快速检测微量百菌清的试纸条及其制备方法

摘要

本发明涉及一种快速检测微量百菌清的试纸条及其制备方法。该试纸条底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中纤维素膜层上有用偶联百菌清的载体蛋白溶液印制的检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG（或羊抗兔IgG）抗体溶液印制的对照印迹。金标抗体为胶体金标记的百菌清单克隆抗体或多克隆抗体。偶联百菌清的载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。本发明的试纸条特异性强，灵敏度高，简便，直观，准确，检测成本低，适用范围广，易于推广应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测微量抗菌类药物的器具，特别是涉及一种快速检测微量百菌清的试纸条及其制备方法。

背景技术

百菌清（chlorothalonil，CTN），化学名称为2,4,5,6-四氯-1,3-苯二腈，分子式为C₈N₂Cl₄，分子量为265.91，是一种高效的非内吸性广谱有机氯杀菌剂，对多种作物的真菌病害有良好的预防作用，被广泛应用于蔬菜、果树、豆类、水稻、小麦、森林等多种作物的病害防治，工业上用作防霉涂料添加剂。因为百菌清对植物体具有良好的黏着性，导致百菌清及其代谢产物在果蔬、土壤及水中均有较大残留，直接对生态环境和人类健康造成严重危害。同时百菌清对鱼类和两栖动物也有较大的毒性，能使水生生物、两栖生物发生遗传性突变。百菌清在自然界中的主要代谢物质之一3-羟基-2,4,5-三氯间苯二腈（TPN-OH），其毒性是母体毒性的30倍，其移动性和持久性也远大于母体，它的毒性正引起人们的重视。我国2010年新颁布的《食品中百菌清等12种农药最大残留限量》中规定，番茄和黄瓜中百菌清的最大残留限量为5mg/kg，据报道，35种在蔬菜上常检出超标的农药中，百菌清的检出超标次数列第8位。因此急需建立一种快速、灵敏、有效的百菌清残留检测方法。

目前国内外检测百菌清残留的方法主要采用：理化分析方法，包括高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱/质谱联用分析法（LC/MS）、气相色谱/质谱联用分析法（GC/MS）等，这些方法检测百菌清需经一系列复杂的处理净化过程，繁琐费时，从样品预处理到得出检测结果至少需要2天时间，同时需要大型专门的仪器设备和专业技术人员操作，无法现场检测，时效性较差。免疫学检测法具有半定量和一定的定量能力，可以提供待测物的初步信息，该法灵敏度较高，分析过程相对简单，用作百菌清的筛查有独特优势，是需要优先发展的检测技术，但目前百菌清免疫学快速检测方法在国内外尚属空白，急待研究解决。

发明内容

本发明要解决的技术问题：提供一种特异性强、灵敏度高、快速、简便的快速检测微量百菌清的试纸条及其制备方法。

本发明的技术方案：

一种快速检测微量百菌清的试纸条，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上设有偶联百菌清的载体蛋白印制的检测印迹，还设有用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG抗体印制的对照印迹，所述金标抗体纤维层中的金标抗体为胶体金标记的抗百菌清单克隆抗体或多克隆抗体。

所述吸附纤维层用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；吸水材料层用吸水滤纸制成，支撑层用不吸水的韧性材料制成；金标抗体纤维层用吸附百菌清的金标抗体玻璃纤维棉制成。

所述纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成。

所述                                                偶联百菌清的载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。

偶联时所用的百菌清载体蛋白偶联物是由如下方法制备的：

将百菌清10mg和氟化钾3mg溶入400～800μl乙二醇溶液中，加热至90～100℃，搅拌反应24～30h；反应结束后将反应液冷却至室温，加入到5g冰水中；将产生的沉淀分离并风干，得到百菌清衍生物；用400～800μL N,N-二甲基甲酰胺溶解百菌清衍生物，加入4mg N,N-羰基二咪唑，搅拌反应3h，然后加入含8～15mg 载体蛋白的PBS溶液中，搅拌反应过夜；用PBS透析3天，然后离心，弃沉淀，即得到百菌清载体蛋白偶联物，分装后保存于-20℃，备用。

所述检测印迹和对照印迹为平行排列的“︱︱”直线式印迹，或为“十十”字型排列印迹，或为“┬ ┬”字型排列印迹，或为“┴ ┴”字型排列印迹，或为“├├”字型排列印迹，或为“┤┤”字型排列印迹。在吸附纤维层、金标抗体纤维层和吸水材料层上覆盖有保护膜，在吸附纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上偏向吸附纤维层一侧0.3～0.7cm处印制有样品标记线。

所述快速检测微量百菌清试纸条的制备方法包括以下步骤：

（1）百菌清载体蛋白偶联物的制备

采用羰基二咪唑法，将百菌清与载体蛋白进行偶联，制备人工结合抗原，其具体步骤为：将百菌清10mg和氟化钾3mg溶入400μl乙二醇溶液中，加热至90～100℃，搅拌反应24～30h；反应结束后将反应液冷却至室温，加入到5g冰水中，将产生的沉淀分离并风干，得到白色固体百菌清衍生物；用400μL N,N-二甲基甲酰胺溶解百菌清衍生物，加入4mg N,N-羰基二咪唑，搅拌反应3h，然后加入含8～15mg 载体蛋白的PBS溶液中，搅拌反应过夜；用PBS透析3天，然后离心，弃沉淀，即得到百菌清载体蛋白偶联物，分装后保存于-20℃，备用；

（2）抗百菌清单克隆抗体或多克隆抗体的制备

用所得的百菌清载体蛋白偶联物制备抗百菌清的单克隆抗体或多克隆抗体；

（3）百菌清金标抗体的制备

（4）羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG抗体的制备

用所得的百菌清载体蛋白偶联物在纤维素膜层上印制检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG抗体在纤维素膜层上印制对照印迹；百菌清金标抗体用于制备金标抗体纤维层，然后依次按支撑层、吸附层和保护层组装成试纸条。

所述偶联百菌清的载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白；载体蛋白中半抗原和载体蛋白的摩尔比为200～300:1；所述PBS溶液的浓度为0.01mol/L、pH值为7～8。

所述百菌清金标抗体是由以下方法制备的：在沸腾的200ML、0.01～0.02％氯金酸溶液中加入新配制的1～2％柠檬酸钠8mL，反应后获得直径15～20nm的胶体金溶液，用0.1mol/L 的K₂CO₃调节pH值至8.5～9.5，置于2～8℃保存；以1：2000的标记比将待标记的百菌清单克隆抗体或多克隆抗体加入所得的胶体金溶液中，标记10min后加入20％的PEG10000，至PEG10000的终浓度为0.05％；4℃、1500～3000rpm离心20min，除去未结合的胶体金颗粒，4℃、15000rpm离心1h，弃上清，获得初步纯化的金标抗体蛋白混合物，再用丙烯葡聚糖S-400柱层析进行分离纯化，获得百菌清胶体金标记抗体。

本发明的试纸条具有以下优点：

 特异性强，灵敏度高。本发明试纸条以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标记对单克隆抗体的特异性及亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，检测试纸条具有较强的特异性和较高的灵敏度，可检测到纳克级的微量百菌清。本发明在保障食品安全、保护消费者健康方面具有极其重要的意义。

 简便、快速。使用本发明的试纸条，无需其它任何试剂和仪器，可现场操作。只需将试纸条插入被检样品中10～20秒，取出后5分钟内即可判定检测结果。

 结果显示形象、直观、准确。试纸条以显示棕红色“︱”（或“十”、“┬”、“┴”、“├”、“┤”）印迹作为检测结果阳性和阴性标记，即在纤维素膜上显示一条棕红色“︱”印迹，表示被检样品中含有百菌清，显示两条棕红色“︱︱”印迹，表示被检样品中不含百菌清。结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阳性和假阴性等人为误判。

 节省费用。使用该检测试纸条，无需另配仪器设备和其它试剂，可随时随地进行检测，费用低廉，能节省大量贵重仪器和设备费用。使用该检测试纸条，每份样品仅需人民币3～5元，比用通常的仪器分析（每份样品300元左右）和进口ELISA试剂盒（每份样品30元左右）的费用大幅下降。

 适用范围广，便于推广应用。本发明的检测试纸条操作简便，能满足不同层次人员的需要，包括专业化验、海关检疫、卫生检疫、质量监测、畜产品加工、养殖户以及消费者个人等，具有广阔的市场前景和明显的经济效益以及社会效益。

附图说明

图1为百菌清试纸条的结构示意图；

图2为百菌清试纸条的俯视结构示意图。

具体实施方式

要制成快速检测微量百菌清试纸条，首先制备偶联百菌清载体蛋白和百菌清金标抗体，从而制备隐形检测印迹和金标抗体纤维层；其次制备羊抗或兔抗小鼠IgG（或羊抗兔IgG）抗体，用于制备隐形对照印迹。

（1）百菌清载体蛋白偶联物抗原的制备

采用羰基二咪唑法，将百菌清与载体蛋白进行偶联，制备人工结合抗原。

称取百菌清10mg和氟化钾3mg溶入400μl乙二醇溶液中（加入氟化钾能使乙二醇更易与百菌清反应，取代百菌清分子上的6位氯原子，得到半抗原羟基百菌清（CTN-OH）），加热至90～100℃，磁力搅拌反应24～30h；反应结束后将反应液冷却至室温，加入到5g冰水中，将产生的沉淀分离并风干，得白色固体即百菌清衍生物CTN-OH（羟基百菌清）；用400μL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解百菌清衍生物，并加入4mg N,N-羰基二咪唑（CDI），磁力搅拌反应3h，然后加入含10mg 载体蛋白BSA（半抗原和载体蛋白分子的摩尔比为200～300:1，载体蛋白可用相同摩尔数的OVA或KLH替代）的PBS溶液（PBS溶液浓度为0.01mol/L，pH=7.4左右），搅拌反应过夜；用PBS透析3天，然后离心，弃沉淀，得到百菌清的载体蛋白偶联物，分装并保存于-20℃，备用。

（2）抗百菌清单克隆抗体或多克隆抗体的制备

单抗制备：用制备的百菌清载体蛋白偶联物以20μg～50μg/只的用量免疫6～8周龄Balb/C小鼠3～4次，每次免疫间隔时间3～5周，确定抗体效价符合要求后进行超强免疫，并在融合之前检测其抑制价，之后3～4天将免疫小鼠眶下窦采血，分离阳性血清；脱颈致死，用75%的酒精浸泡小鼠5～10min消毒体表，无菌取其脾脏，将脾脏剪碎并研磨，经120目尼龙纱布过滤，1000rpm离心10min，收集脾细胞。将1×10⁸的脾细胞与NS0骨髓瘤细胞按10:1的比例混合，1000rpm离心10min弃上清，将细胞沉淀物于37℃水浴中缓缓加入0.7～1.0mL的50%PEG4000，1min内加完，前30秒加0.1～0.3mL，中间15秒加0.2～0.4mL，最后15秒加完；然后缓缓加入无血清1640培养基15mL，以终止PEG的作用，37℃水浴5～10 min，1000rpm离心10min弃上清，将细胞沉淀物重悬于HAT选择培养基中，并加入96孔细胞培养板中（8～10块），100μL～200μL/孔，置于37℃、5%的CO₂培养箱中培养。培养10～14天，用间接ELISA法进行阳性孔筛选，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行3～6次有限稀释克隆化（直到细胞克隆为单克隆，检测各个克隆孔效价、抑制价基本一致），而后扩大培养，建立杂交瘤细胞株。所制备的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体可特异地与百菌清反应，亲和力常数达到10¹⁰～10¹²，轻链亚型为κ或λ，重链亚型为IgG₁、IgG_2a、IgG_2b、IgG₃，针对百菌清特异抗原决定簇的单克隆抗体，用于制备金标抗体玻璃纤维棉。

多抗制备：用百菌清载体蛋白偶联物免疫新西兰白兔，免疫剂量为200μg～500μg/次，背部皮下分4～6点注射。首免，用无菌PBS溶解的百菌清载体蛋白偶联物与等量弗氏完全佐剂（FCA）混合，充分乳化；加强免疫，用无菌PBS溶解百菌清载体蛋白偶联物，与等量弗氏不完全佐剂（FIA）混合，充分乳化，首免后2～3周进行，连续免疫4～5次，每次间隔2～3周，最后一次免疫后10～15天，以ELISA法测其定效价达到10⁵以上时，采血并分离收集高免血清。以饱和硫酸铵盐析法提取IgG抗体，即取1份高免血清加2份PBS（pH7.2）混匀，加等体积饱和硫酸铵溶液混匀，置4℃冰箱12h，4℃、2500rpm离心15min，弃上清，再以适量PBS（pH7.2）溶解沉淀，加饱和硫酸铵溶液至终浓度33％，置4℃冰箱2h，4℃、2500rpm离心15min，弃上清，以适量PBS（pH7.2）溶解沉淀，置4℃冰箱内用PBS（pH7.2）透析48～72h，中间换液数次，4℃、12000rpm离心15min，收集上清，得纯化的抗百菌清多克隆抗体，-20℃冻存，用于制备金标抗体玻璃纤维棉。

（3）百菌清金标抗体和金标抗体玻璃纤维棉的制备

采用柠檬酸钠还原法制备胶体金溶液。在沸腾的200ML 0.01～0.02％氯金酸溶液中加入新鲜配制的1％柠檬酸钠8mL，获得直径约15nm的胶体金溶液，用0.1mol/L 的K₂CO₃调节pH值至8.5～9.5，置于2～8℃保存备用。以1：2000的标记比将待标记的百菌清单克隆抗体或多克隆抗体加入pH8.5～9.5的金溶胶中，标记10min后，加入20％的PEG10000至终浓度为0.05％，4℃、1500～3000rpm离心20min，除去未结合的胶体金颗粒，4℃、15000rpm离心1h，弃上清，获初步纯化的金标抗体蛋白混合物，再用丙烯葡聚糖S-400柱层析进行分离纯化，获得百菌清胶体金标记抗体。将1：100～1：500稀释的胶体金标记抗体吸附于精制玻璃纤维棉中，4℃低温真空干燥，制备百菌清金标抗体玻璃纤维棉。

（4）羊抗或兔抗小鼠IgG（或羊抗兔IgG）抗体的制备

以饱和硫酸铵提取百菌清阴性小鼠血清IgG（或阴性兔血清IgG），用于百菌清检测试纸条隐形对照印迹的制备。

取1份小鼠血清加2份PBS(pH=7.4)，混匀，加等体积饱和硫酸铵混匀，置4℃冰箱2h，4℃、1200r/min离心15min，弃上清；以适量PBS(pH=7.4)溶解沉淀，加饱和硫酸铵至终浓度33%，置4℃冰箱内用PBS（pH=7.4)过夜透析，换液2～3次，4℃、12000r/min离心15min，收集上清，以紫外分光光度计测定其蛋白浓度，以50μg～100 μg/kg体重（小鼠血清IgG）经皮下和肌肉注射免疫健康羊或家兔3～4次，末次免疫10天后，静脉采血，以ELISA测定其血清抗体效价在1：2000以上，心脏采血或颈动脉放血，收集其血清。

以饱和硫酸铵提取羊抗或兔抗小鼠IgG，方法与提取小鼠血清IgG相同，不重述。

（5）百菌清试纸条的检测反应原理

胶体金免疫层析试验的原理是采用柠檬酸三钠还原HAuCl₄聚合成金颗粒，由于金颗粒之间的静电作用和布朗运动，使其保持水溶胶状态，胶体金富含电子和强大的给电子能力。胶体金以非共价键与百菌清抗体结合形成金标抗体（Ab-Au），将金标抗吸附于玻璃纤维棉上，一端与固定有兽药小分子蛋白质偶联物（检测线）和二抗（质控线）的纤维素膜（NC）相连，另一端与样品垫相连。若检测样品中不含百菌清，金标抗体与百菌清蛋白质偶联物反应而被部分截获，金颗粒富积而出现明显直观的红色条带，未完全结合的金标抗体至质控线时同样会出现红色条带；若检测样品中含有百菌清，百菌清与百菌清蛋白质偶联物竞争性结合金标抗体，则检测线不出现或出现很弱的红色条带。

（6）本发明试纸条的敏感性检测

配制CTN标准溶液，使其终浓度分别为0、50、100、200、400、800、1600和3200μg /L共8个，按操作要求检测，每个浓度设6个重复，根据试验结果判断试纸条的敏感性和检测限。结果表明，试纸条的检测限为50ng/g，敏感性较强。

以下实施例进一步说明本发明试纸条的结构。

实施例一：快速检测微量百菌清的试纸条，参见图1、图2。图中支撑层1用塑胶薄片条制成，吸附纤维层2用玻璃纤维棉制成，纤维素膜层4采用硝酸纤维素膜，手柄端的吸水材料层5采用吸水滤纸制成，将吸附纤维层2、金标抗体纤维层3、纤维素膜层4、手柄端的吸水材料层5从右至左依次粘贴固定在塑胶薄片条1上，各层之间交界处纤维互相交叉渗透。纤维素膜层4上设有隐形检测印迹6和隐形对照印迹7，偶联百菌清载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA），隐形对照印迹7用兔抗小鼠IgG抗体印迹制成，两条印迹带平行排列成“︱︱”。

8-1为覆盖在吸附纤维层2和金标抗体纤维层3上面的样品端白色保护膜，8-2为覆盖在吸水材料层5上面手柄端的其它颜色保护膜（如黄色），9为样品标记线，即在吸附纤维层2与金标抗体纤维层3交界处对应的白色保护膜偏向吸附纤维层2一侧约0.5cm处印制标记线，在标记线右侧保护膜上印有箭头及max字样。

待测样品溶液的制备及检测步骤：

样品溶液的制备：检测黄瓜，将样品切成块，捣碎，然后进行离心，4000r/min离心5min，吸取上层汁液作为待测样品；

操作方法：将试纸条测试端插入待测样品中，插入深度不超过标记线，约10～20秒钟取出试纸条，水平放置，5分钟内观察并判定检测结果。

结果判定：(a)阳性 如果在纤维素膜层上显示一条棕红色印迹带“︱”，表示检测结果为阳性，说明待测样品含有百菌清；(b)阴性 如果在纤维素膜层上显示两条棕红色印迹带“︱︱”，检测结果为阴性，说明待测样品中不含百菌清；(c)失效 如果在纤维素膜层上没有棕红色带显示，则表明试纸条已失效。

实施例二：试纸条的结构和实施例一基本相同，不同之处在于：金标抗体纤维层3吸附有抗百菌清多克隆抗体，吸附纤维层2用尼龙膜制成，纤维素膜层4采用纯纤维素膜，隐形检测印迹和隐形对照印迹均为“十”，8-2为覆盖在吸水材料层5上面的手柄端兰色保护膜。      

待测样品为番茄，将样品切成块，捣碎，然后进行离心，4000r/min离心5min，吸取上层汁液作为待测样品；

结果判定：(a)阳性 如果在纤维素膜上显示有一条棕红色印迹带“十”，表示检测结果为阳性，说明在待测样品中含有百菌清；(b)阴性 如果在纤维素膜上显示有两条棕红色印迹带“十”，表示检测结果为阴性，说明在待测样品中不含百菌清；(c)失效 如果在纤维素膜上没有棕红色带显示，则表明试纸条已失效。

操作方法同实施例一，不重述。

实施例三：试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于：吸附纤维层2用聚偏二氟乙烯膜（PVDF）制成，偶联百菌清载体蛋白溶液为鸡卵清白蛋白(OVA)，隐形对照印迹7用兔抗小鼠IgG抗体溶液在纤维素膜上印迹制成，纤维素膜层4采用羧化纤维素膜，8-2为覆盖在吸水材料层5上面的手柄端绿色保护膜，隐形检测印迹和隐形对照印迹均为“┬”。

结果判定：（a）阳性 如果在纤维素膜上显示有一条棕红色印迹带“┬”，表示检测结果为阳性，说明在待测样品中含有百菌清；（b）阴性 如果在纤维素膜上显示有两条棕红色印迹带“┬”，表示检测结果为阴性，说明在待测样品中不含百菌清；（c）失效 如果在纤维素膜上没有棕红色带显示，则表明试纸条已失效。

检测样品和操作方法同实施例一，不重述。

实施例四：试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于：吸附纤维层2用聚酯膜制成，纤维素膜层4采用羧化纤维素膜，偶联百菌清载体蛋白溶液为血蓝蛋白（KLH）。隐形检测印迹和隐形对照印迹均为“┴”。

实施例五：试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于：隐形对照印迹7用羊抗兔IgG抗体溶液在纤维素膜上印迹制成，吸附纤维层2用尼龙膜制成。隐形检测印迹和隐形对照印迹均为“├”。

实施例六：和实施例一基本相同，不同之处在于：金标抗体纤维层3吸附有抗百菌清多克隆抗体，检测样品为番茄。隐形检测印迹和隐形对照印迹均为“┤”。

实施例七：和实施例一基本相同，不同之处在于：金标抗体纤维层3吸附有抗百菌清多克隆抗体，检测样品为黄瓜。

实施例八：和实施例一基本相同，不同之处在于：金标抗体纤维层3吸附有抗百菌清多克隆抗体，检测样品为番茄。

实施例九：和实施例一基本相同，不同之处在于：偶联百菌清载体蛋白溶液为血蓝蛋白（KLH），检测样品、结果判定和操作方法同实施例一，不重述。

实施例十：和实施例一基本相同，不同之处在于：偶联百菌清载体蛋白溶液为鸡卵清白蛋白，检测样品、结果判定和操作方法同实施例一，不重述。