川明参组培快繁技术

摘要

本发明提供了一种川明参的组织培养方法，以性状优良的川明参植株旺盛生长期的茎尖、幼嫩叶片以及新鲜幼嫩叶柄为外植体，经消毒处理、接种诱导形成愈伤组织，再经愈伤组织增殖、诱芽培养和生根培养，长成完整的川明参植株小苗，最后将完整小苗移栽至育苗基质中，培养成川明参种苗。所用培养基均以MS培养基为基础，辅以6-苄基腺嘌呤、萘乙酸、2,4-二氯苯氧乙酸、吲哚丁酸、蔗糖和琼脂等成分。本发明利用植物组织培养技术，实现川明参的组织快繁，在川明参的产业化栽培的种苗供应和良种快速扩繁方面具有重要的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，主要是川明参的组织培养方法。

背景技术

川明参（Chuanminshen violaceum Sheh et Shan）是伞形科(Umbelliferae)川明参属植物，多年生草本，是我国特有单种属植物，为四川道地药材。沿四川中部、东部（金堂、简阳、巴中、阆中、南部）到湖北西部（宜昌、当阳）一狭长地带分布，以四川金堂、苍溪、阆中、巴中等最为集中。《中药志》(1959)、《四川中药志》等曾将川明参和明党参作为同一种植物收载，佘孟兰等对两种植物进行形态比较研究后认为，二者非同一种植物，因而建立川明参属，并认为二属应隶属于不同的族。陆胤等采用气相色谱-质谱法对稀有濒危单型属药用植物明党参、川明参及珊瑚菜根部挥发油的化学成分进行了聚类分析，定量阐明了这3 种植物所代表的三属间亲缘关系，认为川明参与珊瑚菜的亲缘关系较接近，而与明党参的亲缘关系较远。

川明参以干燥根入药，味甘、微苦、平，归肺、脾经，有润肺化痰，和中养胃等功效，主治肺热燥咳、阴虚劳嗽、干咳痰粘、气阴不足、烦热口干等症。川明参食用历史悠久，川明参作为食用味道鲜美，具有质嫩、粉足、汤鲜等优良特点，同时具有养生保健功能。由于川明参不仅药用价值高，而且在食用方面具有良好的开发价值和保健功能，市场潜力巨大，因为川明参作为药食两用产品的常年需求量较大，市场价格逐年高涨。

现阶段川明参多为人工栽培，栽培种源来自于野生植株驯化所产生的种子，种源来源繁杂，品质参差不齐。川明参种子野生性强，发芽率低而且发芽时间参差不齐，种子的保存时间短，出苗率不足30%，种子育苗用种量达到10kg~30kg/亩。发芽率低导致种苗不足和栽培成本高，种苗质量也难以保证，制约了川明参的规模化种植的发展和单位面积产值的提高。目前尚未有川明参组织培养和离体快繁技术。

因此，利用植物组织培养技术，实现川明参的组织快繁，在川明参的产业化方面具有重要的应用价值：（1）实现川明参种苗的工厂化标准生产，繁殖速度快，一年四季均可繁殖生产种苗，不受地域和气候影响；（2）快速良种选育与扩繁，对于优良植株进行快速扩繁，并在此基础上实现良种的快速选育，为规模化人工栽培提供优良种苗；（3）为川明参种质资源保存提供低成本技术手段。

发明内容

一种川明参组织培养方法，通过选取性状优良的川明参植株旺盛生长期的茎尖、幼嫩叶片以及新鲜幼嫩叶柄为外植体，经消毒处理、接种诱导形成愈伤组织，再经愈伤组织增殖、诱芽培养和生根培养，长成完整的川明参植株小苗，最后将完整小苗移栽至育苗基质中，培养成川明参种苗。

所述的川明参组织培养方法，其步骤如下：

1、外植体的选取与灭菌：选取川明参旺盛生长期的茎尖、幼嫩叶片以及新鲜幼嫩叶柄为外植体，以流水冲洗20~30min，再以75%酒精浸泡30s，以无菌去离子水冲洗3~5次，再将冲洗后的外植体置于0.1%~0.2%的升汞溶液中，浸泡灭菌10~15 min，以无菌去离子水冲洗2~3次，以无菌滤纸吸干表面水分，备用。

2、外植体接种：将步骤1中备用的外植体切成0.5cm~1cm的小块，接种于愈伤组织诱导培养基中，在恒温25±2℃，光照（2000lx）14h/d条件下进行培养，培养时间为20天~25天，在茎尖切口、幼嫩叶片切口周围、叶柄切口以及中间膨大处长出愈伤组织。

3、愈伤组织增值：将步骤2中得到的愈伤组织接种于愈伤组织增值培养基中，在恒温25±2℃，光照（2000lx）14h/d条件下进行培养，培养时间为15天~20天，长出淡黄色或乳白色致密愈伤组织。

4、丛生芽诱导：将步骤3中得到的愈伤组织切取为黄豆大小块状，接种于丛生芽诱导培养基中，在恒温25±2℃，光照（2000lx）14h/d条件下进行培养，培养时间为20天~30天，出现川明参丛生芽。

5、生根培养：将步骤4中得到的川明参丛生苗分株，转接至生根培养基中，在恒温25±2℃，光照（2000lx）14h/d条件下进行培养，培养时间为20天~25天，小苗基部长出灰白短根，继续培养长出完整根系。

6、植株移栽：移栽前，对含泥炭土、珍珠岩的育苗基质进行消毒，将步骤5中得到的带根完整小苗移栽至育苗基质中，于温室中雾化保湿条件下培养，直至小苗存活，长成正常川明参植株。

所述的川明参植株，为一年生或者2年生的处于生长期（11月~次年2月）的伞形科川明参属植物川明参（Chuanminshen violaceum）。

所述的致密愈伤组织，为非颗粒状分散在培养基中的愈伤组织块。

所述的愈伤组织诱导培养基，为1/2MS+6-BA1.0~3.0mg/L+2,4-D10.0~20.0mg/L +NAA1.0~5.0mg/L。

所述的愈伤组织增值培养基，为MS+2,4-D10.0~20.0mg/L+NAA1.0~5.0mg/L。

所述的丛生芽诱导培养基，为MS+6-BA5.0~10.0mg/L+NAA1.0~5.0mg/L。

所述的生根培养基，为1/2MS+IBA1.0~10.0mg/L+NAA1.0~2.0mg/L。

所述的MS为常规基本培养基Murashige&Skoog1962，将常规基本培养基MS中大量元素浓度减半得到1/2MS，6-BA为6-苄基腺嘌呤，NAA为萘乙酸，2,4-D为2,4-二氯苯氧乙酸，IBA为吲哚丁酸。

所述的愈伤组织诱导培养基、愈伤组织增殖培养基、丛生芽诱导培养基和生根培养基均加入8g/L的琼脂、30g/L的蔗糖。

所述完整小苗，为川明参丛生芽完成根、茎分化，并已长出4~5片小叶，可以独立进行光合作用自养生长的幼小植株。

所述育苗基质，为泥炭土、珍珠岩混合物，总孔隙度75%以上，有机质15%以上。

 

本发明首次采用组织培养方法，对川明参进行组织培养快速繁育，所用培养基诱发时间短，出苗快，增殖率高，易于操作，为川明参工厂化育苗提供了一条新途径。本发明的优点在于：（1）实现川明参种苗的工厂化标准生产，繁殖速度快，一年四季均可工厂化繁殖生产种苗，不受地域和气候影响；（2）是快速良种选育的技术手段，对于优良植株进行快速扩繁，发现一个形状优良植株即可经过组培快繁大面积推广栽培，同时完全保存优良特性，为规模化人工栽培提供优良种苗；（3）低成本实现川明参优良种质资源保存。

 

具体实施方式

实施例1

1、外植体的选取与灭菌：选取川明参旺盛生长期的幼嫩叶片为外植体，以流水冲洗30min，在超净工作台上以75%酒精浸泡30s，以无菌去离子水冲洗3次，再将冲洗后的外植体置于0.1%的升汞溶液中，浸泡灭菌10分钟，以无菌去离子水冲洗3次，以无菌滤纸吸干表面水分，备用。

2、外植体接种：将步骤1中备用的外植体在超净工作台上切成0.5cm2大小，接种于愈伤组织诱导培养基（该培养基为：1/2MS+6-BA1.0mg/L+2,4-D10.0mg/L+NAA5.0mg/L，加入30g/L蔗糖、8g/L琼脂粉，pH=5.8）中，在恒温25±2℃，光照（2000lx）14h/d条件下进行培养，一周后，幼嫩叶片中间拱起，连续培养约25天后，在幼嫩叶片切口周围长出愈伤组织。

3、愈伤组织增值：将步骤2中得到的愈伤组织接种于愈伤组织增值培养基（该培养基为：MS+2,4-D10.0mg/L+NAA5.0mg/L，加入30g/L蔗糖、8g/L琼脂粉，pH=5.8）中，在恒温25±2℃，光照（2000lx）14h/d条件下进行培养，15天后，长出淡黄色或乳白色致密愈伤组织。

4、丛生芽诱导：将步骤3中得到的愈伤组织切取为黄豆大小块状，接种于丛生芽诱导培养基（MS+6-BA5.0mg/L+NAA1.0mg/L，加入30g/L蔗糖、8g/L琼脂粉，pH=5.8）中，在恒温25±2℃，光照（2000lx）14h/d条件下进行培养，约20天后，出现川明参丛生苗，约30天后出现成簇生状的川明参丛生苗。

5、生根培养：将步骤4中得到的川明参丛生苗分株，转接至生根培养基（1/2MS+IBA1.0mg/L+NAA1.0mg/L，加入30g/L蔗糖、8g/L琼脂粉，pH=5.8）中，在恒温25±2℃，光照（2000Lx）14h/d条件下进行培养，培养时间为25天，小苗基部长出灰白短根，继续培养长出完整根系。

6、植株移栽：移栽前，对含泥炭土、珍珠岩的育苗基质进行消毒，将步骤5中得到的带根完整小苗移栽至育苗基质中，于温室中雾化保湿条件下培养，直至小苗存活，长成正常川明参植株。

 

实施例2

1、外植体的选取与灭菌：选取川明参旺盛生长期的新鲜幼嫩叶柄为外植体，以流水冲洗20min，在超净工作台上以75%酒精浸泡30s，以无菌去离子水冲洗3次，再将冲洗后的外植体置于0.2%的升汞溶液中，浸泡灭菌10分钟，以无菌去离子水冲洗3次，以无菌滤纸吸干表面水分，备用。

2、外植体接种：将步骤1中备用的外植体在超净工作台上切成0.5~1cm的小块，接种于愈伤组织诱导培养基（该培养基为：1/2MS+6-BA3.0mg/L+2,4-D20.0mg/L+NAA1.0mg/L，加入30g/L蔗糖、8g/L琼脂粉，pH=5.8）中，在恒温25±2℃，光照（2000Lx）14h/d条件下进行培养，一周后，叶柄中间及切口处膨大，连续培养约20天后，在叶柄切口以及中间膨大处长出愈伤组织。

3、愈伤组织增值：将步骤2中得到的愈伤组织接种于愈伤组织增值培养基（该培养基为：MS+2,4-D20.0mg/L+NAA1.0mg/L，加入30g/L蔗糖、8g/L琼脂粉，pH=5.8）中，在恒温25±2℃，光照（2000Lx）14h/d条件下进行培养，约20天后，长出淡黄色或乳白色致密愈伤组织。

4、丛生芽诱导：将步骤3中得到的愈伤组织切取为黄豆大小块状，接种于丛生芽诱导培养基（MS+6-BA10.0mg/L+NAA5.0mg/L，加入30g/L蔗糖、8g/L琼脂粉，pH=5.8）中，在恒温25±2℃，光照（2000Lx）14h/d条件下进行培养，约25天后，出现川明参丛生苗，约35天后出现成簇川明参丛生苗。

5、生根培养：将步骤4中得到的川明参丛生苗分株，转接至生根培养基（1/2MS+IBA10.0mg/L+NAA2.0mg/L，加入30g/L蔗糖、8g/L琼脂粉，pH=5.8）中，在恒温25±2℃，光照（2000lx）14h/d条件下进行培养，培养时间为30天，小苗基部长出灰白短根，继续培养长出完整根系。

6、植株移栽：移栽前，对含泥炭土、珍珠岩的育苗基质进行消毒，将步骤5中得到的带根完整小苗移栽至育苗基质中，于温室中雾化保湿条件下培养，直至小苗存活，长成正常川明参植株。

 

实施例3

1、外植体的选取与灭菌：选取川明参旺盛生长期的茎尖为外植体，以流水冲洗20min，在超净工作台上以75%酒精浸泡20s，以无菌去离子水冲洗3次，再将冲洗后的外植体置于0.2%的升汞溶液中，浸泡灭菌10分钟，以无菌去离子水冲洗3次，以无菌滤纸吸干表面水分，备用。

2、外植体接种：将步骤1中备用的外植体在超净工作台上剥离附着的叶片，得到光滑茎尖，接种于愈伤组织诱导培养基（该培养基为：1/2MS+6-BA2.0mg/L+2,4-D10.0mg/L+NAA5.0mg/L，加入30g/L蔗糖、8g/L琼脂粉，pH=5.8）中，在恒温25±2℃，光照（2000Lx）14h/d条件下进行培养，一周后，幼嫩叶片中间拱起，叶柄中间及切口处膨大，连续培养约20天后，在茎尖切口处长出愈伤组织。

3、愈伤组织增值：将步骤2中得到的愈伤组织接种于愈伤组织增值培养基（该培养基为：MS+2,4-D10.0mg/L+NAA5.0mg/L，加入30g/L蔗糖、8g/L琼脂粉，pH=5.8）中，在恒温25±2℃，光照（2000lx）14h/d条件下进行培养，约20天后，长出乳白色致密愈伤组织；

4、丛生芽诱导：将步骤3中得到的愈伤组织切取为黄豆大小块状，接种于丛生芽诱导培养基（MS+6-BA10.0mg/L+NAA2.0mg/L，加入30g/L蔗糖、8g/L琼脂粉，pH=5.8）中，在恒温25±2℃，光照（2000lx）14h/d条件下进行培养，约25天后，出现川明参丛生苗，约35天后出现成簇川明参丛生苗。

5、生根培养：将步骤4中得到的川明参丛生苗分株，转接至生根培养基（1/2MS+IBA10.0mg/L+NAA1.0mg/L，加入30g/L蔗糖、8g/L琼脂粉，pH=5.8）中，在恒温25±2℃，光照（2000lx）14h/d条件下进行培养，培养时间为30天，小苗基部长出灰白短根，继续培养长出完整根系。

6、植株移栽：移栽前，对含泥炭土、珍珠岩的育苗基质进行消毒，将步骤5中得到的带根完整小苗移栽至育苗基质中，于温室中雾化保湿条件下培养，直至小苗存活，长成正常川明参植株。