一种来源于嗜酸耐热菌的第113家族的新β-甘露聚糖酶、基因和及其应用

摘要

本发明涉及基因工程领域，具体地涉及一种来源于嗜酸耐热菌的第113家族的新β-甘露聚糖酶、基因和及其应用。根据本发明的β-甘露聚糖酶MAN113A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的甘露聚糖酶具有以下几个优点：宽的pH（5-8）作用范围、良好的热稳定性、强的蛋白酶抗性。所有这些优点都意味着新发明的β-甘露聚糖酶在饲料、食品、医药等行业中，将会更有应用价值比以前所报道的β-甘露聚糖酶。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地涉及一种来源于嗜酸耐热菌的第113家族的新β-甘露聚糖酶、基因和及其应用。

背景技术

植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素及木质素等物质构成。甘露聚糖是植物半纤维素的重要组分，是由β-1，4-D-甘露糖连接而成的线状多聚体，在多糖的侧链上主要有葡萄糖基、乙酰基和半乳糖基等取代基团。甘露聚糖具有高亲水性，在单胃动物的消化道内大量吸水，增加了消化道内容物的黏度，抵抗胃肠蠕动，直接影响动物对营养物质的消化吸收。

β-甘露聚糖酶(β-mannanase)是一类能够水解含有甘露糖苷键的甘露聚糖(包括异甘露聚糖)的内切水解酶，其主要水解产物为单糖、二糖、三糖、四糖等低聚糖。β-甘露聚糖酶来源广泛，普遍存在于微生物、植物和动物中，有着广阔的应用前景。在饲料工业中，β-甘露聚糖酶是一种环保型饲料添加剂，减轻环境污染，消除抗营养因子的作用，提高饲料利用率，促进营养物质吸收、改善饲料转换率、减少抗生素等化学药品的使用，以及提高动物生产性能。在食品工业中，β-甘露聚糖酶可用于降解植物胶，生产功能性低聚甘露糖，也可用于食品的加工、贮藏和果汁澄清。在造纸工业中，β-甘露聚糖酶可运用于纸浆的漂白工艺。在纺织工业中，β-甘露聚糖酶用于降解天然纤维中的半纤维素胶质,并能有效地去除纺织印染产品上黏附的多余染料，以取代常规的化学处理工艺，降低了能耗和对环境的污染。在洗涤工业中，β-甘露聚糖酶可用作洗涤剂添加剂。

近年来，随着甘露寡糖生理功能的发现，绿色饲料的兴起以及人们环保意识的增强，以及β-甘露聚糖酶潜在应用价值认识逐步的加深在β-甘露聚糖酶研究起到了推波助澜的作用。许多β-甘露聚糖酶基因被克隆、表达以及性质测定，其中细菌来源的甘露聚糖酶主要是酸偏中性的甘露聚糖酶。其分子量多在35kDa～55kDa之间，最适反应作用温度为50℃～70℃。真菌的β-甘露聚糖酶一般呈酸性，分子量大约在45kDa～55kDa，最适作用pH为4.0~6.0，最适作用温度为55℃～75℃。相对细菌而言，真菌来源的β-甘露聚糖酶最适反应pH值、pH稳定性都偏低，耐热性比细菌差。已发现的80多个β-甘露聚糖酶可以被划分到糖苷水解酶家族5,26和113，其中绝大多数的甘露聚糖酶都分布在第5家族和26家族，目前只少数第113家族的甘露聚糖酶被报道，本研究发现的甘露聚糖酶是又一个新的第113家族的甘露聚糖酶。目前已经被报道的β-甘露聚糖酶的性质，均存在一些缺陷，例如，pH作用范围不合适，热稳定性差，表达量低等，均不能满足实际应用的需要。因此人们希望能够找到一种新的能够满足实际应用需求的β-甘露聚糖酶，从而能够进一步推广该β-甘露聚糖酶在饲料、食品、医药等行业中应用。

本发明从云南保山高温温泉出水处的土样中分离的Alicyclobacillus hesperidumA4菌株中得到了一个新的β-甘露聚糖酶基因，其编码的甘露聚糖酶具有以下几个优点：宽的pH（5--8）作用范围、良好的热稳定性、强的蛋白酶抗性。所有这些优点都意味着新发明的β-甘露聚糖酶在饲料、食品、医药等行业中，将会更有应用价值比以前所报道的β-甘露聚糖酶。

发明内容

本发明目的是提供来源于嗜酸耐热脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus hesperidumA4株的热稳定性良好，pH作用范围广的β-甘露聚糖酶。

本发明的再一目的是提供上述热稳定性良好，pH作用范围广的β-甘露聚糖酶基因。

本发明的再一目的是提供包含上述热稳定性良好，pH作用范围广的β-甘露聚糖酶重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述热稳定性良好，pH作用范围广的β-甘露聚糖酶基因的重组菌株。

本发明的再一目的是提供一种制备上述热稳定性良好，pH作用范围广的β-甘露聚糖酶的方法。

本发明的再一目的是提供上述稳定性良好，pH作用范围广的β-甘露聚糖酶的应用。本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、食品、医药等行业中应用的新β-甘露聚糖酶。所述β-甘露聚糖酶来源于嗜酸耐热脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus hesperidum A4，于2009年6月29日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.3147（CN101701214A）。

从上述菌株中获得了一种热稳定性良好，pH作用范围广的β-甘露聚糖酶MAN113A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1：

MSFAYIKGMT WGWVGHADTW DTLEAEHSMR EMAKLGINWT AIAFQGLQSD

PHATTIRFNE 60

PPMVSDKEVT VAIDRAHAMG LKVCLKPVVN CADGTWRAHI DFPDDAQGNE

PSWSAWFASY 120

SEFILHYAHI AETTACEMFC IGCEMVAADR RANEWRSLIE RVREVYHGPI

TYNCNHHQEE 180

KVTWWDAVDL VSTSAYYPET EWKERVPVLR AFAQSVGKPV FFMEVGCPSR

KGSAQKPYDW 240

THPGAVDLEE QAQFYQTMFD AMENESWFYG FMLWDWPSRL YPREEAAHNR

DYCMYGKPAE 300

DIIRSFYASR 310

其中，该酶全长310个氨基酸，属于糖基水解酶第113家族，N端没有信号肽结构，属于胞内酶。其蛋白的理论分子量为36kDa。

该β-甘露聚糖酶MAN113A同时具较好的热稳定性和有宽的作用pH范围，最适温度为55℃，在35～60℃间能维持50%以上的酶活性；在60℃处理30min，保持30%的酶活性；最适pH为6.0，在pH5.0-7.5范围内，酶活能维持70%以上；同时具有极好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶处理能力。作为一种新型的酶制剂，该酶可广泛用于动物饲料、食品、医药、酿酒、能源工业等。

本发明还提供了编码上述热稳定性良好，pH作用范围广的β-甘露聚糖酶的基因。该酶的全基因序列如SEQ ID NO.2所示：

ATGTCTTTTG CATATATCAA GGGAATGACG TGGGGATGGG TCGGTCACGC

TGATACTTGG 60

GACACACTCG AAGCGGAACA CTCGATGCGC GAGATGGCGA AACTCGGGAT

CAATTGGACG 120

GCCATCGCAT TTCAAGGTCT ACAATCCGAT CCGCATGCGA CCACCATTCG

CTTTAACGAG 180

CCGCCGATGG TCAGCGACAA AGAAGTGACC GTCGCCATTG ACCGAGCACA

CGCAATGGGA 240

CTTAAAGTTT GTCTGAAGCC AGTCGTTAAC TGCGCGGATG GCACCTGGCG

CGCTCATATT 300

GATTTTCCAG ATGATGCGCA AGGTAACGAG CCGTCGTGGA GCGCTTGGTT

CGCCAGTTAT 360

AGCGAGTTTA TCCTGCACTA TGCGCACATC GCGGAGACGA CAGCATGCGA

GATGTTCTGC 420

ATTGGTTGCG AAATGGTGGC GGCGGATCGC AGAGCCAACG AATGGCGGTC

CCTTATCGAG 480

CGCGTGCGGG AAGTTTATCA CGGCCCCATC ACATACAATT GTAACCACCA

TCAAGAGGAG 540

AAGGTTACCT GGTGGGACGC GGTCGATCTC GTCTCCACGA GCGCCTATTA

TCCGGAAACC 600

GAGTGGAAAG AGCGAGTTCC TGTCCTGCGC GCATTCGCCC AAAGCGTGGG

CAAACCCGTG 660

TTCTTCATGG AAGTTGGCTG TCCAAGCCGC AAAGGCTCAG CACAAAAGCC

TTACGATTGG 720

ACACACCCAG GCGCAGTCGA TCTCGAAGAA CAGGCCCAGT TCTATCAGAC

GATGTTTGAC 780

GCCATGGAAA ACGAGTCTTG GTTCTATGGA TTCATGTTGT GGGATTGGCC

AAGTCGCCTC 840

TACCCACGCG AGGAAGCTGC CCACAATCGG GATTACTGCA TGTATGGGAA

ACCTGCCGAA 900

GACATCATCC GGTCGTTTTA CGCATCTCGA TAA933

本发明通过PCR的方法分离克隆了这β-甘露聚糖酶基因man113A，DNA全序列分析结果表明，β-甘露聚糖酶MAN113A基因全长933bp，编码310个氨基酸和一个终止密码子。

将β-甘露聚糖酶基因man113A序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对发现，与Paenibacillus mucilagnosusKNP414（AEI40686）来源的一个假使蛋白具有最高的氨基酸序列一致性为55%。与做过功能验证的来源于Alicyclobacillus acidocalddarius(ABG77968)的内切β-甘露聚糖酶最高一致性也仅为55%。说明MAN113A是一种新的甘露聚糖酶。

本发明还提供了包含上述热稳定性良好，pH作用范围广的β-甘露聚糖酶MAN113A基因的重组载体，优选为pET30a-man113A。将本发明的β-甘露聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将β-甘露聚糖酶基因插入到质粒pET30a上的Nde I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于T7启动子的下游并受其调控，得到重组大肠杆菌表达质粒pET30a-man113A。

本发明还提供了包含上述β-甘露聚糖酶基因的重组菌株，优选为重组菌株BL21/man113A。

本发明还提供了一种制备热稳定性良好，pH作用范围广的β-甘露聚糖酶的方法，包括以下步骤：

1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组β-甘露聚糖酶的表达；以及

3)纯化所表达的β-甘露聚糖酶

本发明还提供了上述作用pH范围广的β-甘露聚糖酶的应用。运用基因工程手段来产业化生产pH作用范围广的甘露聚糖酶产品还未见报道。本发明提供了一个新的甘露聚糖酶基因，其编码的甘露聚糖酶具有热稳定性良好，pH作用范围广的β-甘露聚糖酶，可作应用于饲料、食品、医药等工业。根据本发明的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产性质优良适合工业应用的甘露聚糖酶。

附图说明

图1man113A在毕赤酵母中表达的β-甘露聚糖酶的SDS-PAGE分析，l，分子量标准；2，纯化的重组β-甘露聚糖酶。

图2本发明重组β-甘露聚糖酶man113A的最适pH值。

图3本发明重组β-甘露聚糖酶man113A的pH稳定性。

图4本发明重组β-甘露聚糖酶man113A的最适反应温度。

图5本发明重组β-甘露聚糖酶man113A的热稳定性。

具体实施方式

实验条件：

1、菌株及载体Alicyclobacillus hesperidum A4云南保山高温温泉出水处的土样，该菌最适生长温度在55-60℃之间，最适生长pH为3.03.5。大肠杆菌Escherichia coliBL21(DE3)、表达载体pET-30a(+)（购自Novagen公司）。

2、酶类及其他生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。PNPGal、植酸钠等底物购自Sigma公司，其它都为国产试剂。

3、脂环酸芽孢杆菌培养基为7#液体培养基（蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，微量元素(50X)20ml/L蒸馏水配制）。微量元素(50X)：氮川三醋酸5g/L，NaCl0.4g/L，KNO35.15.g/L，NaNO334.45g/L，Na2HPO45.5g/L，FeCl35g/L，CaSO43g/L，MgSO45g/L。大肠杆菌培养基为LB(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl,pH7.0)。

本发明中所用到重组遗传学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中未作详细介绍的技术，均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分来进行，包括：Sambrook等人,Molcular Cloning，A Laboratory Manual(第3版.2001)；和Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编,1994)。

实施例1脂环酸芽孢杆菌的筛选及分离

在一个100mL三角瓶中装7#液体培养基，调pH值为2.0，灭菌后待用。在无菌操作台将4℃冰箱中取出高温泉流淌物的土壤样品大约0.5g，装于上述三角瓶中，60℃静止培养24小时进行富集培养。

梯度稀释法分离：取1mL经过富集培养的菌液，加入装有9mL无菌生理盐水的试管，混匀后，即制成10^-1的菌悬液。然后按10的倍数关系进行逐步稀释到10^-7。取10^-5、10^-6梯度的土壤悬液各100μL，分别涂于7#固体培养基平板上，于60℃恒温箱培养。

2-3天后待长出菌落，根据菌落形态的差异(主要是通过观察菌落的颜色、湿润情况、大小、菌落表面的皱褶等)，随机挑取了26株菌。再次通过梯度稀释培养法(10^-5、10^-6稀释液)，60℃条件下培养，获得单一纯化的菌株。

实施例2脂环酸芽孢杆菌基因组的提取和16s DNA的鉴定

基因组DNA提取：取60℃培养2天的菌液10000rpm离心2min。取100mg菌体加500μL无菌水清洗，离心取沉淀。沉淀重悬于500μL提取液混合液，于37℃温育60min，10000rpm离心10min去沉淀。上清液用等体积酚、酚︰氯仿、氯仿依次抽提。取上层溶液加0.6-1倍体积的异丙醇常温沉淀10min。12000rpm离心15min。沉淀用70％乙醇清洗，稍离心，将沉淀烘干后用30μL无菌水溶解，备用。

16s DNA的鉴定：选用16SrDNA通用引物27F，（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和1492R，（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3），以分离菌株的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应条件为：预变性95℃3min，变性95℃1min，退火55℃1min，延长72℃2min，30个循环，再延长72℃10min。PCR产物回收，直接送测序公司测序。经BLAST分析，与已报道的多数Alicyclobacillus属菌株的16S rDNA有99.9%的相似性，初步确定分离的菌为脂环酸芽孢杆菌，并命名为Alicyclobacillus hesperidum A4。

实施例3脂环酸芽孢杆菌β-甘露聚糖酶编码基因man113A的克隆

根据第113家族的β-甘露聚糖酶基因保守序列设计合成了兼并引物，以提取的脂环酸芽孢杆菌的基因组为模板进行兼并性PCR扩增。PCR反应参数为：95℃5min;94℃30sec,50~45℃30sec,72℃30sec,12个循环(其中每个循环后复性温度下降1℃);94℃30min,45℃30sec,72℃30sec,30个循环;；72℃10min。电泳检测分析扩增的产物，回收大小合适的片段，进行测序。测序结果分析表明：所获得的200bp左右的基因片段为β-甘露聚糖酶基因片段。

根据已知序列，采用TAIL-PCR方法分别设计上下游特异性引物，扩增得到基因的全部序列。最后经过正确的拼接，最终得到一个β-甘露聚糖酶基因，Man113A，该基因的开放阅读框以ATG为起始密码子，由933个碱基组成，编码310个氨基酸和一个终止密码子TAA。

实施例4β-甘露聚糖基因man113A的表达

根据已克隆的-甘露聚糖酶基因的编码序列设计表达引物：

man113A-F，5-GGGCATATGTCTTTTGCATATATCAAGG-3'，

man113A-R，5'-GGGCGGCCGCTCGAGATGCGTAAAACGACC-3'，并在引物

man113A-F的末端引入酶切位点Nde I，在引物man113A-R的末端引入NotI，以脂环酸芽孢杆菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增得到成熟蛋白编码序列。用Nde I和Not I酶切，连接到表达载体pET-30a中，获得含有β-甘露聚糖编码基因man113A的重组质粒pET-30a-man113A，并转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，获得重组菌株pET-30a-man113A/DE3。

取含有重组质粒的BL21（DE3）菌株和含有pET-30a空质粒的BL21（DE3）菌株（作对照），分别接种于3mLLB（加有100μg/mL的氨苄青霉素）培养液中，10-37℃不同条件下快速振荡培养过夜；按照1/100体积接种过夜培养液于含有100μg/mL氨苄青霉素的20mL LB培养液中（100mL三角瓶），快速振荡培养约2h（OD600达到0.6），加入1/1000体积1mol/L的诱导剂IPTG，振荡培养24h，使其表达目的蛋白。取培养液，10,000rpm离心5min，收集沉淀，加入适量的柠檬酸缓冲液，利用超声波破碎细胞。离心取上清测定甘露聚糖酶的活性。

实施例5重组β-甘露聚糖酶的纯化

根据NEB的装柱说明书将1mL的NTA柱质加到空柱子中，并准备如下pH7.6，不同咪唑浓度0、20、40、60、80、100和200mmol/L的缓冲液。具体操作流程：离心收集诱导后的菌体，加入用5mL0mmol/L的咪唑缓冲液重悬，超声波破碎条件为冰浴中破碎，破碎3sec停止4sec每组80次。将诱导后的细胞破碎液于4℃、12,000rpm离心10min，获得上清（粗酶液）；镍柱平衡处理，柱子先用10-20mL水平衡，再用15-20mL0mmol/L的咪唑缓冲液平衡，加样品5mL粗酶液并开始收集穿透峰；然后依次加入20、40、60、80、100和200mmol/L的各种咪唑缓冲液5mL洗脱并收集洗脱液；然后对收集管中的溶液测定甘露聚糖酶的酶活，并进行蛋白电泳分析。

实施例6重组β-甘露聚糖酶部分性质分析

采用DNS法对本发明的甘露聚糖酶进行活性分析。具体方法如下：在pH6.0，37℃条件下，1mL的反应体系包括l00μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应l0rnin，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5mn。冷却后540nm测定OD值。甘露聚糖酶活性单位定义：在一定条件下，每分钟分解甘露聚糖生成lμmol还原糖所需的酶量为1个活性单位(U)。

（1）甘露聚糖酶MAN113A的最适pH及pH稳定性

经纯化的甘露聚糖酶MAN113A在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH0.5～2.2KCI-HCl缓冲液，pH2.2～8.0的柠檬酸一磷酸氢二钠系列缓冲液及pH8.0～l0.0Tris-HCl系列缓冲液。纯化的甘露聚糖酶MAN113A在不同pH的缓冲体系．37℃下测定的pH适性结果（图2）表明：MAN113A的最适pH为6.0，在pH5.0-7.5范围内，酶活能维持70%以上；在pH8.0时，人能保持40%的酶活性。

将酶液在不同pH值的缓冲液中于37℃下处理60min，再测定酶活性以研究酶的pH稳定性。结果表明（图3），在pH5.0～10.0之间该酶保持了非常好的稳定性，酶活能维持在90%以上，这说明此酶具有较好的耐酸耐碱性。

（2）甘露聚糖酶MAN113A反应最适温度及热稳定性。

最适温度的测定在pH6.0缓冲体系及不同温度下进行酶促反应。酶反应最适温度测定结果（图4）表明，其最适温度为55℃。耐温性测定为甘露聚糖酶在不同温度下处理不同时间，再在37℃下进行酶活性测定。酶的热稳定性试验表明（图5），MAN113A在50℃下保温60min，酶活性基本不损失；60℃下保温10min．剩余酶活性为35%。这表明MAN113A具有较好的热稳定性。

（3）甘露聚糖酶MAN5A的抗胰蛋白酶和胃蛋白酶能力。

用pH2.0KCl-HCl缓冲液配制0.1mg/mL胃蛋白酶，pH7.0Tris-HCI缓冲液配制0.1mg/mL胰蛋白酶。取pH2.0KCl-HCl缓冲液稀释后的0.5mL纯化的酶液加入0.5mL胃蛋白酶．pH7.0Tris-HCI缓冲液稀释后的0.5mL纯化的酶液加入0.5mL胰蛋白酶混合，蛋白酶／甘露骤糖酶(w/w)≈0.1，37℃保温，60min取样，在pH6.0及37℃条件下测定酶活性。实验结果表明β-甘露聚糖酶MAN113A用胃蛋白酶处理60min后，酶活完全损失。在用胰蛋白酶处理后酶活仍能保持为原来的83.5%；说明β-甘露聚糖酶MAN113A具有非常好的抗胰蛋白酶水解的能力。

（4）底物特异性分析

吸取纯化好的相同酶量β-甘露聚糖酶MAN113A，分别用0.3%魔芋粉，0.3%角豆胶、0.3%瓜儿豆胶、0.3%可溶性淀粉和0.3%的羟甲基纤维素钠作底物，按DNS法测定β-甘露聚糖酶MAN113A对不同底物的水解活性。其中酶活性最高的为魔芋粉，并以其作为参考，活性定为100%。角豆胶、瓜儿豆胶、可溶性淀粉和羟甲基纤维素钠的相对酶活性分别为62%、14.7%、0.5%和0.2%。因此可以确定β-甘露聚糖酶MAN113A最适底物为魔芋粉，对角豆胶和瓜儿豆胶也就较好的水解能力。