A图中)。当与原发性(首次手术)GBM样本比较时，增加的Sox2、AC9、及CD133的表达量与复发的、几乎未分化的GBM组织(二次手术)呈现正相关(图2A及B)。GBM复发性及miR142-3p的表达水平间亦呈现一显著的负相关性(图2A及B)，此与先前资料吻合。为了决定Sox2、AC9、CD133与miR142-3p表达水平的预后的重要性，是依照该等基因表达图谱以Kaplan-Meier存活率分析GBM病患。结果显示该等病患的AC9或Sox2呈现阳性，但CD133则无呈现阳性时，其存活率下降；然而，相较于具有低度miR142-3p表达的病患，具有高度miR142-3p表达的病患具有较佳的存活率(图2C；表2)。 

再者，相较于具有高度miR142-3p表达及阴性的AC9及Sox2表达的病患，AC9及Sox2呈现阳性且miR142-3p呈现低表达的GBM病患被预测具有较低的存活率(p＝0.002，图2D)。然而，与图2C结果一致地，CD133对于GBM病患存活率不具指标效果，无论CD133于Sox2-AC9-miR142-3p^高度表达及Sox2⁺AC9⁺miR142-3p^低度表达的病患中是否存在，皆不会改变其存活率(图2E；p＝0.523：第1组vs第2组；p＝0.314：第3组vs第4组)。于该资料中，CD133的表达是与GBM复发呈现正相关(图1F及图2B)，但未与病患存活率呈现正相关(图2C及图2E)。综论的，该等资料指出Sox2⁺/AC9⁺/miR142-3p^低度表达的指标可做为疾病发展及GBM病患临床病况的具潜力的预测指标(p＜0.01；图2D及图2E)。 

实施例3：miR142-3p直接标靶Sox2、AC9、及CD133的3′UTR区域 

miR142-3p及Sox2、AC9、及CD133的间的逆相关性，暗示着可探究Sox2、AC9、及CD133是否可直接被miR142-3p所标靶。构建含有Sox2、AC9、及CD133的野生型(WT)(SEQ ID NOS.60-62)或其3′UTR区域的依序删除型(D1-D5)的荧光酵素报信子质体(图3A至图3C，右侧)。藉由将报信子质体与或不与miR142-3p同时转染至培养的复发性GBM细胞中以进行荧光酵素报信子试验，其中该复发性GBM细胞是分离自病患样本(图3A至图3C，左侧)。该结果显示miR142-3p标靶Sox2 3′UTR 的3′端附近(图3A)以及AC93′UTR的D1及D2间的区域(图3B)，即使以Targetscan预测程序(www.targetscan.org)未在Sox2及AC9的3’UTR序列中找到miR142-3p标靶序列。再者，如同Targetscan程序所预测，miR142-3p标靶CD1333′UTR区域，且D4及D5间的区域对于以miR142-3p为媒介的CD133的表达消除相当重要(p＜0.01；图3D)。根据此结果，将miR142-3p序列(SEQ ID NO.59)与每个3’UTR的可能区域进行比对，并预测于Sox2、AC9、及CD133中miR142-3p所标靶的区域(图3F)。接着构建含有野生型(WT)(SEQ ID NOS.53、55、57)或突变的miR142-3p标靶区域(SEQ ID NOS.54、56、58)的荧光酵素报信子质体(图3D，F)。报告试验显示miR142-3p抑制野生型标靶位置的荧光酵素活性，但不会抑制突变位置构建的荧光酵素活性(图3E)，暗示miR142-3p所媒介的Sox2、AC9、及CD133的抑制作用是基于该等被找到的序列。为了确认miR142-3p对于Sox2、AC9、及CD133的抑制作用的相关性，将miR142-3p反义及miR142-3p SPONGE构建体，其是由含有多个、串连的感兴趣miRNAs的结合位置的转录物所组成的miRNAs的竞争型抑制因子(Ebert et al.，2007)，与野生型或突变型3’UTR报信子共同转染至复发性GBM细胞中；经以miR142-3p反义及SPONGE构建体处理后，则不再能观察到抑制作用(图10)。综论的，该等资料指出Sox2、AC9、及CD133于复发性GBM细胞中为miR142-3p的直接抑制的目标。 

实施例4：过量表达miR142-3p于复发性GBM细胞中抑制致肿瘤性及转移/侵入能力 

为了分析miR142-3p于调控复发性GBM侵略能力的角色，藉由慢病毒感染来自两个病患(GBM1及GBM2)的复发性GBM细胞(rGBM)以过量表达miR142-3p。同时亦构建空的载体转染对照组(rGBM/pLV)。分别以北方墨点法(图4A下面2个墨点图)及西方墨点法(图4A，上面4个墨点图)分析该等细胞株的异位表达的miR142-3p及内源性Sox2、AC9、及CD133的蛋白量。于该等细胞株的功能性分析显示，相较于原本的(parental)rGBM及对照组rGBM/pLV细胞，过量表达miR142-3p的 rGBM(rGBM/miR142-3p)细胞株具有降低的球体形成能力(图4B)、较少的软琼脂聚落数目(图4C)、以及抑制的转移及侵入能力(图4D)。吾人进一步于rGBMs中探讨miR142-3p调控Sox2、AC9、及CD133的表达与致肿瘤性间的关连性。使用shRNA媒介的基因静默方式，将衍生自GBM1及GBM2样本的rGBM细胞中的Sox2、AC9、或CD133专一地剔弱(knocked-down)(图4E)，并将的进行活体外功能性分析及活体内肿瘤形成试验。与miR142-3p过量表达结果相似，剔弱研究显示Sox2或AC9但非CD133的shRNAs(图4F至G，将shSox2、shAC9、及shCD133与shScr比较；图12)可明显抑制rGBM细胞的侵入能力(图4F)、非贴附性(图11A至B)、球体形成能力(图11C至D)、及活体内致肿瘤性(图4G)。为了判定miR142-3p所调控的Sox2及AC9的向下调控是否确实归因于该miR142-3p的压抑效果被抑制，故将Sox2及AC9重新表达于rGBM/miR142-3p细胞中(图11E)，此导致增强的致肿瘤性(图11F)。如同预期，该细胞株的Sox2及AC9表达皆已很低(图11E，中间)，是归因于miR142-3p的存在，故将Sox2/AC9同时剔弱于此试验中仅具有很低的影响(图11F)。由此可推论miR142-3p及Sox2/AC9所媒介的rGBM致肿瘤性为同时发生的事件，且于rGBM中过量表达miR142-3p会部分地，若非全部地，降低肿瘤侵略特性，此是透过抑制Sox2及AC9表达所致。 

实施例5：去除miR142-3p会促进原发性GBM的癌症类干细胞及肿瘤诱发能力 

近期报告指出复发性GBM具有癌症类干细胞(CSC)特性的潜力且表达出侵略性肿瘤的特征。基于该等研究，以及根据本发明所发现者，于复发性GBM中miR142-3p表达低而于原发性GBM中表达高，miR142-3p与GBM的癌症干细胞性间的关是将进一步探讨。藉由miRNA SPONGE(Spg)方式，将内源性miR142-3p于原发性GBM细胞(pGBM)中剔弱，该原发性GBM细胞是由如前述的2个相同病患(GBM1及GBM2)所分离而得。于miR142-3p剔弱的原发性GBM(pGBM/Spg)细胞中，其内源性Sox2、AC9、及CD133蛋白表达比原本的pGBM及对照组(pGBM/Scr) 细胞较高(图5A)。接着，藉由球体形成及聚落形成试验评估pGBM/Spg细胞的自我新生及致肿瘤性能力；该两种能力于pGBM/Spg中皆比原本的或对照组细胞要高(p＜0.05；图5B)。吾人亦检查续代培养物中成功的球体形成，此为评估CSCs持续自我新生能力的一个重要指针，结果显示从该三个原发性GBM病患样本(GBM1-3)所建立的所有pGBM/Spg细胞株的自我新生能力，于培养好几代中皆被保留下来(图5C)。再者，于pGBM/Spg细胞的转移/侵入能力亦明显地较pGBM或pGBM/Scr细胞高(p＜0.05；图5D)，且于pGBM将miR142-3p剔弱亦可同时发现侧群细胞的细胞数目的增加(p＜0.05；图5E)，此点被认为可能是由于CSCs所造成的。miR142-3p于调控GBM-CSCs的角色可进一步藉由miR142-3p的水平于非CSC-GBM细胞中为高的，但于GBM-CSCs中为低的事实所支持。根据球体形成能力、CD133表面标记表达、以及侧群细胞鉴定(图13)，从7个GBM病患样本中分离出类CSC的GBM细胞。所有自7个病患所分离的GBM-CSCs展现低度的miR142-3p表达。此外，以生物信息分析转录体标记(transcriptome signature)，指出于pGBM中压抑miR142-3p，可促进标记朝向间充质干细胞(MSC)及胚胎干细胞(ESC；图5F及图14)转变。 

接着分析miR142-3P的向下调控是否增加活体内pGBM的肿瘤诱发活性。与不规则的SPONGE转染对照组比较，于异种移植非SCID小鼠中，吾人发现静默内源性miR142-3p可增加原发性GBM细胞的肿瘤形成能力(图5G，GFP讯号代表肿瘤所在位置)。数据显示于pGBM细胞中SPONGE-miR142-3p增加活体内肿瘤诱发能力10至10,000倍；其中该pGBM细胞是自6个GBM病患所分离(图5H；图15)。当将从8号病患所取得的pGBM细胞，以细胞数量为500,000个的多的数目注入NOD-SCID小鼠的纹状体时，无法形成肿瘤(图5H，原本的(parental))。然而，以SPONGE将miR142-3p剔弱后，只要用50个的少量细胞数目注入，即可于三个移植的NOD-SCID小鼠中的一个内再生出新的肿瘤；以1000个细胞注入，则三只小鼠皆会形成新肿瘤(图5H，miR142-3p SPONGE)。此证据证实于pGBM将miR142-3p向下调控可提供类干细胞特性以诱发及重新生成新的肿瘤。总而言的，于GBM细胞中维持miR142-3p于一低度的表达量，对于维持CSC特性及活体内肿瘤诱发活性而言十分重要。 

实施例6：藉由压抑miR142-3p或增强Sox2/AC9表达以维持间充质的转变 

相较于原发性GBM细胞，复发性GBM细胞已显示具有更多的侵略性及间充质特性。Carro等人(2010)证实神经胶质瘤特异性调控网络与一转录的模块有关，其可活化于恶性神经胶质瘤的间充质基因表达。为了探讨miR142-3p是否于GBM中主导间充质的转化，是使用微数组分析转录体图谱。生物信息分析结果显示于rGBM细胞中过量表达miR142-3p，会降低间充质的及诱导神经元的转录体，而于pGBM中静默miR142-3p可诱导间充质的转录体(图6A)。与此资料一致地，多维尺度(MDS)分析显示将miR142-3p剔弱会将pGBM细胞重新编码改造朝向间充质标记，然而，将miR142-3p过量表达于rGBM中，将使其从原本朝向间充质改向为原神经元性标记(图6B)。该数据证实miR142-3p出现与否会决定GBM细胞的干细胞性标记的特性。 

为了探明在miR142-3p依赖性的间充质转化中Sox2及AC9的参与，将表列的间充质倾向标记(YKL40(亦称为CHI3L1)、纤维粘连蛋白(fibronectin)、及波形蛋白(vimentin))及胶质纤维酸蛋白(glial fibrillaryacidic protein)(GFAP，一种特异性的神经胶细胞是标记)(Carro，M.S.，Lim，W.K.，Alvarez，M.J.，Bollo，R.J.，Zhao，X.，Snyder，E.Y.，Sulman，E.P.，Anne，S.L.，Doetsch，F.，Colman，H.，et al.2010.Nature 463，318-325.)进行比较。于rGBM细胞中双重剔弱Sox2/AC-9或过量表达miR142-3p，YKL40、纤维粘连蛋白、及波形蛋白转录物皆被减少，而GFAP转录物则被增加(图6C、图6E)。相反地，于pGBM中将Sox2/AC9过量表达或将miR142-3p静默，会导致GFAP被压抑，但提高了间充质倾向标记的表达(图6D、图6E)。值得注意的是，当额外同时过量表达Sox2/AC9，rGBM 细胞中由miR142-3p所媒介的间充质倾向标记的抑制作用会被增强；反之亦然(图16A)。使用免疫荧光染色分析衍生自rGBM/miR142-3p移植的免疫功能低下的小鼠的异种移植肿瘤，亦显示降低的胶原蛋白5a(Col5a，一种GBM的间充质标记)及纤维粘连蛋白的表达水平(图6F)；以及过量表达Sox2/AC9会恢复Col5a及纤维粘连蛋白的表达(未呈现数据)。miR142-3p-Sox2/AC9调控机制于间充质转化的角色是藉由伤口愈合移动试验进一步支持，于该试验中，miR142-3p所导致rGBM移动力的抑制，会经由同时过量表达Sox2/AC9而恢复，而miR142-3p SPONGE所媒介的增强的pGBM移动力，会藉由将Sox2/AC9双重剔弱抑制(图16B-C)。再者，累积存活率分析指出，相较于原本的rGBM移植小鼠，rGBM/miR142-3p移植的免疫功能低下小鼠具有增高的存活率；随着额外的Sox2/AC9同时过量表达，存活率则会下降(图6G，上图)。相反地，由miR142-3p SPONGE媒介的pGBM存活率下降，则可进一步藉由双重剔弱Sox2/AC9恢复(图6G，下图)。总言的，该等结果指出miR142-3p依赖性的GBM细胞间充质转化可能部分地，如非全部地，透过Sox2及AC9调控。 

实施例7：向下调控miR142-3p可增加对放射线敏感的原发性GBM的游离辐射抗性 

对于放射性治疗具抗性是为在恶性神经胶质瘤中判定癌症干细胞(CSCs)的主要的临床要件之一(Bao et al.，2006)。miR142-3p调控GBM的放射线敏感性的方式遂被评估。为了判定放射线敏感性，使用游离辐射(IR)剂量从0到10Gy以治疗复发性GBM，且伴随着或不伴随着miR142-3p过量表达。如图7A显示，经过IR治疗后，没有以miR142-3p过量表达(rGBM/pLV及原本的rGBM细胞)时，存活的rGBM细胞数目明显高于该等rGBM/miR142-3p细胞(P＜0.01；图7A)。相反地，相较于原本的(parental)及载体对照组(图7B)，以SPONGE miR142-3p处理的原发性GBM细胞具有较高的存活率，以及亦具有较高程度的抗放射线性。为了进一步评估miR142-3p于含有rGBM肿瘤的免疫功能低下小鼠的 放射线敏感性效果，将rGBM/miR142-3p及rGBM/pLV注射入小鼠中，并以4Gy IR治疗，并以GFP阳性区域分析肿瘤大小(图7C)。结果显示，相较于rGBM/pLV肿瘤，经放射性治疗后，miR142-3p减低肿瘤大小。含有rGBM/pLV肿瘤或rGBM/miR142-3p肿瘤的小鼠是以或不以IR治疗，且监控肿瘤生长6周(图7D)。经过移植6周后(rGBM/pLV)，rGBM细胞形成一大型的脑部肿瘤；而经IR治疗对于肿瘤生长仅具有有限的抑制效果(rGBM/pLV/IR)。相反地，过量表达miR142-3p可大幅度地抑制肿瘤生长(rGBM/miR142-3p)；且伴随着额外的IR治疗，肿瘤大小几乎被维持在难以检测到的程度(rGBM/miR142-3p/IR)。此结果不仅确认了miR142-3p对于肿瘤生长的抑制作用的角色，亦呈现miR142-3p及IR疗法的协同作用。再者，为了探讨Sox2及AC9于miR142-3p所媒介的放射线敏感性的参与性，将小鼠移植pGBM/Scr、pGBM/Spg、或pGBM/Spg+shSox2/shAC9细胞，并以IR或不以IR治疗，再以MRI影像监控(图7E-F)。结果显示，相较于对照组pGBM/Scr细胞的放射线敏感性，即使伴随IR治疗，将内源性miR142-3p(pGBM/Spg)静默明显地促进肿瘤生长(图7F)。当额外将Sox2及AC9双重剔弱(pGBM/Spg/shSox2+shAC9)后，pGBM/Spg的放射线敏感性增加了。再者，双重剔弱Sox2及AC9对放射线敏感性的恢复功效，亦可于活体内pGBM肿瘤诱发能力试验中被观察到(图7G)。miR142-3p-SPONGE在pGBM细胞所媒介的提高的肿瘤诱发能力，会被双重剔弱Sox2/AC9所抑制，且此抑制作用经IR治疗后更加明显。综论的，该等资料指出miR142-3p使得GBM细胞对于IR敏感化，且Sox2及AC9皆参与此一作用。 

实施例8：于rGBM移植小鼠中原位递送miR142-3p，以弱化致肿瘤性及间充质侵略性，并恢复放射线敏感性。 

以往，藉由腺病毒载体或注射以锁核酸(LNA)或磷酸硫代二酯修饰的骨架所构建的miRNAs进行miRNA的基因递送，在肿瘤发展上展现一可靠的抑制作用(Zhang，Y.，Qu，Z.，Kim，S.，Shi，V.，Liao，B.，Kraft，P.，Bandaru，R.，Wu，Y.，Greenberger，L.M.，and Horak，I.D.2010.Gene Ther.； Patrick，D.M.，Montgomery，R.L.，Qi，X.，Obad，S.，Kauppinen，S.，Hill，J.A.，van Rooij，E.，and Olson，E.N.2010.J Clin Invest 120，3912-3916.)。经LNA修饰的miR-142-3p寡核苷酸于抑制复发性GBM肿瘤的潜在疗效遂被分析(图8A)。将LNA修饰的突变的或野生型miR-142-3p(分别为MutLNA-miR142-3p及LNA-miR142-3p)注射至肿瘤所在位置5天前，先将rGBM-GFP细胞注入小鼠的脑部的纹状体中。相较于以MutLNA-miR142-3p注射的rGBM-GFP肿瘤，根据GFP影像，LNA-miR142-3p减少了肿瘤体积(图8A)；且LNA-miR142-3p对于肿瘤大小的抑制效果亦可于衍生自GBM1及GBM2的rGBM肿瘤上被观察到(图8B)。为了分析肿瘤缩小是否归因于肿瘤转变成其他神经胶质瘤细胞类型所致，将以Mut LNA-miR142-3p或LNA-miR142-3p处理的小鼠的脑部肿瘤样本切片进行染色，结果显示于LNA-miR142-3p处理的肿瘤中，波形蛋白、及纤维粘连蛋白的表达降低(图8C)。此病理分析暗示经LNA-miR142-3p注射会降低rGBM肿瘤的间充质特性。再者，间充质标记(YKL40、神经巢蛋白、纤维粘连蛋白(FN)、波形蛋白(VM))及干细胞性基因(Oct4、Sox2、Nanog、Klf4)的表达水平明显地于以LNA-miR142-3p处理的rGBM肿瘤中被抑制了(图8D)。活体内的LNA-miR142-3p的放射线敏感性功效接着被分析；相较于Mut LNA-miR142-3p加上IR治疗的肿瘤，经LNA-miR142-3p及IR治疗后，可观察到rGBM肿瘤体积明显降低(图8E)。值得注意的是，虽然单独以LNA-miR142-3p处理时似乎可做为一种肿瘤抑制剂(*p＜0.05；图8E，右图中的白线)，但LNA-miR142-3p及IR的协同作用将可更进一步抑制肿瘤体积(#p＜0.05；图8E右图)。综论的，经微脂体包埋的LNA-修饰的miR142-3p寡核苷酸注射，可使颅内rGBM细胞转变为较不具恶性的神经胶质瘤细胞，大幅度地降低间充质特性及明显的改善放射线敏感性。 

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。