一种黄瓜雌性系育种的分子标记辅助选择方法

摘要

本发明公开了一种黄瓜雌性系育种的分子标记辅助选择方法，该方法是：利用黄瓜全雌品种240-1-2-2-3-1自交系、弱雌品种3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系及其F

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种黄瓜雌性系育种的分子标记辅助选择方法，属于蔬菜分子遗传育 种技术领域。

背景技术

黄瓜是我国主要蔬菜作物之一，具有极高的经济和社会价值。黄瓜植株性型多样，有 纯雄株、两性花株、雌雄同株、雄花两性花株和全雌株等多种类型。限制黄瓜经济产量的 首要因子是植株雌雄花比例，因为除全雌株外，其它性型植株都表现为枝叶繁茂、源大库 少、经济系数低。雌性系黄瓜是指植株只长雌花而不长雄花或长极少量雄花的品系。此品 系往往表现出早熟、瓜密、采瓜期集中、丰产性强等优点。利用雌性系作母本配制的一代 杂种也多表现出早熟、采瓜期集中和丰产等优点。同时，利用雌性系制备杂种一代无需人 工授粉，节约了劳动力，降低了制种成本，而且制成的一代杂种纯度很高。因此，对黄瓜 育种来说，雌性系在杂种优势利用以及杂交制种中极具利用价值，雌性系的选育与应用是 黄瓜育种中一项重要的研究内容。

目前，黄瓜雌性系的选育主要依靠田间开花习性进行表型鉴定，该方法不仅需时漫长， 会消耗大量的人力、物力，而且黄瓜植株性型复杂，易受外界条件影响而发生变化，所以 从表型上进行全雌性基因的选择效率不高，雌性系的选育难度大、成功率低，选育的黄瓜 雌性系品种大都存在雌性不稳定，易受栽培环境影响等弊端。分子标记的出现，为雌性系 的选育提供了新的途径，利用分子标记不仅可以定位目标基因，也可以利用与目标基因紧 密连锁的分子标记追踪目标基因，实现对目标性状的间接选择，这就是所谓的分子标记辅 助选择（Molecular Marker Assisted Selection）。与传统表型选择相比，它具有以下优 点：（1）对目标性状的选择不受基因表达和环境因素的影响；（2）可在早代和植株生长的 任何阶段进行选择，大大缩短了育种年限；（3）在分离世代能够快速地鉴定植株的基因型， 不受基因显隐性的影响；（4）可以打破目标基因与不利基因的连锁。其中，SSR分子标记 是利用真核生物基因组中存在的大量微卫星重复序列设计引物，通过PCR扩增串联的重复 序列，依据微卫星的重复次数在同一物种不同基因型间的差异，揭示长度多态性。由于SSR 标记在单个座位上检测到的多态性远高于其它几种分子标记，且广泛、随机、均匀地分布 于整个基因组，具共显性遗传，分布广、稳定性和多态率高，操作简单、重复性好、对DNA 质量要求较低等特点，能准确高效地鉴别大量等位基因，应用与目的基因相连锁的分子标 记进行辅助育种能直接从基因型上对后代单株进行选择，实现苗期的性型鉴定，提高选择 效率及准确性，从而加快黄瓜雌性系育种进程，在黄瓜雌性系育种中具有极高的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于：针对现有黄瓜雌性系育种中常规采用的田间鉴定与植株表型相结 合方法所存在的工作量大、周期长、易受环境条件的影响、育种效率低、成本高等缺陷， 提供一种在黄瓜雌性系育种进程中，用于早期分离世代与苗期雌性系鉴定，能准确、快速、 高效选择出雌性系材料的分子标记辅助选择的方法。

本发明目的通过以下技术方案得以实现：所述的黄瓜雌性系育种的分子标记辅助选择 方法，其特征在于所述的方法按以下步骤进行：

（1）待检测黄瓜叶片样品的采集：将待检测黄瓜材料播种，待1-2片真叶期时，取 植株顶部较为幼嫩的叶片，每份0.5g，采集后现用或在-20℃下冷冻保存；

（2）黄瓜对照样品叶片的采集：将黄瓜全雌品种240-1-2-2-3-1自交系、弱雌品种 3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系材料播种，待1-2片真叶期时，取植株顶部较为幼嫩的叶片，每 份0.5g，采集后现用或在-20℃下冷冻保存；

（3）样品基因组DNA提取：用CTAB法提取每株叶片DNA；称取150mg新鲜的叶 片，连同适配器、研磨球在液氮中预冷，使用MM301细胞破碎仪研磨成粉末状；研磨程 序设定为：研磨时间1.5min，研磨频率20Hz。研磨后加入2×CTAB提取缓冲液700μl（事 先预热至65℃）浸透粉末并倒转离心管，使粉末充分散开，于65℃水浴保温30min，其间 轻柔混合2-3次；取出离心管，冷至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒混匀，静 置10min，12000rpm离心15min；转移上清于另一离心管中，加入2/3体积的预冷异丙醇， 轻缓颠倒混匀，室温放置15min，12000rpm离心10min，去上清，将离心管倒置于吸水纸 上，控干上清；用700μl 70%的乙醇洗涤沉淀2次，室温下微干，加入300μl去离子水溶 解沉淀，加入等体积的氯仿/异戊醇抽提2次，吸取上清，加入1/5体积的NaAc，2.5倍体 积的预冷无水乙醇沉淀DNA，放置1h左右，12000rpm离心10min，去上清；用700μl 70% 的乙醇洗涤沉淀2次，通风干燥或者自然干燥；加入30μl去离子水溶解DNA，保存于-80℃ 超低温冰箱备用；制1%琼脂糖凝胶进行检测；用SMA3000微量紫外分光光度计测定提取 DNA的浓度和纯度，将DNA稀释到所需浓度，分装，置于-20℃保存备用；

（4）获得与黄瓜全雌性相关基因的分子标记：对黄瓜全雌品种240-1-2-2-3-1自交系 和弱雌品种3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系及其F₂代DNA样本进行SSR分子标记分析；选用699 对SSR引物进行PCR扩增，PCR扩增反应总体系为20μl，扩增反应体系成分为：黄瓜基因 组DNA20ng，10pmol/μl引物各0.4μl，2.5mM Mg²⁺2μl，2mM dNTP1μl，5U/μl Taq DNA聚 合酶0.1μl，10×buffer 2μl，加无菌重蒸水补齐至20μl；

（5）样品鉴定：利用获得的标记引物进行PCR扩增，对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝 胶电泳分离分析，获得多态性片段，根据凝胶上谱带的相对位置，选择电泳带型与供体亲 本相同的单株，结合田间鉴定和其他育种目标性状的选择；选择出具有全雌性特征的优良 单株。

步骤（3）中，研磨程序设定为：研磨时间1.5min，研磨频率20Hz；研磨后加入事先 预热至65℃的2×CTAB提取缓冲液700μl浸透粉末；利用正交试验，建立黄瓜全雌性基 因连锁特异片段的最佳扩增体系。

步骤（4）中，PCR反应扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，按特定引物 特定温度退火1min，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min；在20μl的PCR扩增产 物中加入8μl Loading Buffer 94℃变性5min，迅速置于冰上冷却；每样品各取6μl上样于6% 变性聚丙烯酰胺凝胶上，在恒定100W功率下电泳至溴酚蓝到达凝胶另一端；银染后，在 胶片观察灯上照相、观察，对在亲本间表现出共显性分离的引物利用F₂代强雌和弱雌混合 基因池进行再次筛选，从而获得与黄瓜全雌性紧密连锁的一个SSR多态性片段，其标记引 物为CSWCT25。

本发明的有益效果是：

（1）本发明采用了对目标材料DNA进行PCR及SSR分子标记技术，该技术具有高效和 低成本的特点，适合对大量样本材料进行分析与鉴定，大大提高了选择效率；

（2）本发明可在任何时期对黄瓜育种材料进行准确、快速的检测，周年均可在实验 室内进行，不受环境条件的影响，且不影响植株的正常生长；

本发明分子标记辅助选择黄瓜雌性系育种方法，与常规育种、鉴定方法相比，具有周 期短、成本低、操作简便等优点。

附图说明

图1为CSWCT25标记引物在亲本及F₂群体中部分单株PCR扩增产物的凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但以下描述不对本发明的保护范围构成 任何意义上的限定。

本发明用于黄瓜雌性系分子标记辅助选择的PCR扩增及SSR标记引物（CSWCT25）， 其中正向引物序列：5′-AAAGAAATTAAGTCAATCAAACCG-3′，反向引物序列：5′- CCCACCAATAGTAAAATTATACAT-3′。

本发明所述的黄瓜雌性系育种的分子标记辅助选择方法，它按以下步骤进行：

（1）待检测黄瓜叶片样品的采集：将待检测黄瓜材料播种，待1-2片真叶期时，取 植株顶部较为幼嫩的叶片，每份0.5g，采集后现用或在-20℃下冷冻保存；

（2）黄瓜对照样品叶片的采集：将黄瓜全雌品种240-1-2-2-3-1自交系、弱雌品种 3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系材料播种，待1-2片真叶期时，取植株顶部较为幼嫩的叶片，每 份0.5g，采集后现用或在-20℃下冷冻保存；

（3）样品基因组DNA提取：用CTAB法提取每株叶片DNA；称取150mg新鲜的叶 片，连同适配器、研磨球在液氮中预冷，使用MM301细胞破碎仪研磨成粉末状；研磨程 序设定为：研磨时间1.5min，研磨频率20Hz。研磨后加入2×CTAB提取缓冲液700μl（事 先预热至65℃）浸透粉末并倒转离心管，使粉末充分散开，于65℃水浴保温30min，其间 轻柔混合2-3次；取出离心管，冷至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒混匀，静 置10min，12000rpm离心15min；转移上清于另一离心管中，加入2/3体积的预冷异丙醇， 轻缓颠倒混匀，室温放置15min，12000rpm离心10min，去上清，将离心管倒置于吸水纸 上，控干上清；用700μl 70%的乙醇洗涤沉淀2次，室温下微干，加入300μl去离子水溶 解沉淀，加入等体积的氯仿/异戊醇抽提2次，吸取上清，加入1/5体积的NaAc，2.5倍体 积的预冷无水乙醇沉淀DNA，放置1h左右，12000rpm离心10min，去上清；用700μl 70% 的乙醇洗涤沉淀2次，通风干燥或者自然干燥；加入30μl去离子水溶解DNA，保存于-80℃ 超低温冰箱备用；制1%琼脂糖凝胶进行检测；用SMA3000微量紫外分光光度计测定提取 DNA的浓度和纯度，将DNA稀释到所需浓度，分装，置于-20℃保存备用；

（4）获得与黄瓜全雌性相关基因的分子标记：对黄瓜全雌品种240-1-2-2-3-1自交系 和弱雌品种3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系及其F₂代DNA样本进行SSR分子标记分析；选用699 对SSR引物进行PCR扩增，PCR扩增反应总体系为20μl，扩增反应体系成分为：黄瓜基因 组DNA20ng，10pmol/μl引物各0.4μl，2.5mM Mg²⁺2μl，2mM dNTP1μl，5U/μl Taq DNA聚 合酶0.1μl，10×buffer 2μl，加无菌重蒸水补齐至20μl；

（5）样品鉴定：利用获得的标记引物进行PCR扩增，对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝 胶电泳分离分析，获得多态性片段，根据凝胶上谱带的相对位置，选择电泳带型与供体亲 本相同的单株，结合田间鉴定和其他育种目标性状的选择；选择出具有全雌性特征的优良 单株。

步骤（3）中，研磨程序设定为：研磨时间1.5min，研磨频率20Hz；研磨后加入事先 预热至65℃的2×CTAB提取缓冲液700μl浸透粉末；利用正交试验，建立黄瓜全雌性基 因连锁特异片段的最佳扩增体系。

步骤（4）中，PCR反应扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，按特定引物 特定温度退火1min，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min；在20μl的PCR扩增产 物中加入8μl Loading Buffer 94℃变性5min，迅速置于冰上冷却；每样品各取6μl上样于6% 变性聚丙烯酰胺凝胶上，在恒定100W功率下电泳至溴酚蓝到达凝胶另一端；银染后，在 胶片观察灯上照相、观察，对在亲本间表现出共显性分离的引物利用F₂代强雌和弱雌混合 基因池进行再次筛选，从而获得与黄瓜全雌性紧密连锁的一个SSR多态性片段，其标记引 物为CSWCT25。

实施例1：（利用分子标记辅助选择方法对杂交后代材料的抗性检测1）

（1）待检测黄瓜叶片样品的采集：将待检测黄瓜材料H174-1-2播种，待1-2片真叶 期时，取植株顶部较为幼嫩的叶片，每份0.5g，采集后现用或在-20℃下冷冻保存；

（2）黄瓜对照样品叶片的采集：将黄瓜全雌品种240-1-2-2-3-1自交系、弱雌品种 3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系材料播种，待1-2片真叶期时，取植株顶部较为幼嫩的叶片，每 份0.5，采集后现用或在-20℃下冷冻保存；

（3）样品基因组DNA提取：用CTAB法提取每株叶片DNA。称取150mg新鲜的叶 片，连同适配器、研磨球在液氮中预冷，使用MM301细胞破碎仪研磨成粉末状。研磨程 序设定为：研磨时间1.5min，研磨频率20Hz。研磨后加入2×CTAB提取缓冲液700μl（事 先预热至65℃）浸透粉末并倒转离心管，使粉末充分散开，于65℃水浴保温30min，其间 轻柔混合2-3次。取出离心管，冷至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒混匀，静 置10min。12000rpm离心15min。转移上清于另一离心管中，加入2/3体积的预冷异丙醇， 轻缓颠倒混匀，室温放置15min。12000rpm离心10min，去上清，将离心管倒置于吸水纸 上，控干上清。用700μl 70%的乙醇洗涤沉淀2次，室温下微干。加入300μl去离子水溶 解沉淀。加入等体积的氯仿/异戊醇抽提2次。吸取上清，加入1/5体积的NaAc，2.5倍体 积的预冷无水乙醇沉淀DNA，放置1h左右，12000rpm离心10min，去上清。用700μl 70% 的乙醇洗涤沉淀2次，通风干燥或者自然干燥。加入30μl去离子水溶解DNA，保存于-80℃ 超低温冰箱备用。制1%琼脂糖凝胶进行检测。用SMA3000微量紫外分光光度计测定提取 DNA的浓度和纯度，将DNA稀释到所需浓度，分装，置于-20℃保存备用；

（4）PCR扩增及扩增产物检测：对黄瓜全雌品种240-1-2-2-3-1自交系和弱雌品种 3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系及H174-1-2的DNA样本进行SSR分子标记分析，标记引物为 CSWCT25。PCR扩增反应总体系为20μl，扩增反应体系成分为：黄瓜基因组DNA20ng， 10pmol/μl引物各0.4μl，2.5mM Mg²⁺2μl，2mM dNTP1μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.1μl， 10×buffer 2μl，加无菌重蒸水补齐至20μl。

PCR反应扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，按特定引物特定温度退火 1min，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min；在20μl的PCR扩增产物中加入8μl Loading Buffer 94℃变性5min，迅速置于冰上冷却。每样品各取6μl上样于6%变性聚丙烯 酰胺凝胶上，在恒定100W功率下电泳至溴酚蓝到达凝胶另一端。银染后，在胶片观察灯 上照相、观察并记录结果；

（5）样品鉴定：利用获得的标记引物进行PCR扩增，对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝 胶电泳分离分析，获得多态性片段，H174-1-2凝胶上谱带的相对位置，与240-1-2-2-3-1自 交系扩增出的片段相同，说明该品种是全雌性品种，结合田间鉴定和其他育种目标性状的 选择，与田间接种鉴定结果完全符合，说明本发明所建立的检测方法能准确、快速的鉴定 出黄瓜全雌性优良单株。

实施例2：（利用分子标记辅助选择方法对杂交后代材料的抗性检测2）

（1）待检测黄瓜叶片样品的采集：将待检测黄瓜材料H158-1-1-2-2播种，待1-2片 真叶期时，取植株顶部较为幼嫩的叶片，每份0.5g，采集后现用或在-20℃下冷冻保存；

（2）黄瓜对照样品叶片的采集：将黄瓜全雌品种240-1-2-2-3-1自交系、弱雌品种 3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系材料播种，待1-2片真叶期时，取植株顶部较为幼嫩的叶片，每 份0.5g，采集后现用或在-20℃下冷冻保存；

（3）样品基因组DNA提取：用CTAB法提取每株叶片DNA。称取150mg新鲜的叶 片，连同适配器、研磨球在液氮中预冷，使用MM301细胞破碎仪研磨成粉末状。研磨程 序设定为：研磨时间1.5min，研磨频率20Hz。研磨后加入2×CTAB提取缓冲液700μl（事 先预热至65℃）浸透粉末并倒转离心管，使粉末充分散开，于65℃水浴保温30min，其间 轻柔混合2-3次。取出离心管，冷至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒混匀，静 置10min。12000rpm离心15min。转移上清于另一离心管中，加入2/3体积的预冷异丙醇， 轻缓颠倒混匀，室温放置15min。12000rpm离心10min，去上清，将离心管倒置于吸水纸 上，控干上清。用700μl 70%的乙醇洗涤沉淀2次，室温下微干。加入300μl去离子水溶 解沉淀。加入等体积的氯仿/异戊醇抽提2次。吸取上清，加入1/5体积的NaAc，2.5倍体 积的预冷无水乙醇沉淀DNA，放置1h左右，12000rpm离心10min，去上清。用700μl 70% 的乙醇洗涤沉淀2次，通风干燥或者自然干燥。加入30μl去离子水溶解DNA，保存于-80℃ 超低温冰箱备用。制1%琼脂糖凝胶进行检测。用SMA3000微量紫外分光光度计测定提取 DNA的浓度和纯度，将DNA稀释到所需浓度，分装，置于-20℃保存备用；

（4）PCR扩增及扩增产物检测：对黄瓜全雌品种240-1-2-2-3-1自交系和弱雌品种 3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系及H158-1-1-2-2的DNA样本进行SSR分子标记分析，标记引物为 CSWCT25。PCR扩增反应总体系为20μl，扩增反应体系成分为：黄瓜基因组DNA20ng， 10pmol/μl引物各0.4μl，2.5mM Mg²⁺2μl，2mM dNTP1μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.1μl， 10×buffer 2μl，加无菌重蒸水补齐至20μl。

PCR反应扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，按特定引物特定温度退火 1min，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min；在20μl的PCR扩增产物中加入8μl Loading Buffer 94℃变性5min，迅速置于冰上冷却。每样品各取6μl上样于6%变性聚丙烯 酰胺凝胶上，在恒定100W功率下电泳至溴酚蓝到达凝胶另一端。银染后，在胶片观察灯 上照相、观察并记录结果；

（5）样品鉴定：利用获得的标记引物进行PCR扩增，对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝 胶电泳分离分析，获得多态性片段，H158-1-1-2-2凝胶上谱带的相对位置，与 3-5-1-3-2-1-1-1-1-2自交系扩增出的片段相同，说明该品种不是全雌性品种，结合田间鉴定 和其他育种目标性状的选择，与田间接种鉴定结果完全符合。

<110>浙江省农业科学院

<120>一种黄瓜雌性系育种的分子标记辅助选择方法

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<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<222>（1）…（24）

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<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<222>（1）…（24）

<400> 2

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