在真核生物体中改变温度感知的方法和组合物

摘要

含有H2A.Z的核小体介导植物和其他真核生物中的感温应答，且对H2A.Z进行修饰会改变这种应答。

说明书

技术领域

含有H2A.Z的核小体能够介导真核生物中的感温应答（thermosensory  response），且对H2A.Z进行修饰会改变这类应答。

背景技术

固着生物体（如植物）不断地感知环境条件以调节它们的生长和发育。 温度随昼夜和季节变化，昼夜性温度变化对生物钟的调控十分重要（Michael  et al.,2008;Salome and McClung,2005），而季节性的温度变化能够提供繁殖 时期的信息(Heggie and Halliday,2005;Samach and Wigge,2005;Sung and  Amasino,2005)。温度极值（Extremes of temperature）是对植物的重要胁迫 （stress），并且是限制全球植物分布的一个主要因素(Mittler,2006)。植物对 温度微小变化的敏感性以在过去的100年里由于气候变化导致的花期的显著 变化(Fitter and Fitter,2002)和野生植物分布发生的显著变化(Kelly and  Goulden,2008;Lenoir et al.,2008;Willis et al.,2008)为重要标志。在未来100 年里，预计全球平均温度和温度极值的增长会比迄今为止的增长更加显著， 这意味着未来会对野生植物和农作物产生重大的损害。

如果植物想要存活到下一代，它们就必须不断地应答环境变化，同时维 持发育和生长过程。温度和光的信号必须正确地汇集为复合网络（complex  network）才能通过营养生长和生殖生长成功地完成发育。温度可被看作是一 种在发育过程中提供“诱导”信号和“维持”信号的环境因素。它能够促进 发育进程，如种子休眠解除（seed dormancy release）、发芽、春化和开花。 因此，需要能够控制植物是如何感知温度的。生物体特别是农作物植物对温 度的应答通常是有害的，并且这种应答的定向改变可以提高农作物的产量、 质量和可预见性（predictability）。例如，小麦和水稻的籽粒灌浆（grain-fill） 对高温是特别敏感的。在发育籽粒中防止热休克应答（heat shock response） 可以保护籽粒的组成和数量免受高温胁迫应答的干扰。高温胁迫应答已经被 选择用于进化和育种中以使胚胎最大限度地存活，但是这些应答对籽粒质量 是不利的。这已是小麦和水稻在炎热的夏季产量降低的主要因素，并且这些 问题将会随着未来气候变化而更加严重。

此外，当暴露在高温或低温下时，许多农作物会过早地开花或者结实（如 甜菜、生菜、洋葱、卷心菜和西兰花），这是农作物减产的主要因素。需要 特别地控制这些农作物对温度的开花应答。而且，降低温度敏感性能够使农 作物更均衡地发育，这很重要，因为它能够使农民可靠地计划收成并优化农 作物的产量和质量。此外，许多有害的真核微生物利用温度感知作为信号来 诱导致病，例如，荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)和白色念珠菌 (Candida albicans)（Nguyen and Sil,2008）。选择性干扰这些生物体的温度感 知能力能够提供防止致病的方法。

真核生物温度感知是一个尚未被完全理解的复杂过程。在植物中，涉及 温度感知的因素包括钙信号传导（calcium signalling），而且已知低温可以改 变膜流动性。

真核细胞核内的遗传信息组织在高度保守的结构聚合物即核染色质中， 所述核染色质支持和控制基因组的重要功能。核染色质的基本单元是核小 体，核小体包括缠绕在组蛋白八聚体周围的DNA。核心组蛋白H2A、H2B、 H3和H4具有高度结构化的参与核小体内的组蛋白-组蛋白相互作用的核心 区域，以及延伸到核小体核心外的非结构化的N-和C-端尾部，它们同其它 核小体和非组蛋白蛋白质相互作用。这些尾部会受到许多翻译后修饰，例如， 乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化。DNA组织成核染色质会抑制需要DNA 作为模板的所有过程，例如，复制、转录、重组和修复。可以通过许多机制 来操纵核染色质的结构和组成以促进这些事件。这些机制包括组蛋白的翻译 后修饰。这些修饰能够改变核小体内和核小体之间的DNA-组蛋白的相互作 用，并且由此影响更高级的核染色质结构。调节核染色质结构的另一个机制 可以通过多亚基ATP-依赖性核染色质重塑复合物（multisubunit  ATP-dependent chromatin remodelling complexes）来实现。

除了编码核心组蛋白H2A的基因之外，真核生物基因组还含有被称作 H2A变体的基因，该基因与核心H2A具有不同的蛋白质序列。组蛋白变体 对核染色质的结构和功能起着非常关键的作用，并且参与多种细胞活动，例 如转录的调节、DNA修复、染色体X失活和异染色质形成。H2A.Z变体从 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)到人类都高度保守。在植物体中也已经鉴 定有H2A.Z变体。

总之，能够控制植物中的温度调节应答对控制产量具有重要的意义，尤 其是在考虑到气候变化的条件下。

而且，也需要能够调节其它真核生物体（如酵母菌）的温度应答。

我们已研究出了旨在满足上述需要的方法和组合物。

发明内容

我们发现真核细胞中的温度应答由核小体中H2A.Z的存在介导，并且 我们在本文中公开了可以特定地改变温度感知从而优化植物、酵母菌、真菌 或其他真核生物体的应答的方法。我们发现了含有H2A.Z的核小体是调节 植物对温度和温度变化的应答的主要点（major node）。

我们证实了植物中温度应答基因的基因转录是通过含有H2A.Z的核小 体来调节的。我们发现核小体中H2A.Z的存在会随着温度的升高而减少， 并且这种影响不依赖于转录。若在核小体中不存在H2A.Z，则植物在发育和 转录上表现出组成型高温应答（constitutive warm temperature response）。因 此，本发明涉及在真核生物体中改变温度感知的方法和制备具有改变的温度 感知的真核生物体的方法。本发明还涉及在真核生物体中改变感温应答的方 法和制备具有改变的感温应答的真核生物体的方法。

第一方面，本发明涉及一种在真核生物体中改变温度感知的方法，所述 方法包括改变核小体中H2A.Z的存在或状态。

另一方面，本发明涉及一种在真核生物体中改变感温应答的方法，所述 方法包括降低所述生物体内H2A.Z水平或改变H2A.Z的翻译后修饰或它们 的组合。

第三方面，本发明涉及一种抑制真核生物体对环境温度升高的应答的方 法，所述方法包括增加核小体内H2A.Z的存在或阻止核小体中H2A.Z的释 放，改变H2A.Z的状态，如H2A.Z的翻译后修饰，或抑制H2A.Z从核小体 解体。

第四方面，本发明涉及一种引发真核生物体高温应答的方法，所述方法 包括抑制或减少核小体内H2A.Z的存在。

另一方面，本发明涉及一种引发低温应答的方法，所述方法包括抑制或 减少H2A.Z从核小体的释放。

又一方面，本发明涉及一种制备表现出组成型高温应答的真核生物体的 方法，所述方法包括抑制或减少核小体内H2A.Z的存在。

本发明还涉及一种制备表现出组成型低温应答的真核生物体的方法，所 述方法包括抑制或减少H2A.Z从核小体的释放。

从本文提供的完整公开内容和所附的权利要求书中将可以理解本发明 的其它目的和优势。

附图说明

图1.HSP70表达是环境温度感知途径的输出（output）。

(A)转录特征分析实验显示了对环境温度变化强烈的转录应答。

(B)升高的环境温度强烈诱导HSP70（用箭头标注的黑线）。相反地， HSP70家族基因的其它成员（灰色）需要热应激才能上调。

(C)与HSP70家族的其它成员（灰色）相比，HSP70（用箭头标注的黑 线）在各种恒定的生长温度下有统一的线性表达模式。因此，在较宽温度范 围内，HSP70是感温途径的良好输出。

(D)拟南芥中的HSP70::LUC模拟了内源性HSP70响应于温度的表达模 式。从12℃变到17℃、22℃和27℃下2小时的植物的LUC转录物分析和实 时荧光素酶成像显示了温度依赖性的LUC表达和荧光素酶活性。将LUC转 录水平标准化为UBQ10。

(E)在幼苗期通过正向遗传学筛选鉴定entr1，作为具有增强温度应答的 突变体，这种表型在整个生命周期中都存在（上图）。下图显示了成熟野生 型和entr1植物中的HSP70::LUC表达。

(F)转录特征分析显示了WT和entr1中ARP6基因的表达。在entr1中 不存在ARP6转录物。柱形图代表来自微阵列实验的标准化表达水平。

(G)entr1的互补：含有ARP6基因组片段的二元构建体包括天然启动子 和编码区(P_ARP6::ARP6)，能够完全补救HSP70::LUC与entr1的发育表型。

图2.arp6-10显示了高温生长植物（warm grown plant）的发育和结构表 型。

(A-D)在温度为22℃下，长日照（A,B）和短日照条件（C,D）下，arp6-10 比野生型开花显著提前。在温度为27℃的短日照条件下生长时(E,F)，arp6-10 显示出非常强烈的开花的热诱导。相比之下，野生型开花时间与温度为22 ℃时的arp6-10相似。（x轴显示了开花时期莲座丛叶（rosette leaves）的数 量，y轴显示了相应的植物数量）。(G.H)除了开花时间表型之外，arp6-10 表现出在高温条件下生长的野生型植物所表现的所有结构性应答。温度为17 ℃时的arp6-10幼苗显示了胚轴(G)和叶柄的伸长(H)，均与在较高温度下的 野生型表型相似。（在20天大的野生型和arp6-10幼苗的前四个真叶上分析 了叶柄伸长）。还参见图8。

图3.在arp6-10中温度转录组被全面误调节（mis-regulated）。

变换到27℃下2小时的野生型幼苗的基因在arp6-10背景中被组成型地 抑制或激活，所述基因为2倍上调(A)或下调(B)的基因。类似的，与温度为 12℃下（0小时）的野生型相比，arp6-10中的2倍上调(C)或下调(D)的基因 在变换到27℃下的野生型中下调或上调。中间值和平均值分别由实线和虚线 表示。第5%和第95%表示异常值（圆点）。

(E)与野生型对温度从12℃升高到27℃的应答相比，arp6-10于诱导全 基因组的转录变化。表达对数比（log ratios）的全基因组散点图分析。x轴： 在27℃下24小时后的野生型与在12℃下培养的幼苗的对比。y轴：12℃下 生长的arp6-10和12℃下的野生型的对比。arp6-10突变体占对环境温度升 高产生应答的转录组中的变化的近一半(R²=0.466)。

图4.H2A.Z占用率（occupancy）随环境温度的函数变化

(A)受天然启动子驱动而表达的HTA11:GFP是有功能的，而且可以补 充hta9 hta11双重突变体。在21℃下，hta9 hta11双重突变体与Col-0相比具 有伸长的胚轴。受天然启动子驱动而表达的HTA11:GFP三个独立株系中能 够完全补救该表型（左图）。HTA11:GFP也补充了hta9 hta11双重突变体中 提高的HSP70表达（右图）。

(B)使用HTA11:GFP分析HSP70启动子处H2A.Z的富集。17℃下生长 （空心圆点）或27℃下培养2小时后（实心圆点）的7天大幼苗中的甲醛交 联核染色质经MNase消化，并用于核染色质免疫纯化(ChIP)分析。使用嵌合 寡聚核苷酸（tiling oligonucleotides）定量分析与H2A.Z免疫复合物结合的 DNA片段（参见图4B）。与+1核小体相应的区域富集H2A.Z，而-1核小体 的H2A.Z占用率则低得多（插图柱状图，4A）。x轴：相对于TSS的HSP70 整个基因上的核苷酸位置。y轴：未经消化的输入（input）核染色质的分数 表示的H2A.Z占用率。所示出的数值是一个代表性实验中的平均值±SD。 插图中的柱状图详细的显示了-1核小体，如-246bp为中心的扩增子所示。

(C)在作上述相似处理的幼苗上交联H3的ChIP分析显示了准确定位于 HSP70启动子的核小体。在温度变化到27℃时，H3占用率在+1核小体处发 生改变，而此处H2A.Z占用率高。应答温度变化时，H3占用率的相对变化 比H2A.Z的低。

(D)用一种吉普赛型（gypsy like）转座子基因（At4g07700）作为对照， 因为它有确定位置的缺乏H2A.Z的核小体，而且它在转录中是不活跃的， 且对温度变化不敏感。ChIP分析显示在17℃和27℃下组蛋白H3占用率均 没有发生变化，这表明H2A.Z赋予核小体温度特异性应答。正如期望的那 样，通过ChIP测量不到H2A.Z占用率。还可以参见图9。

图5.H2A.Z占用率动态不依赖于转录应答。

(A-I)对具有多种不同转录应答的基因进行分析，以分析响应温度变化 的H2A.Z占用率。H2A.Z占用率主要是由温度决定的，而不依赖于特定的 转录应答。这个结果表明：含有H2A.Z的核小体将温度信息赋予核染色质， 这可以根据适当基因表达的各自调节性环境来解释。上图显示了温度转变至 27℃时的转录应答。0小时表示来自生长在12℃下的植物样品；2小时和24 小时是指温度转变到27℃后的植物样品。下图显示了温度转变至27℃之后2 小时的H2A.Z占用率动态。

图6.核染色质结构动态地响应环境温度变化。

(A)野生型中响应温度的HSP70处核染色质结构的动态。在17℃（空 心圆点）、22℃（实心圆点）和27℃（正方形）下生长的七天大的幼苗的染 色质用MNase处理，并用嵌合寡核苷酸进行Q-PCR分析。HSP70的+1核小 体对升高的环境温度表现出的应答，核小体占用率和温度负相关。

(B)如对MNase的可用性（accessibility）的测量，arp6在核染色质结 构方面表现出组成型温度应答。arp6中+1核小体占用率即使在17℃下也持 续较低。

(C)At4g07700处对温度应答的核小体占用率动态的分析结果与H3数据 相一致，显示该基因座处的核小体对环境温度变化不具有应答性。

在17℃下生长(D)或在27℃培养2小时后(E)的野生型（实心圆点）和 arp6(空心圆点)的HSP70处RNA POL II的ChIP分析。X轴表示HSP70上 的核苷酸相对于TSS的位置；y轴表示利用RNA Pol II抗体免疫纯化的输入 核染色质的分数。

(F)显示Hph I位点的HSP70+1和-1核小体示意图。灰色椭圆代表核 小体，箭头指示寡核苷酸的位置。(G-H)针对野生型(G)和arp6-10(H)的Hph I酶的温度依赖性核小体DNA可用性分析。含有H2A核小体（野生型的-1 核小体和arp6-10的-1和+1核小体）的核小体组成型地表现出限制性酶切位 点的可用性，然而，含有H2A.Z的核小体阻止这种接近。计算了受保护的 输入核小体DNA的相对量，并针对At4g07700的+1核小体进行标准化，所 述At4g07700的Hph I没有被切，也可参见图10。

图7.含有H2A.Z的核小体能够以温度依赖性方式调节转录。

在较低温度下，H2A.Z核小体有高水平的占用率。H2A.Z核小体可以阻 止转录，或者通过作为RNA Pol II进程的物理阻碍，或者通过阻止基因特异 性顺式元件激活转录因子。对于在低温下特异性表达的基因，H2A.Z占用可 以阻止阻抑蛋白的结合或拮抗DNA甲基化。当存在适当的组分和条件时， 核染色质重建复合物可以缓解核小体抑制。在较高温度下，H2A.Z核小体占 用率下降。这导致那些转录被H2A.Z占用所限制的基因（如HSP70）的表 达增加。对于较高温度下表达下降的基因，这种缺失可以促进阻抑蛋白的结 合。传统的H2A核小体以浅灰色椭圆表示且H2A.Z占用程度以深灰色表示。

图8.在arp6-10中温度诱导的结构表型是组成型的。

(A)定量测定了WT和arp6-10在各个温度下生长的15天大的幼苗的胚 轴伸长。(B-D)定量测定了在17℃(B)、22℃(C)和27℃(C)下生长的WT 和arp6-10的20天大的幼苗前四片叶片的叶柄伸长。

图9.HTA11:GFP融合蛋白被定位并作为内源性蛋白发挥作用。

共聚焦显微镜显示了细胞核内的HTA11:GFP的核内分布和从异染质区 的排出(A)，这与已报道的内源性蛋白的模式一致(Deal et al.,2007,Zilberman  et al.,2008)。(B)细胞分裂后期的细胞的可视化显示了HTA11:GFP整合到 染色体上。(C)arp6-10的核染色质经MNase消化后进行的核染色质免疫沉 淀分析显示，进入HSP70的+1核小体中的H2A.Z沉积显著减少。野生型 Col-0的H2A.Z占用率曲线用虚线表示，以作为参照。插图单独显示了 arp6-10的曲线。(D)17℃下生长的幼苗和温度变化至27℃下2小时的幼苗 的核染色质经MNase消化，并用于ChIP实验，所述实验使用针对H2A.Z 的抗体以显示温度应答性H2A.Z的动态。这些结果进一步证实了HTA11:GFP 蛋白融合和我们使用该融合蛋白的ChIP结果。(E)对于FT的TSS近侧区 （proximal region）的H2A.Z占用率的ChIP，开花热诱导的关键调节因子。 与我们发现的在该位点处的H2A.Z占用率的其它结果一致，该占用率是环 境温度的函数。

图10.在酵母菌中用温度调节子调节HTZ1

将htz1Δ背景中指定为上调和下调的基因的表达(y轴)(Meneghini et al., 2003)与温度从29℃变换到33℃的基因表达（x轴）(Gasch et al.,2000)进行 对比。发现它们有密切的相关性：htz1Δ背景中组成型下调的基因趋于是在升 高温度时表达受到抑制的那些基因，然而，那些在33℃下表达增高的基因趋 于在htz1Δ突变体中在30℃时被更高地表达。这些结果与含有Htz1的核小体 的作用一致，以为调节温度转录组提供热信息。较高温度下，温度诱导的核 染色质中Htz1的丢失可能对温度应答性基因的调节有作用(R² 0.30,P< 0.001)。

图11.编码拟南芥、水稻和玉米中H2A.Z的肽序列和序列比对。

图12.HAC miRNA株系的开花数据

靶向于拟南芥中HAC基因的合成微RNA的过表达导致开花延迟。显示 了两种代表性的稳定转基因株系#5和#2与野生型，在两个不同的时间点下， 一个是野生型开花的时间(A)，另一个是在数周之后(B)，用以显示开花延迟 的程度。柱状图(C)用开花时期的叶片数量显示开花数据。深色柱代表莲座 丛叶，且浅色柱代表茎生叶。

具体实施方式

现在将进一步描述本发明。在下面的内容中，将更加详细的定义本发明 的不同方面。在未作明确相反指示的情况下，所定义的每个方面可以与其它 任一或几个方面相结合。特别地，任何被指定为优选的或有利的特征可以与 其它任一或几个被指定为优选的或有利的特征相结合。

除非另有说明，本发明的实施可以使用植物学、微生物学、组织培养、 分子生物学、化学、生物化学和DNA重组技术中的常规技术，这是在本领 域技术人员的能力范围之内的。文献中充分解释了这些技术。

植物对温度高度敏感，并能够感知小到1℃的温度差异。人们基本上还 不了解植物在发育过程中如何感知温度以及温度与发育的关系。我们发现， 核小体中选择性组蛋白H2A.Z的存在或缺乏对植物如何感知温度和温度变 化是必不可少的。出人意料地是，我们发现，核小体中选择性组蛋白H2A.Z 的存在或缺乏是温度感知以及相应感温应答调节的重要核心点，包括大量温 度依赖性基因（温度转录组）表达的调节。因此，虽然人们认为温度感知和 引发温度依赖性应答是一个复杂的生物学过程，但是，本发明的发明人揭示 了该机制中的核心单一调节因子是H2A.Z。而且，本发明的发明人揭示了通 过改变核小体内H2A.Z的存在或缺乏，可能能够调节植物感知温度的方式， 从而改变温度依赖性的发育应答。因此，通过靶向于这个单一的调节因子， 可能改变各种温度依赖性应答，包括植物的发育应答，如开花、胚轴伸长 （hypocotyl elongation）和叶柄生长。

因此，本发明的方法涉及通过改变核小体中H2A.Z的存在来改变真核 生物体中（如植物）的温度感知，从而改变感温应答。

如本文所述，核小体中H2A.Z的存在对依赖于升高温度的基因的表达 是限速因素（rate-limiting）。因此，在野生型生物体内，低温时H2A.Z存在 于核小体中。H2A.Z响应于环境温度的升高并从核小体中释放出来。这种释 放会诱导在较高温度下表达的温度依赖性基因的表达，同时低温依赖性基因 不再表达。因此，H2A.Z起到了温度感知器的作用，并且这种调节因子的存 在或缺乏会决定基因的表达，所述基因的表达反过来调节通常由温度变化诱 导的发育应答。如实施例中所述，当H2A.Z沉积（deposition）受阻时，植 物即使在低温时也会表现出组成型高温应答，即植物通常在高温下所表现出 来的应答。

如本文所述，即使在低温下培养，核小体中整合了H2A.Z的基因型缺 陷也拟表型为高温生长植物。根据植物的具体温度临界值，本领域技术人员 可以知道不同植物之间对温度变化的应答不同。然而，一般而言，高温生长 植物是指植物在约20℃至约24℃的温度下生长，例如拟南芥(Arabidopsis) 在约22℃以上生长。低温生长植物是指植物在约15℃至约19℃的温度下生 长，例如拟南芥在约17℃以下生长。其它植物有不同的最佳温度条件。

核小体中整合了H2A.Z的基因型缺陷也表现出改变的基因表达，而且 基因表达特征通常由高温条件下生长的植物表现出来。因此，在体内，含有 H2A.Z的核小体对温度表现出的不依赖于转录的不同应答。使用纯化的核小 体，我们能够发现H2A.Z赋予核小体不同的DNA展开特性，这表明了通过 DNA-核小体变动来感知温度的直接机制。我们的结果显示含有H2A.Z的核 小体提供感温信息，所述信息用于协调发育应答和环境温度转录组。我们在 出芽生殖的酵母菌中观察到了相同的效果，这表明这是一种进化上保守的机 制。

第一方面，本发明涉及一种在真核生物体中改变温度感知的方法，所述 方法包括改变核小体中H2A.Z的存在。

另一方面，本发明涉及一种在真核生物体中改变感温应答的方法，所述 方法包括降低所述生物体内H2A.Z水平或改变H2A.Z的翻译后修饰或它们 的组合。

根据本发明的不同方法的真核生物体可以是植物、酵母菌、真菌、无脊 椎动物或脊椎动物。在一个实施方式中，所述生物体是植物。所述生物体也 可以是分离自植物体的一部分，例如，植物细胞，如植物细胞培养物或细胞 系。因此，在一个方面，本发明涉及一种改变植物、植物细胞培养物或细胞 系中温度感知的方法，所述方法包括改变核小体中H2A.Z的存在，本发明 还涉及一种改变植物中感温应答的方法，所述方法包括降低所述生物体内的 H2A.Z水平或改变H2A.Z的翻译后修饰或它们的组合。

当所述生物体是植物时，可以是单子叶或双子叶植物。

双子叶植物可以选自但不局限于以下科的植物，包括菊科(Asteraceae)、 十字花科(Brassicaceae)（如油菜(Brassica napus)）、藜科(Chenopodiaceae)、 葫芦科(Cucurbitaceae)、豆科(Leguminosae)（苏木科(Caesalpiniaceae)、云实 科(Aesalpiniaceae)、含羞草科(Mimosaceae)、蝶形花科(Papilionaceae)或豆科 (Fabaceae)）、锦葵科(Malvaceae)、蔷薇科(Rosaceae)或茄科(Solanaceae)。例 如，所述植物可以选自：生菜、向日葵、拟南芥、西兰花、菠菜、西瓜、南 瓜、卷心菜、番茄、马铃薯、薯蓣、辣椒、烟草、棉花、秋葵、苹果、玫瑰、 草莓、苜蓿、菜豆、大豆、蚕豆、豌豆、扁豆、花生、鹰嘴豆（chickpea）、 杏、梨、桃子、葡萄树（grape vine）或柑橘属的种。在一个实施方式中，所 述植物为油菜（oilseed rape）。

所述植物还包括生物燃料和生物能源农作物，例如，芸薹（rape）/油菜 （canola）、亚麻子（linseed）、羽扇豆和柳树、白杨、杂交白杨（poplar hybrids）， 芒草（Miscanthus）或裸子植物，例如火炬松（loblolly pine）。所述植物还包 括青储饲料的农作物（玉米）、牧草或草料（稻科植物类（grasses）、三叶草、 红豆草（sanfoin）、苜蓿）、纤维（如棉花、亚麻）、建筑原料（例如松树、 橡树），制浆植物（例如白杨）、用于化学工业的储存进料（feeder stocks）（例 如高芥酸油籽油菜（high erucic acid oil seed rape）、亚麻子）和用于舒适目的 的植物（例如高尔夫球场的草坪草）、公园和私家花园的装饰植物（例如金 鱼草、矮牵牛花、玫瑰、天竺葵、烟草属植物）和家庭用植物和切花（非洲 紫罗兰、秋海棠、菊花、天竺葵、锦紫苏吊兰（Coleus spider plants）、龙血 树属植物、橡胶植物）。

例如，单子叶植物可以选自下述科：棕榈科(Arecaceae)、石蒜科 (Amaryllidaceae)或禾本科(Poaceae)。例如，植物可以是谷类农作物，如小麦、 水稻、大麦、玉米、燕麦、高粱、黑麦、洋葱、韭菜、小米、薯蓣、荞麦、 草坪草、意大利黑麦草（Italian rye grass）、甘蔗或羊茅属植物。

优选地，所述植物是农作物植物。农作物植物可以是指供人类或动物消 耗或使用的以产业规模栽培的任意植物。

优选的植物有玉米、小麦、水稻、油菜、高粱、大豆、马铃薯、番茄、 葡萄、大麦、豌豆、菜豆、蚕豆、生菜、棉花、甘蔗、甜菜、西兰花或其它 芸苔属蔬菜（vegetable brassicas）或白杨。

然而，本发明还适用于其它真核生物体。因此，在其它实施方式中，所 述生物体是酵母菌或真菌。例如，在酿造工业、烘焙工业和发酵工业中涉及 的许多过程都非常依赖于培养的酵母菌株的温度应答。由于H2A.Z核小体 释放途径在各种真核生物中是极度高度保守的，这样，使用本文所述的方法 提供了靶向性地改变有重要商业价值的酵母菌对温度的应答的途径。

以下陈述了设计的改变温度感知的方法和改变感温应答的方法中的不 同方式。

根据本发明所述的方法，可以用许多方式来改变核小体内H2A.Z的存 在。这些方式包括改变、减少或抑制编码H2A.Z的基因的表达。可以使用 本领域技术人员已知的各种方法来实现上述目的，例如，使用RNA干扰 (siRNA)技术。或者，核小体内H2A.Z的存在可以通过改变H2A.Z的状态而 改变，例如改变H2A.Z的翻译后修饰状态。这包括翻译后修饰，例如，乙 酰化、泛素化和甲基化。核小体内H2A.Z的存在也可以通过改变组装入核 小体内的H2A.Z或核小体H2A.Z的释放进行改变。

因此，在本发明所述方法的一个实施方式中，本发明涉及通过减少所述 生物体内的H2A.Z肽或蛋白水平而改变核小体内H2A.Z的存在的方法，所 述方法包括减少或抑制一种或多种编码H2A.Z的核酸的表达。根据这个实 施方式，H2A.Z肽或蛋白的水平或量减少，例如以致于在所述生物体内基本 没有产生H2A.Z肽或蛋白。因此，没有或仅少量的H2A.Z能够整合到核小 体中。核小体中H2A.Z的水平减少或基本缺失会影响温度感知和温度变化 应答基因的转录控制，并由此影响温度依赖性发育过程。这导致即使在低温 条件下也能诱导组成型高温应答。

本领域技术人员所能理解的是，根据本发明所述的方法，本领域已知的 不同方法都可以用于减少或抑制一种或多种编码H2A.Z的核酸的表达。例 如，可以使用RNA干扰沉默所述核酸。这包括，例如本领域中已知的简单 反义RNA、发夹状RNA、天然或合成的微RNA的表达或其它RNA干扰方 法。具有H2A.Z编码核酸表达的减少或不表达的植物也可以通过基因组定 向诱导局部突变技术（Targeting-induced Local Lesions IN Genomes， TILLING）(Till et al.,2006)从诱变群（mutagenised population）中筛选得到。

H2A.Z在真核生物体内普遍地保守，而且已经在哺乳动物、鸟类、果蝇、 酵母菌、四膜虫（tetrahymenea）和植物中鉴定到了H2A.Z。

植物体内存在几种编码H2A.Z的核酸。例如，在拟南芥中，四个H2A.Z 基因为HTA8(At2g38810)、HTA9(At1g52740)、HTA4(At4g13570)和HTA11 (At3g54560)。

在不同植物中已经鉴定出了H2A.Z，而且在公共数据库上可以得到编码 H2A.Z的核酸序列。植物H2A.Z在不同分类群中都是高度保守的，所述分 类群包括藻类、玉米、苔藓、水稻和高粱。藻类、苔藓、水稻、高粱的H2A.Z 序列具有与拟南芥相同的保守的N-端可乙酰化的赖氨酸(K)。对比拟南芥、 水稻和玉米中编码H2A.Z的肽序列，其结果显示这些序列是高度保守的（参 见图11）。因此，根据本发明中所述的方法，本领域技术人员能够修饰任何 植物H2A.Z。

在本发明所述方法的另一实施方式中，改变H2A.Z的翻译后修饰以改 变核小体内H2A.Z的存在和/或改变生物体中的感温应答。这例如可以通过 下述的方法实现。

例如，可以改变H2A.Z乙酰化的程度。乙酰化可逆地修饰组蛋白，并 由此修饰核染色质结构。乙酰化的核染色质的折叠较不紧密，从而更容易地 接近相互作用的蛋白质。点特异性乙酰化会导致转录的激活，而去乙酰化则 抑制转录。过度乙酰化的组蛋白与DNA的接触松弛，从而使核小体核心颗 粒不牢固。

由于赖氨酸(K)和精氨酸(R)氨基酸残基上存在氨基，组蛋白尾部通常是 带正电荷的。这些正电荷可以促进组蛋白尾部与DNA主链上带负电的磷酸 基团相互作用和结合。通常发生在细胞内的赖氨酸(K)乙酰化能够通过将胺 转化成酰胺而中和组蛋白上的正电荷，并能够降低组蛋白结合DNA的能力。 这种降低的结合使核染色质膨胀，从而允许转录发生。

组蛋白的乙酰化是通过组蛋白乙酰转移酶(HAT)来调节的。HAT是通过 将乙酰基从乙酰基辅酶A转化成ε-N-乙酰基赖氨酸而乙酰化组蛋白上的保 守赖氨酸的酶。乙酰化可以通过组蛋白去乙酰化(HDAC)酶而逆转。HDAC 去除乙酰基，增加了组蛋白尾部的正电荷并促进了组蛋白和DNA主链之间 的高亲和力结合。增强的DNA结合使DNA结构变得紧密，从而阻止了转 录。乙酰化主要发生在组蛋白高度保守的N-端和赖氨酸(K)残基上。真核生 物体中的H2A.Z序列是高度保守的，而且包括多个乙酰化位点。拟南芥 H2A.Z蛋白在它们的N-端尾部至少含有4-5个潜在地可乙酰化的K残基， 这一特征在不同植物物种的不同H2A.Z序列中都是保守的。因此，根据本 发明所述的方法，可以靶向于植物H2A.Z蛋白N-端尾部保守的可乙酰化的 K残基。

根据本发明所述的方法，可以靶向于一个或多个H2A.Z乙酰化位点以 降低或提高乙酰化程度或以基本上防止H2A.Z的乙酰化，由此改变核小体 内H2A.Z的存在和/或改变生物体中的感温应答。

例如，可以使用编码H2A.Z的肽或蛋白的基因序列的定点诱变，将一 个或所有的K残基转换成不可乙酰化的残基(H2A.Z^N)。例如，不可乙酰化的 残基可以是精氨酸(R)或其它氨基酸残基。

可乙酰化的K残基的诱变能够减少或防止乙酰化。减少的乙酰化位点可 以防止HAT的接近、随后的乙酰化、核染色质转化为较不牢固的结构和在 升高温度的条件下转录的基因的转录。因此，减少乙酰化位点可以产生与 DNA具有高亲和力的H2A.Z^N，而且在较高温度时H2A.Z^N不会从核小体中 释放，从而防止通常在较高温度下转录的基因的转录，因此阻止了通常响应 于较高温度而发生的发育应答。

在另一个实施方式中，可以改变编码H2A.Z肽或蛋白的基因序列以引 入更多的乙酰化位点，从而产生过乙酰化的H2A.Z蛋白（hyper-acetylated  H2A.Z protein）。这促进了H2A.Z从核小体内的释放。H2A.Z从核小体中离 开会导致即使在较低温度时也能表现出组成型高温应答，因为这诱导了对较 高温度应答的基因的转录，而抑制了对低温应答的基因的转录。

使用本领域公知的表达载体可以在生物体中表达上述被改变的基因序 列。突变的序列可以是表达盒的一部分，所述表达盒包括驱动所述序列表达 的启动子。所述启动子可以是内源性启动子、组成型启动子或组织特异性启 动子。使用组织特异性启动子可能能够驱动转基因以组织特异性方式表达， 从而改变特定组织中的温度感知。在植物中，组织特异性启动子可以选自例 如已经被证实在小麦和大麦的胚乳转移细胞以及水稻的淀粉胚乳中具有特 异性活性的TaPR60启动子(Kovalchuk et al.,2009)、水稻中对胚乳转移细胞 具有特异性的OsPR602和OsPR9a启动子(Li et al.,2008)、对小麦灌浆过程 具有特异性的颗粒结合淀粉合成酶1(gbss1)启动子(Kluth et al.,2002)、油菜 中用于十字花科植物种子特异性表达的napA启动子、番茄的E4、E8或2a11 启动子或西瓜中用于果实特异性表达的AGPL1启动子和烟草的TA29启动子 或拟南芥中用于花药/膜状层（tapetum）特异性表达的A9启动子。

植物中可以通过使用强启动子而进行使用组成型启动子的过表达，所述 强启动子为例如花椰菜花叶病毒启动子(CaMV35S)、水稻肌动蛋白启动子、 玉米泛素启动子、水稻泛素rubi3启动子或任何引起增强表达的的启动子。 或者，可以通过使用转录或翻译增强子或激活子来获得增强或增加的表达， 而且可以将增强子整合到基因中以进一步增强表达。此外，可以使用可诱导 型表达系统，例如植物中的类固醇或乙醇诱导型表达系统。

在本发明所述方法的另一个实施方式中，根据本发明所述的方法， H2A.Z乙酰化或去乙酰化的酶靶向于改变核小体内H2A.Z的存在和/或改变 生物体中的感温应答。

在本发明所述方法的一个实施方式中，可以通过降低或者抑制HAT的 活性来降低或抑制H2A.Z肽或蛋白的乙酰化。例如，可以使用RNA干扰来 沉默一种或多种编码HAT酶的核酸序列。可以使用针对HAT家族保守区域 的构建体（construct）来降低HAT转录水平。并且，可以通过定点突变来改 变编码HAT酶的核酸序列以降低酶活性，从而降低或抑制HAT活性。具有 H2A.Z编码核酸表达的减少或几乎不表达和/或具有降低的酶活性或不具有 酶活性的突变HAT蛋白的植物可以通过TILLING从诱变群中筛选得到(Till  et al.,2006)。

这会减少H2A.Z乙酰化的量，从而阻止H2A.Z从核小体内释放。这会 导致表达需要H2A.Z从核小体内释放的基因表达减少，从而减少或抑制通 常由高温诱导的发育应答。

在另一个实施方式中，例如通过将一种或多种编码HAT的核酸引入所 述生物体内，或例如通过一种或多种编码HAT的核酸序列的诱变而改变HAT 活性，从而增加编码HAT酶的核酸序列的表达。通过内源性、组成型或组 织特异性启动子可以驱动所述核酸序列的表达。这会增加乙酰化的量，从而 增加H2A.Z从核小体内的释放。

在另一个实施方式中，可以通过降低或抑制HDAC活性来增加核小体 内H2A.Z肽或蛋白的乙酰化状态。降低或抑制HDAC活性可以防止或减少 乙酰基从H2A.Z中的去除。这会导致H2A.Z和DNA之间结合降低，从而减 少H2A.Z从核小体的释放，从而减少响应高温的基因的表达。

根据本发明这个方面的另一个实施方式，可以例如通过一种或多种编码 HAT的核酸的诱变来增强组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的表达水平或改变 HDAC的活性。由于乙酰基被去除，因此阻止了H2A.Z从核小体中的释放。 例如，可以在生物体内组成型表达一种或多种编码HDAC酶的基因。可以 使用组织特异性启动子。

可以通过核染色质重塑机制将H2A.Z组装到SWR1核小体中，已经证 明，在真核生物中这种复合物的组分是高度保守的。例如，在植物中，已经 证明拟南芥的ARP6负责将H2A.Z插入核小体中，并且是SWR-1复合物中 的一部分。突变体中ARP6的缺失会导致不能将H2A.Z整合到核染色质并导 致高温转录组的组成型表达。

一些植物ARP6同源物已经被鉴定，而且在在植物界是进化上高度保守 的。例如，对水稻、玉米、荠菜（capsella）和苔藓的ARP6同源物的各个核 酸序列的分析显示，这些序列与拟南芥的高度类似，这表明该序列在植物中 的保守性。因此，根据本发明所述的方法，本领域技术人员能够识别和修饰 ARP6同源物。

通过修饰核染色质重塑机制的组分（例如组蛋白分子伴侣），可以防止 H2A.Z插入或组装入核小体中。因此在本发明所述方法的一个实施方式中， 可以通过修饰核染色质重塑机制的组分来改变核小体内H2A.Z的存在。例 如，在一个实施方式中，可以例如通过RNA干扰来抑制编码参与H2A.Z插 入核小体的一种或多种蛋白的一个或多个基因的表达。这会导致核小体内 H2A.Z的缺乏，从而导致组成型高温应答。可以靶向的因子包括组蛋白分子 伴侣和SWR-1复合物的成员。例如，在植物中，可以靶向于ARP6或它的 同源物（homologue）或直系同源物（orthologue）。其它靶标可以包括促进 组装的组蛋白分子伴侣，例如NAP1、CHZ1或它的同源物或直系同源物。

在本发明所述方法的另一个实施方式中，可以靶向于核染色质重塑机制 的组分，例如组蛋白分子伴侣，以阻止H2A.Z从核小体内解体。例如，可 以沉默编码这些因子的基因。

如其它地方所述，核小体内H2A.Z的存在或缺乏会诱导感温应答，如 上所述，在一方面，本发明涉及一种在真核生物（如植物）中改变感温应答 的方法，所述方法包括降低所述生物体内的H2A.Z水平或改变H2A.Z的翻 译后修饰或它们的组合。

上文详细解释了降低所述生物体内的H2A.Z水平或改变H2A.Z的翻译 后修饰的方法并将本发明这个方面应用到不同的实施方式中。例如，如上文 所解释的，可以降低或抑制一种或多种编码H2A.Z的核酸的表达。例如， 使用RNA干扰沉默所述核酸。

在另一个实施方式中，如上文所解释的，可以改变翻译后修饰（如乙酰 化）。例如，可以使用编码H2A.Z肽或蛋白的基因序列的定位诱变将一个或 所有的K残基转换成不可乙酰化的残基(H2A.ZN)或引入更多的乙酰化位点。 而且，如上所述，可以降低、抑制或者增强一种或多种编码HDAC或HAT 的核酸序列的表达，以改变感温应答。

例如，可以通过表达编码H2A.Z蛋白的核酸序列产生突变的H2A.Z蛋 白，其中改变所述核酸序列以去除一个或多个乙酰化位点，例如，通过置换 或改变所述密码子内的核苷酸而改变编码所述核酸序列中的可乙酰化的K 残基的密码子，以产生具有不可乙酰化残基的蛋白质。在另一个实施方式中， 可以通过表达编码H2A.Z蛋白的核酸序列产生突变的H2A.Z蛋白，其中所 述核酸序列已经被改变而引入了一个或多个额外的乙酰化位点。如其它地方 所述，根据本发明的启动子可以是内源性、组成型或组织特异性启动子。

根据本发明所述方法的改变翻译后修饰也可以包括抑制或降低一种或 多种编码HDAC酶的核酸序列的表达，以减少或抑制H2A.Z的去乙酰化， 或表达一种或多种编码HDAC酶的核酸序列，以增加H2A.Z中乙酰基的去 除。

在另一个实施方式中，根据本发明所述方法的改变翻译后修饰也可以包 括抑制或降低一个或多个编码HAT酶的基因的表达，以抑制乙酰化，或表 达一种或多种编码HAT酶的核酸序列，以增加H2A.Z的乙酰化。

可以使用内源性、组成型、诱导型或组织特异性启动子来驱动根据本发 明方法所述核酸序列的表达。

感温应答是在生物体内观察到的对温度变化产生的应答。这些应答包括 基因转录的变化。在植物中，基因（如HSP70）在较高温度下上调 （up-regulated）。在（温度转录组的）基因转录较宽温度范围（约12℃至≥ 37℃）内，HSP70基因转录与温度的升高成一定的比例，因此能够被用作 指示温度转录组上调或下调的标记基因。转录变化也会影响发育过程，而且 在植物中，温度的增加会影响许多发育过程，例如，开花、胚轴伸长和叶柄 生长。它也会导致过渡到不同发育阶段的速度增加。因此，较高的环境温度 会加速幼体到成体的过渡。温度的增加会导致开花时间的加速、较大的胚轴 伸长、叶柄生长、发芽、以及植物生长和发育的总体加速。

根据本发明所述的方法，植物中的感温应答可以通过上述方法改变，而 且所述应答包括一种或多种、优选所有的下述发育应答：种子休眠解除、发 芽、胚轴伸长、叶柄生长、春化、幼体到成体的过渡、开花、衰老和温度防 护性应答（temperature-protective responses）。

在一个实施方式中，植物中全部或全体的感温应答都被改变。因此，植 物响应于温度变化而表现的基本上所有发育和转录应答都可以通过增加或 减少所述生物体内的H2A.Z水平或改变H2A.Z的翻译后修饰或它们的组合 而被改变。

本发明的另一方面涉及一种诱导真核生物体中高温应答的方法，所述方 法包括抑制或降低核小体内H2A.Z的存在。所述应答可以是组成型的，而 且，即使在通常认为是低温的温度下也可以引起所述植物的应答。所述方法 可以包括如本文所述地改变一个或多个编码H2A.Z的基因的表达，增加 H2A.Z的乙酰化状态或阻止H2A.Z组装进入核小体。

如本文所示，抑制或降低植物核小体内H2A.Z的存在会导致通常在高 温条件下（约≥22℃）才能观察到的应答的诱导。突变植物拟表型为在较高 温度下生长的（比实际温度高5℃左右）野生型植物。虽然本领域技术人员 知道决定高温应答的温度随植物种类而变化，但是一般而言，植物的高温应 答是在约20℃至约24℃下表现的应答，例如对于拟南芥而言为约≥22℃。

因此，在一个实施方式中，可以使用本发明所述的方法来处理需要特定 临界温度以获得适当生长和产量的农作物，以降低所述温度的临界值。这对 在温室中生长的农作物有特别的好处。

本发明另一方面涉及一种诱导真核生物体中低温应答的方法，所述方法 包括抑制或降低H2A.Z从核小体内的释放。所述应答可以是组成型的。如 本文所述，所述方法可以包括阻止H2A.Z的乙酰化状态或防止H2A.Z从核 小体内解体。例如在植物中，突变植物拟表型为在较低温度(≤17℃)下生长 的野生型植物。虽然本领域技术人员知道决定低温应答的温度随植物种类而 变化，但是一般而言，植物的低温应答是在约15℃至约19℃下表现的应答， 例如对于拟南芥而言为约≤17℃。本领域技术人员能够理解的是，其它植物 有不同的最佳温度。

本发明还涉及一种制备真核生物体（如植物）的方法，所述植物即使在 低温下和在不正常表现该应答的条件下也表现组成型高温应答。因此，在一 个实施方式中，本发明涉及一种制备表现组成型高温应答植物的方法，所述 方法包括抑制或降低核小体内H2A.Z的存在。如本文所述，所述方法可以 包括改变一个或多个编码H2A.Z的基因的表达，增加H2A.Z的乙酰化状态 或防止H2A.Z组装进入核小体。

在另一方面，本发明涉及一种制备真核生物体（如植物）的方法，所述 植物即使在高温下或在不正常表现该应答的条件下也表现组成型低温应答。 因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种制备表现组成型低温应答植物的 方法，所述方法包括抑制或减少H2A.Z从核小体内的释放。如本文所述， 所述方法可以包括防止H2A.Z的乙酰化状态或防止H2A.Z组装进入核小体。

本发明还提供了一种植物H2A.Z分子，其中不可乙酰化的氨基酸残基 取代了分子的一些或所有可乙酰化的赖氨酸。

本发明还提供了一种植物，所述植物含有新型H2A.Z分子或编码该分 子的核酸序列，H2A.Z分子中，不可乙酰化的氨基酸残基取代了分子的一些 或所有赖氨酸。

此外，本发明提供了一种植物，所述植物含有组蛋白H2A.Z的不可乙 酰化变体（version）、足以去除H2A.Z中组蛋白乙酰化标记的过表达的组蛋 白去乙酰化酶、或下调的组蛋白乙酰转移酶活性。

根据上述的各个方面，所述植物可以选自本文其它地方列举的植物。

本发明的另一个目的是根据上述实施方式所述地通过改变温度感知来 提供一种提高农作物植物产量的方法。在一个实施方式中，这个方面涉及一 种改善谷类作物（grain crops）中籽粒灌浆、籽粒组成或谷物数量或涉及一 种防止过早地开花或结实的方法。特别地，所述方法涉及通过改变温度感知 增加农作物植物的产量，以使所述农作物即使在比籽粒灌浆通常受限的温度 还高的温度下也能够获得其潜在产量，或以避免暴露在通常引起过早结实的 温度条件下的过早结实/开花。

如上所述，许多有害的真核微生物将温度感知作为诱导致病的信号，例 如荚膜组织胞浆菌和白色念珠菌(Nguyen and Sil,2008)。因此，在这些生物 体中选择性干扰温度感知的能力能够提供防止致病的方法。由于沉积和释放 机制的组分是高度保守的，因此它们可成为小分子抑制的良好靶标。而且， 由于酵母菌在未致病时仍是可以生存的，因此对耐药菌株的选择将会不充分 （weak）。

因此，在另一方面，本发明还涉及一种抑制真核微生物致病的方法，所 述方法包括改变真核生物体的温度感知，所述改变温度感知包括改变核小体 内H2A.Z的存在。本文中描述了改变温度感知的方法。而且，小分子疗法 能够用于靶向系统。

从本文提供的完整公开内容和所附的权利要求书中将可以理解本发明 的其它目的和优势。

虽然上文已经大体上描述了本发明，但是下文提供了非限制性实施例来 进一步描述本发明、最佳实施方式以及帮助本领域技术人员使其能够全面地 实践本发明。然而，这些实施例的具体内容不应该理解为对本发明的限制。

实施例

实验步骤

除另有说明外，本文所使用的材料和方法如下：

对温度感知的基因筛选

所有实验都是在Col-0背景下进行的。为了鉴定环境温度感知途径中被 干扰的突变体，进行了HSP70::LUC报告菌株的快中子诱变群的正向遗传学 筛选(在HAS KFKI-Atomic Energy Research Institute对种子进行辐射，匈牙 利)。七天大的幼苗在12℃下培养48小时，然后转移到27℃培养3小时， 并通过喷洒荧光素对LUC表达进行筛选。将entr突变体鉴定为具有比报告 株系明显更高的LUC诱导。通过基于微阵列的转录分析，ENTR1被确认为 ARP6。含有ARP6基因组片段(P_ARP6::ARP6)的基因组片段被用来补充entr1 突变体。

转录分析

使用Trizol(Invitrogen)提取总RNA并进行转录分析。根据制造商的说明 书，将标记的靶标与Affymetrix ATH1阵列杂交。使用GenespringGX 7.3 (Agilent)分析微阵列数据。

核染色质的免疫纯化(ChIP)

使用经过微小修改的文献所述方法(Gendrel et al.,2002)进行ChIP。将 17℃下生长七天大的幼苗转移到27℃下培养2小时，在两个温度下对核染色 质进行平行的ChIP实验。对于H2A.Z和H3的ChIP，在1ml含0.2个单位 的小球菌核酸酶(MNase)的MNase消化缓冲液（10mM Tris-HCl[pH 8.0]， 50mM NaCl，1mM β-巯基乙醇，0.1% NP40，1mM CaCl2和1x蛋白酶抑制 剂混合物[Roche]）中将交联的核染色质片段化。使用5mM EDTA使消化终 止。用GFP标记HTA11（一种拟南芥H2A.Z同源物），并且用GFP多克隆 抗体(Abcam,ab290)进行ChIP。使用H3抗体(Abcam,ab1791)分析组蛋白H3 的动态。对于RNA聚合酶II占用率动态实验，通过在裂解缓冲液(10mM Tris-HCl[pH 8]，150mM NaCl，1mM EDTA[pH 8]，0.1%的脱氧胆酸盐和 1x的蛋白酶抑制剂混合物)中超声裂解核染色质，而且使用针对RNA聚合 酶II CTD重复YSPTSPS的单克隆抗体(Abcam,ab817)进行ChIP。所有的 ChIP实验都是在含有10mM Tris-HCl[pH 8]、5mM EDTA[pH 8.0]、150mM NaCl、1% Triton X-100和1x蛋白酶抑制剂混合物的缓冲液中进行的。通过 定量PCR(qPCR)分析相对富集的相关DNA片段。补充材料中给出了ChIP 实验中用于靶标DNA检测和定量的所有寡核苷酸序列。每个ChIP实验至少 重复三次，且示出的数据从具有代表性的实验中得到。

核小体的定位

将富集的核染色质用小球菌核酸酶(MNase)消化，然后使用转录起始位 点(TSS)周围的嵌合寡核苷酸（tiled oligonucleotides）进行qPCR，以用于核 小体的定位和分析。寡核苷酸（Oligos）被设计为HSP70启动子中的每35-45bp 具有95-110bp的扩增子。为了进行核小体定位，用小球菌核酸酶消化来自不 同温度(17℃、22℃、27℃)下生长的Col-0和entr1七天大幼苗的核染色质， 而且单核小体大小的片段用凝胶进行纯化并用于qPCR。相对的核小体占用 率表示为未切割的核染色质DNA的分数，并且根据HSP70基因相对于每个 引物对的TSS的位置进行做图，所述位置表示每个扩增子的中心。

通过羟磷灰石色谱法（hydroxyapatite chromatography）进行核小体纯化

将在17℃下生长的幼苗冻存在液氮中，没有交联，并且准备好用于ChIP 实验的核染色质。接着在17℃下用MNase消化15分钟，将核染色质片段结 合到羟磷灰石上，根据文献(Brand et al.,2008)中所述方法纯化未连接组蛋白 和其它相关蛋白的核小体。将纯化的核小体更换至含有10mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mm EDTA(pH 8.0)、25mM NaCl和1x蛋白酶抑制剂混合物的缓冲 液中。为了确定限制性内切酶在17℃和27℃下的可用性，分析了约500ng 当量的核小体DNA。使用HSP70-1和+1核小体的qPCR得到了受保护的输 入核小体DNA的分数。针对不含有限制性位点的At4g07700的+1核小体对 代表性的数据进行标准化。

实施例1

HSP70是环境温度感知途径的输出

为了鉴定幼苗中主要的环境温度应答，我们分析了在12℃下然后被转移 到27℃下培养的12天大的植物的转录组。我们发现在这种条件下，有2454 个基因至少被上调2倍，有2880个基因被下调2倍(环境温度转录组；图1A)。 在类似的研究中，没有明显的应激标记的诱导，这表明这个温度范围不会引 起热应激(Balasubramanian et al.,2006)。我们发现HSP70(At3g12580)在较高 温度下被强烈地上调（图1B）。虽然该转录组的特征是对环境温度改变的应 答，但是由于感温途径的转录输出在不同的固定温度下应该不同，因此我们 试图确定的是是否任何这些基因都会对固定生长温度的差别做出应答。因 此，我们对12℃、17℃、22℃和27℃下生长的植物在公开可用的数据中的 诱导环境温度转录组基因的行为进行了分析(NASCARRAYS-147 (http://affymetrix.arabidopsis.info/narrays/experimentpage.pl？experimentid=147) .)。我们发现在这一温度范围内，HSP70的表达水平与环境温度成比例(图 1C)。虽然这些实验是对幼苗进行的，但在成熟植物中HSP70也表现出上述 表达动态(Balasubramanian et al.,2006)。因此，我们使用HSP70启动子和荧 光素酶(HSP70::LUC)的融合物以无破坏性地监测内源性基因的活性。 HSP70::LUC反映了HSP70的表达(图1D)，为我们提供了植物不依赖于高温 胁迫的温度感知状态的动态和灵敏度的分析(Larkindale and Vierling,2008; Sung et al.,2001)。

实施例2

ARP6处于控制开花的环境温度感知途径中。

为了鉴定控制环境温度转录组所需的基因，我们筛选了2600个快中子 辐射过的HSP70::LUC幼苗的个别M2家族。两种突变体entr1和entr2（增 强的温度应答1和2）表现出组成型较高的LUC表达(图1E)。使用互补交叉 进行的遗传分析显示，这些突变是等位基因（allelic）。基于克隆的转录物表 明在entr1和entr2中均不存在ARP6转录物(图1F)。用ARP6基因组片段转 化的entr1能够补救HSP70::LUC的表达水平和entr1的异常发育(图1G)， 这证实它是一个新的arp6等位基因。我们将entr1和entr2分别称为arp6-10 和arp6-11。在开花时期筛选中已经鉴定出了ARP6中的拟南芥突变体(Choi  et al.,2005;Deal et al.,2005;Martin-Trillo et al.,2006)。为了确定ARP6是否在 开花的环境温度途径中起作用，我们分析了arp6-10的开花。与以前的报告 相一致的是，arp6-10在21℃的长日照和在22℃的短日照中开花较早(图 2A-2D)。然后，我们研究了arp6-10对27℃短日照的应答，因为开花的热 诱导在短日照是最明显的(Balasubramanian et al.,2006)。值得注意的是， arp6-10在27℃的短日照中开花时大约有5片叶片(图2E和2F)。因此，ARP6 在控制开花的环境温度途径中发挥着作用。

实施例3

ARP6全面控制对环境温度的发育应答

在应答较高环境温度时，植物结构会发生特定的适应性改变，所述改变 包括胚轴生长和叶柄伸长的增加(Gray et al.,1998;Koini et al.,2009)。为了了 解arp6-10是否在其结构、HSP70表达以及花期上表现出全面的高温应答， 我们分析了上述性状。我们发现结构应答在arp6背景中被强烈地增强(图2G 和2H以及图8)，以致于生长在17℃下的arp6植物比生长在22℃下的野生 型植物表现出更大程度的胚轴伸长和叶柄生长，在22℃和27℃之间有等量 的差异。已经证明这些表型依赖于PIF4转录因子(Koini et al.,2009)，因此不 出意料地我们还观察到了温度诱导的差异，即使在arp6-10突变体中也有这 种差异。然而，为了控制这些表型的正确表达水平，需要有功能的ARP6。 植物生物学中的长期观察为热时间是衡量发育阶段过渡速度的关键指标 （key measure），而且较高环境温度可以加速所述阶段的过渡(Poethig,2003)。 除了arp6-10的开花时间加快之外，我们还观察到更快的幼体到成体的过渡 （未显示数据），这与早先的研究(Martin-Trillo et al.,2006)一致。因此， arp6-10使所有我们检验过的已知受温度调节的发育决定子（developmental  decisions）特异性地上调。因此，ARP6缺陷型植物会表现出组成型高温发 育过程。

实施例4

在arp6中环境温度转录组被全面误调节

为了确定在不存在ARP6的条件下在转录水平上是否会发生发育应答的 全面误调节，我们比较了arp6-10和野生型的环境温度转录组。虽然在野生 型中，温度从12℃变换到27℃时，2454个基因被上调2倍以上(图3A,灰 色柱)，但是我们观察到这个环境温度转录组即使在12℃下在arp6-10中也 始终被表达（图3A,蓝色柱）。值得注意的是，这种效果比基因表达自身的 组成型上调的程度更大，因为在野生型中，温度升高时至少下调2倍的2880 个基因（图3B,灰色柱）在arp6-10中也被组成型地抑制。因此，在转录水 平上，12℃下的arp6-10突变体与较高温度下的植物类似。在双向分析 （reciprocal analysis）中，与野生型相比，12℃下arp6-10中2倍以上高表达 的转录物(图3C,蓝色柱)在野生型中会被较高环境温度强烈地诱导，然而与 12℃下的野生型相比，在12℃下arp6-10中那些受抑制的基因(图3D,蓝色 柱)在野生型中会由于较高温度受到转录抑制(图3D,灰色柱)。这些结果表 明：在不存在ARP6时，环境温度调节基因会组成型误表达。为了确定整个 环境温度转录组依赖于ARP6的比例，我们将野生型对较高环境温度应答的 基因表达变化和恒定温度下由arp6-10引起的表达变化进行了比较。很明显， 整个转录组之间具有很强的相关性：有功能的ARP6等位基因几乎占环境温 度转录应答的一半(R²=0.466,P<0.001)。因此，ARP6在调节转录组对环境 温度的应答中是必需的。

实施例5

H2A.Z占用率随温度变化

ARP6编码真核生物中保守的SWR1复合物的亚基，并且是将替代地组 蛋白H2A.Z插入核小体中代替H2A的过程中所必需的(Deal et al.,2007; Kobor et al.,2004;Krogan et al.,2003;Mizuguchi et al.,2004)。拟南芥中存在 一些H2A.Z家族成员，并且我们发现了hta9 hta11双重突变体拟表型为 arp6-10，表现出早期的开花和结构应答以及增加的HSP70表达。这表明 arp6-10的温度应答是由于不能将含有H2A.Z的核小体整合到基因组中而造 成的。在酵母菌、果蝇、秀丽隐杆线虫(C.elegans)、拟南芥和哺乳动物细胞 中进行的整体分析揭示：特别是在转录起始位点附近的+1位置富有含H2A.Z 的核小体(Creyghton et al.,2008;Mavrich et al.,2008;Raisner et al.,2005; Whittle et al.,2008;Zhang et al.,2005;Zilberman et al.,2008)。H2A.Z参与将静 默基因的启动子维持在平衡状态以准备进行适当的转录(Li et al.,2005)。对于 温度转录组的调节中ARP6所起的核心作用，一种可能的解释是含有H2A.Z 的核小体使得转录具有温度依赖性。为了测试H2A.Z动态变化对温度的应 答，我们使用核染色质免疫纯化(ChIP)来追踪不同环境应答中的HSP70启动 子的H2A.Z占用率。我们使用受内源性HTA11启动子驱动而表达的 HTA11:GFP来进行我们的ChIP实验。这种构建体补充了hta9 hta11双重突 变体(图4A)，这表明HTA11:GFP是有功能的。HTA11:GFP的显微镜检查表 明HTA11:GFP进入常染色质，这与其它研究中的结果相同(图9A和9B) (Zilberman et al.,2008)。

ChIP分析表明arp6-10的HSP70启动子中几乎没有H2A.Z占用(图9C)， 这表明arp6-10中增强的HSP70表达是由核染色质结构的这种变化所造成 的，这与hta9 hta11表型所示的相同。为了了解温度是否影响HSP70的H2A.Z 占用率，我们将17℃下生长的幼苗与转换到27℃下2小时的幼苗进行了对 比。一致的是，在17℃时HSP70表达低，我们在+1核小体处观察到了H2A.Z 的高占用率(图4B)。然而这种占用率是高度依赖温度的，与17℃相比，27℃ 下H2A.Z占用率有了显著地下降(图4B)。我们使用给出相似结果的H2A.Z 抗体(Deal et al.,2007)验证了我们的ChIP结果(图9D)。这些结果与模型一致， 在模型中，H2A.Z占用率是温度应答基因转录的限速因素，而且H2A.Z占 用率对温度作出应答。为了确定我们观察到的行为是H2A.Z所特有的还是 核小体对温度应答的一般特性，我们使用组蛋白H3特异性抗体进行了平行 ChIP研究。当温度变化到27℃时，+1核小体处的H3水平下降，虽然没有 达到H2A.Z的程度(图4C)。值得注意的是，在-1核小体处，H2A.Z占用率 减少，H3水平却没有明显的下降。这表明含有H2A.Z的核小体对温度具有 特异性动态应答。由于RNA Pol II必须越过+1核小体才能发生转录，这就 表明了基因转录的模型可以通过+1核小体的温度应答占用率来控制。

我们观察到的HSP70的H3占用率变化可能是由具有温度特异性应答的 H2A.Z核小体所引起的。因此，我们将我们的分析扩大到其它基因座的TSS， 选择了At4g07700是因为它不含有H2A.Z(Zilberman et al.,2008)，而且通常 都是转录沉默的，防止由RNA Pol II介导的核小体位移所引起的复杂因素， 而且使用最近的模型能够预测它具有良好有序的核小体结构(Kaplan et al., 2009)。使用H3特异性抗体进行的ChIP分析显示出预测的核小体占用率。 ChIP分析显示当温度转变到27℃时该基因座处的H3占用率没有发生显著地 变化(图4D)。这与我们对有很少或没有H2A.Z整合的HSP70的-1核小体的 研究结果一致，并且H3水平不显示出显著的温度应答动态。这些结果表明： H2A.Z是核染色质主要的决定性温度应答因子。

为了测试这种应答是否是HSP70所特有的应答，我们检测了与许多其 它温度上调基因推定的+1核小体相应的TSS近侧区(图5A-5C)。一致的是， 27℃下所有这些基因都表现出H2A.Z占用率的显著减少。由于已经证实了 FT是介导早期开花的感温途径的必要输出，因此，我们想知道H2A.Z是否 存在于FT启动子中以及它是否是温度敏感性的。虽然在幼苗中没有显著地 表达FT，但是H2A.Z的释放可能对赋予FT基因座转录能力是必不可少的。 对全面H2A.占用率数据(Zilberman et al.,2008)的分析表明：FT启动子中含 有丰富的H2A.Z。因此，我们分析了对温度变化应答的FT处H2A.Z的变化。 一致地是，我们观察到了在较高温度下FT启动子处H2A.Z的缺失(图9E),这 就解释了arp6中开花加快的原因。

实施例6

H2A.Z释放的发生不依赖于转录

我们已证实：在温度诱导型基因的+1核小体中，H2A.Z占用率随温度 的增加动态地降低。由于温度依赖性组蛋白的释放可能是较高的转录活性导 致的结果，且并不是必要的原因，因此，我们试图确定H2A.Z释放的发生 是否依赖于转录。为了测试这一点，我们分析了在其启动子中富含H2A.Z、 并且响应于温度升高而下调或表现出稳定表达的基因。然后我们用ChIP分 析了对环境温度改变的应答的H2A.Z占用率(图5D-5I)。我们观察到所有被 检测基因的H2A.Z占用率都有明显的下降，而并不依赖于它们对温度的转 录应答。如随温度发生变化的ChIP的测定，该结果表明含有H2A.Z的核小 体具有结合亲和力或占用率。这一不依赖于转录的结果与果蝇的Hsp70基因 座处核小体的行为相似(Petesch and Lis,2008)。由于含有H2A.Z的核小体的 存在是环境温度转录组中大多数基因的表达的限速因素，这表明H2A.Z对 温度的应答在整合温度信息中发挥着关键的作用。

实施例7

HSP70+1核小体在arp6中表现出组成型温度应答

由于我们已经发现在较高温度下H2A.Z核小体会被释放，因此，通过 研究MNase的可用性，我们分析了不同温度下HSP70启动子的核小体结构。 MNase能够消化核小体游离DNA和核小体之间的连接区域，而不会消化核 小体自身的DNA(Petesch and Lis,2008)。对于在17℃、22℃和27℃下生长 的植物中，我们观察到核小体占用率随较高温度显著下降(图6A)，这可以帮 助我们理解HSP70转录如何随着温度而增加。相比之下，arp6背景中HSP70 的+1核小体即使在17℃下也组成型地处于开放构型（open conformation）（图 6B），而在该温度下，野生型有显著地核小体占用率。在较高温度下，我们 也观察到了-1占用率的减少，这可能是由较高的转录活性所造成的。该-1占 用率的减少似乎并不依赖于H2A.Z。一致的是，不含有H2A.Z核小体的 At4g07700核小体结构不随温度发生变化(图6C)。

目前为止，所述结果与在核小体占用率水平上调节HSP70表达的模型 一致。对于转录靶基因的RNA Pol II，它必须能够克服核小体形成的物理障 碍(Knezetic and Luse,1986;Lorch et al.,1987)。

许多研究表明，诱导进行转录的基因上的核小体会从它们的DNA上解 离或部分展开，从而允许NA Pol II通过，并且核小体的存在，尤其是转录 起始位点附近+1核小体的存在可以是控制转录的限速因素(Boeger et al., 2008;Boeger et al.,2003)。在热休克条件下，果蝇Hsp70基因座处的核小体 在RNA Pol II到达之前脱离基因主体，这表明核小体能够对调节转录发挥作 用(Petesch and Lis,2008)。

我们使用RNA Pol II ChIP研究野生型和arp6-10中HSP70的转录动态。 在17℃下生长的野生型中，我们观察到存在于TSS的RNA Pol II比存在于 基因主体内的比例更大。相比之下，在arp6的基因主体内存在更大比例的 RNA Pol II(图6D)。在27℃，RNA Pol II占用率发生了强烈的变化，由于在 TSS下游出现了RNA Pol II占用率的最高峰值。由于这个新的RNA Pol II峰 值与+1核小体占用的区域相对应，在没有诱导的条件下，野生型的+1核小 体很可能在将转录维持在平衡状态中发挥作用。升高温度时，Pol II在基因 主体中的存在会显著地增加(图6E)。这与对秀丽隐杆线虫和果蝇的研究一 致，该研究已经表明H2A.Z+1核小体可以将RNA Pol II维持在平衡状态 (Mavrich et al.,2008;Whittle et al.,2008)。因此，含有H2A.Z的核小体的存在 是HSP70上调的限速因素。

实施例8

H2A.Z核小体更紧密地缠绕DNA

我们已经发现，在没有H2A.Z整合时，含有标准H2A的核小体不能阻 止上调和下调基因高温转录组的组成型表达。这种差异可能是由H2A.Z核 小体行为的不同直接造成的，或者可能反应由H2A.Z招致（recruited）的其 它因素的影响。为了区分这两种可能性，在用MNase部分消化后，我们使 用羟磷灰石层析纯化17℃下生长的植物的核小体。目前，已经证明RNA Pol II不会主动地展开核小体，而是依赖于局部展开DNA的波动才使得RNA Pol II能够对其模板进行转录(Hodges et al.,2009)。由于RNA Pol II进入核小体 的步骤是转录的限速步骤，因此，我们分析了17℃和27℃下被H2A.Z和H2A 核小体阻挡的限制性酶切位点的暴露(图6F和6G)。该分析提供了核小体 DNA局部展开和暴露程度的直接测量方法(Polach and Widom,1995)。在17℃ 和27℃下，HSP70含有H2A的-1核小体比含有H2A.Z的+1核小体表现出 更高的可用性。含有H2A的核小体的这种更高的可用性解释了在H2A.Z未 整合入核染色质的arp6背景中HSP70的更高转录水平。在较高的温度下这 些位点的暴露率似乎有所提高，这表明核小体DNA的局部波动随温度而增 加。由于-1和+1核小体间的Hph I位点的可用性可能有着细微的差别，所以 我们纯化了arp6的核小体。在这种材料中，核小体都含有H2A，而且正如 我们所预测的，它们的可用性相同(图6H)。这些结果表明含有H2A.Z的核 小体更紧密地缠绕DNA，且较高的温度可以克服这种现象。由于这些核小 体是从植物材料中纯化得到，因此我们并没有排除翻译后修饰（如乙酰化） 可能参与了该应答的调节。重要的是，我们的分析是在高度纯化的材料上进 行的，这表明我们观察到的动态应答是核小体-DNA相互作用而产生的固有 特性。我们发现与H2A核小体相比，含有H2A.Z的核小体上的DNA局部 展开程度有所降低，这表明了根据细胞的温度调节转录的直接机制。

实施例9

H2A.Z控制温度转录组的作用是保守的

由于温度变化代表对固着生物体的重大挑战，因此，我们试图确定对温 度转录组的控制是否普遍是真核生物体中H2A.Z核小体的保守功能。为了 测试这点，我们分析了出芽生殖的酵母菌的H2A.Z、Htz1在温度信号传导中 的作用。先前已经确定了Htz1转录组(Meneghini et al.,2003)，因此，我们的 测试是了解当野生型酵母菌从29℃转换到33℃时，在htz1Δ背景中误调节的 这些基因是否还表现出相应的变化(Gasch et al.,2000)。明显地，我们观察到 了显著的相关性(R²=0.30,P<0.001)，那些在较高温度下上调的基因在htz1Δ 中也趋于被上调，并且反之亦然(图10)。这与我们在拟南芥中(图3E)观察到 的关系相同，这表明含有H2A.Z的核小体的丢失拟表型为较高温度下的细 胞。这些数据表明高温信号在酵母菌和植物中都由H2A.Z核小体介导。

实施例10

表达H2A.Z的非乙酰化的(突变的)变体

拟南芥编码三个主要的H2A.Z基因(HTA8,HTA9和HTA11)。两个主要 的基因HTA9和HTA11的突变体(在hta9 hta11双重突变体中)拟表型为arp6 突变体，所述arp6突变体显示了增强的温度应答。我们能够通过从其天然启 动子中表达HTA11来补充hta9 hta11双重突变体的表型。

使用寡核苷酸W1160(5’CACCGAAATGTTTTTCTCTACG 3’)和W1161 (5’CTCCTTGGTGGTTTTGTTGA 3’)能够扩增含有1589bp的启动子区和编 码序列（基因组协调染色体（genomic cordinates Chromosome）3:20194677 -20197463）的2786bp的HTA11(At3g54560)基因组区。根据制造商的说明 书，将扩增的片段克隆到pENTR载体(invitrogen)中。然后，将所得的 pENTR-HTA11用于进一步的诱变实验。将PCR介导的定点诱变用于使 HTA11N-端尾部保守的赖氨酸残基突变。

选择HTA11 N-端的4、7、13、19和21位的赖氨酸残基用于突变。下 文中将具有完整的所有五个赖氨酸残基的野生型HTA11称作 HTA11-KKKKK。

寡核苷酸W1443(5’ TCAAGAGACATGGCAGGCAGAGGTGGAAGAGGACTCGTAGCTGCG 3’) 和W1444(5’ CGCAGCTACGAGTCCTCTTCCACCTCTGCCTGCCATGTCTCTTGA 3’)被 用来将赖氨酸残基4(K₄)和K₇定向突变为精氨酸（R），该突变以 HTA11-KKKKK为模板。产生的质粒被命名为HTA11-RRKKK。

寡核苷酸W1445(5’ GGACTCGTAGCTGCGAGGACGATGGCTGCTAAC 3’)和W1446(5’ GTTAGCAGCCATCGTCCTCGCAGCTACGAGTCC 3’)被用来将赖氨酸残基 13(K₁₃)定向突变为精氨酸(R)，该突变以HTA11-KKKKK为模板。产生的质 粒被命名为HTA11-KKRKK。

寡核苷酸W1447(5’ GACGATGGCTGCTAACAGGGACAGAGACAAGGACAAGAAG 3’)和 W1448(5’CTTCTTGTCCTTGTCTCTGTCCCTGTTAGCAGCCATCGTC 3’) 被用来将赖氨酸残基19和21(K₁₉、K₂₁)定向突变为精氨酸(R)，该突变以 HTA11-KKKKK为模板。产生的质粒被命名为HTA11-KKKRR。

寡核苷酸W1445(5’ GGACTCGTAGCTGCGAGGACGATGGCTGCTAAC 3’)和W1446(5’ GTTAGCAGCCATCGTCCTCGCAGCTACGAGTCC 3’)被用来将赖氨酸残基 13(K₁₃)定向突变为精氨酸(R)，该突变以HTA11-RRKKK为模板。产生的质 粒被命名为HTA11-RRRKK。

寡核苷酸W1447(5’ GACGATGGCTGCTAACAGGGACAGAGACAAGGACAAGAAG 3’)和 W1448(5’CTTCTTGTCCTTGTCTCTGTCCCTGTTAGCAGCCATCGTC 3’) 被用来将赖氨酸残基19和21(K₁₉、K₂₁)定向突变为精氨酸(R)，该突变以 HTA11-RRRKK为模板。产生的质粒被命名为HTA11-RRRRR。

HTA11的野生型(HTA11-KKKKK)和诱变型(HTA11-RRKKK、 HTA11-KKRKK、HTA11-KKKRR、HTA11-RRRKK和HTA11-RRRRR)通过 重组被转入二元通道载体(binary gateway vector)pW1357中，以便具有用 3xFLAG标记的蛋白质的C-端融合。将用FLAG标记的HTA11的野生型和 突变型用来转化hta9hta11双重突变体和Col-0野生型。

实施例11

敲除（knocking out）(或抑制(knocking down))乙酰转移酶基因

拟南芥组蛋白乙酰转移酶家族的HAC家族由五个基因At1g79000 HAC1、At1g67220(HAC2),At1g55970(HAC4),At3g12980(HAC5)和 At1g16710(HAC12)组成。使用Web MicroRNA Designer (http://wmd3.weigelworld.org/cgi-bin/webapp.cgi)设计了人工微RMA (miRNA)。用寡核苷酸如 (http://wmd3.weigelworld.org/downloads/Cloning_of_artificial_microRNAs.pdf) 建议地扩增miRNA。扩增的miRNA被克隆到pENTR载体中，然后通过重 组转入二元转化载体pW545，得到35S::HACmiRNA(pW1009)。使用带有二 元载体pW1009的农杆菌（Agrobacterium）菌株转化拟南芥Col-0。转基因 株系的初步分析表现出与期望一致的开花延迟的表型。为了表征环境温度应 答，我们详细分析了这些转基因株系。

实施例12

过表达去乙酰化酶

从cDNA文库中扩增了一个或多个组蛋白去乙酰化酶基因的编码蛋白 质的序列，并且将其克隆到pENTR载体中，然后在控制组成型CaMV35S 启动子的条件下转入二元载体。用携带二元载体的农杆菌转化拟南芥植物， 以获得转基因株系。

核小体作为转录的温度应答性调节因子

核小体通过调节转录因子接近其顺式元件的能力或者阻止RNA Pol II 的通过，从而在控制转录过程中起着积极的作用(Lam et al.,2008;Segal and  Widom,2009)。蛋白质接近缠绕组蛋白的DNA的过程是通过局部的展开事 件介导的。在我们的研究和其它关于含有H2A的核小体的研究(Polach and  Widom,1995)中，这种展开不受环境温度变化的影响。相比之下，含有H2A.Z 的核小体与其DNA之间表现出更加紧密的缠绕，这与核小体稳定性的研究 是一致的(Thambirajah et al.,2006)。观察发现含有H2A.Z的核小体在基因组 内排列的更紧密并且更清晰，这一结果也支持了上述研究。对重组核小体阵 列的研究也已经表明，在含有H2A.Z的核小体中，核小体内部的相互作用 更强，然而，这些核小体之间的相互作用较弱(Fan et al.,2002)。除了含有 H2A.Z的核小体具有更加紧密的DNA缠绕外，我们的结果还表明展开的程 度也响应于温度。这一结果暗示了温度可以影响基因表达的直接机理，因为 已经表明RNA Pol II不会主动地侵入核小体，而是在延伸转录之前等待DNA 从核小体局部展开(Hodges et al.,2009)。这样，在较高的温度下，由于局部 展开的增加，带有终止RNA Pol II的基因会表现出增强的转录(图7)。对于 那些随温度而转录降低的基因，我们认为较高的温度提高了转录阻抑蛋白的 结合频率。在这些基因中，含有H2A.Z的核小体的存在可以阻止转录阻抑 蛋白的结合，或者可以拮抗DNA的甲基化，这已被证实是H2A.Z在植物中 的作用(Zilberman et al.,2008)。一致的是，含有H2A.Z的核小体已被证明在 抗沉默方面起着重要作用。

有许多基因在arp6-10中能够被上调或下调，并且随着温度的升高表现 出相应的变化。而且，我们观察到酵母菌的htz1Δ突变体中高温转录组存在 相同的反调节（de-regulation），这表明这是含有H2A.Z的核小体的保守功能。 重要的是，在不同的生物中存在很多对温度的生理应答，并且毫无疑问在不 同生物体中存在许多感知和应答温度的机制。例如，PIF4转录因子介导植物 的高温结构表型(Koini et al.,2009)。含有H2A.Z的核小体的机制为这些转录 应答如何与温度状态相结合提供了具有吸引力的模型。从理论上已经表明调 节多重水平上的转录大大地提高了稳健性（robustness）和适应性(Tsankov et  al.,2006)。

感温和开花途径之间的联系

拟南芥（Arabidopsis thaliana）具有高度可塑的生活史，并且遗传上已知 的光热模型能够解释在不同季节生长的植物的大多数的花期变化(Wilczek et  al.,2009)。响应于较高温度的开花的加快需要自主途径中的基因（Blazquez et  al.,2003），而且依赖于FLOWERING LOCUS T（FT)的表达提高 (Balasubramanian et al.,2006;Cerdan and Chory,2003;Halliday et al.,2003; Lee et al.,2007)。

开花是受环境温度调节的主要发育途径之一。已经证明FVE和FCA这 两种自主开花途径基因对于介导开花的环境温度应答是必需的(Blazquez et al.,2003)。值得关注的是，arp6的等位基因esd1-2是fve和fca的上位基因 (Blazquez et al.,2003;Martin-Trillo et al.,2006)。FVE是哺乳类动物成视网膜 细胞瘤相关蛋白的同源物，是组蛋白去乙酰化酶复合物的组分(Ausin et al., 2004;Kim et al.,2004)。除了影响自主途径(通过开花途径整合因子 FLOWERING LOCUS C(FLC)调节花期)，FVE还涉及低温感知(Kim et al., 2004)。总的来说，这些数据表明FVE可以通过调节H2A.Z（也许是通过影 响核小体稳定性的乙酰化）来发挥其在温度依赖性途径上的作用(Ishibashi et  al.,2009;Thambirajah et al.,2006)。虽然感温开花途径是由FT表达水平介导 的，但是CONSTANS(CO)是响应于长光照周期的主要FT表达调节因子，它 对感知温度不是必要的，因为co-1对开花的热诱导应答(Balasubramanian et  al.,2006)。我们观察到FT基因座处的核染色体状态响应于温度并且在缺失 H2A.Z的条件下有所改变，这一结果解释了热诱导途径如何在不依赖于CO 的情况下响应于较高温度而激活FT表达。值得关注的是，另一个影响植物 花期的温度依赖性途径是春化，该途径在arp6的背景下同样受到干扰(Choi  et al.,2005;Deal et al.,2007)。在某一拟南芥基因型中春化需要受arp6的抑 制。这种影响是通过FLC介导的，FLC是一种开花阻抑蛋白，该阻抑蛋白 的表达依赖于SWR1复合物。值得关注的是，在大田实验（large field  experiment）中发现，自然温度的波动可能就足以克服拟南芥中FLC诱导的 开花抑制(Wilczek et al.,2009)。这种类型的温度波动有可能通过H2A.Z动态 发出信号，这与在arp6中观察到的H2A.Z的干扰足以满足春化的需要是一 致的(Choi et al.,2005;Deal et al.,2005;Martin-Trillo et al.,2006)。

温度感知和气候变化

虽然许多植物已经响应于气候变化而表现出花期的加快(Fitter and Fitter, 2002)，那些不表现这样的应答的物种正在局部地区快速灭绝(Willis et al., 2008)。这表明物候应答（phenological responses）对温度变化具有高适应性。 从分子角度理解温度感知机制，能使我们理解不同的物种对温度的进一步升 高是如何应答的，而且这也是培植能够抵挡气候变化的农作物的关键步骤。

实施例13

大麦和芸苔属植物的转化

用载体pBRACT214转化大麦植物，以使改变的H2A.Z不可乙酰化变体 在Ubiquitiin启动子的驱动下组成型地过表达。用载体pBRACT103转化芸 苔属植物，以使H2A.Z的不可乙酰化H2A.Z变体表达。

参考文献

Ausin,I.,Alonso-Blanco,C.,Jarillo,J.A.,Ruiz-Garcia,L.,and  Martinez-Zapater,J.M.(2004).Regulation of flowering time by FVE,a  retinoblastoma-associated protein.Nat Genet 36,162-166.

Balasubramanian,S.,Sureshkumar,S.,Lempe,J.,and Weigel,D.(2006). Potent induction of Arabidopsis thaliana flowering by elevated growth  temperature.PLoS Genet 2,e106.

Blazquez,M.A.,Ahn,J.H.,and Weigel,D.(2003).A thermosensory  pathway controlling flowering time in Arabidopsis thaliana.Nat Genet 33, 168-171.

Boeger,H.,Griesenbeck,J.,and Kornberg,R.D.(2008).Nucleosome  retention and the stochastic nature of promoter chromatin remodeling for  transcription.Cell 133,716-726.

Boeger，H.,Griesenbeck,J.,Strattan,J.S.,and Kornberg,R.D.(2003). Nucleosomes unfold completely at a transcriptionally active promoter.Mol Cell 11,1587-1598.

Brand,M.,Rampalli,S.,Chaturvedi,C.P.,and Dilworth,F.J.(2008). Analysis of epigenetic modifications of chromatin at specific gene loci by native chromatin immunoprecipitation of nucleosomes isolated using hydroxyapatite  chromatography.Nat Protoc 3,398-409.

Cerdan,P.D.,and Chory,J.(2003).Regulation of flowering time by light  quality.Nature 423,881-885.

Choi,K.,Kim,S.,Kim,S.Y.,Kim,M.,Hyun,Y.,Lee,H.,Choe,S.,Kim, S.G.,Michaels,S.,and Lee,I.(2005).SUPPRESSOR OF FRIGIDA3 encodes a  nuclear ACTIN-RELATED PROTEIN6 required for floral repression in  Arabidopsis.Plant Cell 17,2647-2660.

Creyghton,M.P.,Markoulaki,S.,Levine,S.S.,Hanna,J.,Lodato,M.A.,Sha, K.,Young,R.A.,Jaenisch,R.,and Boyer,L.A.(2008).H2AZ is enriched at  polycomb complex target genes in ES cells and is necessary for lineage  commitment.Cell 135,649-661.

Deal,R.B.,Kandasamy,M.K.,McKinney,E.C.,and Meagher,R.B.(2005). The nuclear actin-related protein ARP6 is a pleiotropic developmental regulator  required for the maintenance of FLOWERING LOCUS C expression and  repression of flowering in Arabidopsis.Plant Cell 17,2633-2646.

Deal,R.B.,Topp,C.N.,McKinney,E.C.,and Meagher,R.B.(2007). Repression of flowering in Arabidopsis requires activation of FLOWERING  LOCUS C expression by the histone variant H2A.Z.Plant Cell 19,74-83.

Fan,J.Y.,Gordon,F.,Luger，K.,Hansen,J.C.,and Tremethick,D.J.(2002). The essential histone variant H2A.Z regulates the equilibrium between different  chromatin conformational states.Nat Struct Biol 9,172-176.

Fitter,A.H.,and Fitter,R.S.(2002).Rapid changes in flowering time in  British plants.Science 296,1689-1691.

Gasch,A.P.,Spellman,P.T.,Kao,C.M.,Carmel-Harel,O.,Eisen,M.B., Storz,G.,Botstein,D.,and Brown,P.O.(2000).Genomic expression programs in  the response of yeast cells to environmental changes.Mol Biol Cell 11, 4241-4257.

Gendrel,A.V.,Lippman,Z.,Yordan,C.,Colot,V.,and Martienssen,R.A. (2002).Dependence of heterochromatic histone H3 methylation patterns on the  Arabidopsis gene DDM1.Science 297,1871-1873.

Gray,W.M.,Ostin,A.,Sandberg,G.,Romano,C.P.,and Estelle,M.(1998). High temperature promotes auxin-mediated hypocotyl elongation in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A 95,7197-7202.

Halliday,K.J.,Salter,M.G.,Thingnaes,E.,and Whitelam,G.C.(2003). Phytochrome control of flowering is temperature sensitive and correlates with  expression of the floral integrator FT.Plant J 33,875-885.

Heggie,L.,and Halliday,K.J.(2005).The highs and lows of plant life: temperature and light interactions in development.Int J Dev Biol 49,675-687.

Hodges,C.,Bintu,L.,Lubkowska,L.,Kashlev，M.,and Bustamante,C. (2009).Nucleosomal fluctuations govern the transcription dynamics of RNA  polymerase II.Science 325,626-628.

Ishibashi,T.,Dryhurst,D.,Rose,K.L.,Shabanowitz,J.,Hunt,D.F.,and  Ausio,J.(2009).Acetylation of vertebrate H2A.Z and its effect on the structure  of the nucleosome.Biochemistry 48,5007-5017.

Kaplan,N.,Moore,I.K.,Fondufe-Mittendorf，Y.,Gossett,A.J.,Tillo,D., Field,Y.,LeProust,E.M.,Hughes,T.R.,Lieb,J.D.,Widom,J.,et al.(2009).The  DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome.Nature 458, 362-366.

Kelly,A.E.,and Goulden,M.L.(2008).Rapid shifts in plant distribution  with recent climate change.Proc Natl Acad Sci U S A 105,11823-11826.

Kim,H.J.,Hyun,Y.,Park,J.Y.,Park,M.J.,Park,M.K.,Kim,M.D.,Lee, M.H.,Moon,J.,Lee,I.,and Kim,J.(2004).A genetic link between cold  responses and flowering time through FVE in Arabidopsis thaliana.Nat Genet 36, 167-171.

Kluth,A.,Sprunck,S.,Becker,D.,Lorz,H.,and Lutticke,S.(2002).5' deletion of a gbss1 promoter region from wheat leads to changes in tissue and  developmental specificities.Plant Mol Biol 49,669-682.

Knezetic,J.A.,and Luse,D.S.(1986).The presence of nucleosomes on a  DNA template prevents initiation by RNA polymerase II in vitro.Cell 45, 95-104.

Kobor,M.S.,Venkatasubrahmanyam,S.,Meneghini,M.D.,Gin,J.W., Jennings,J.L.,Link,A.J.,Madhani,H.D.,and Rine,J.(2004).A protein complex  containing the conserved Swi2/Snf2-related ATPase Swr1p deposits histone  variant H2A.Z into euchromatin.PLoS Biol 2,E131.

Koini,M.A.,Alvey,L.,Allen,T.,Tilley,C.A.,Harberd,N.P.,Whitelam, G.C.,and Franklin,K.A.(2009).High temperature-mediated adaptations in plant  architecture require the bHLH transcription factor PIF4.Curr Biol 19,408-413.

Kovalchuk,N.,Smith,J.,Pallotta,M.,Singh,R.,Ismagul,A.,Eliby,S., Bazanova,N.,Milligan,A.S.,Hrmova,M.,Langridge,P.,et al.(2009). Characterization of the wheat endosperm transfer cell-specific protein TaPR60. Plant Mol Biol 71,81-98.

Krogan,N.J.,Keogh,M.C.,Datta,N.,Sawa,C.,Ryan,O.W.,Ding,H.,Haw, R.A.,Pootoolal,J.,Tong,A.,Canadien,V.,et al.(2003).A Snf2 family ATPase  complex required for recruitment of the histone H2A variant Htz1.Mol Cell 12, 1565-1576.

Lam,F.H.,Steger，D.J.,and O'Shea,E.K.(2008).Chromatin decouples  promoter threshold from dynamic range.Nature 453,246-250.

Larkindale,J.,and Vierling,E.(2008).Core genome responses involved in  acclimation to high temperature.Plant Physiol 146,748-761.

Lee,J.H.,Yoo,S.J.,Park,S.H.,Hwang,I.,Lee,J.S.,and Ahn,J.H.(2007). Role of SVP in the control of flowering time by ambient temperature in  Arabidopsis.Genes Dev 21,397-402.

Lenoir，J.,Gegout,J.C.,Marquet,P.A.,de Ruffray,P.,and Brisse,H.(2008). A significant upward shift in plant species optimum elevation during the 20th century.Science 320,1768-1771.

Li,B.,Pattenden,S.G.,Lee,D.,Gutierrez,J.,Chen,J.,Seidel,C.,Gerton,J., and Workman,J.L.(2005).Preferential occupancy of histone variant H2AZ at  inactive promoters influences local histone modifications and chromatin  remodeling.Proc Natl Acad Sci U S A 102,18385-18390.

Li,M.,Singh,R.,Bazanova,N.,Milligan,A.S.,Shirley,N.,Langridge,P., and Lopato,S.(2008).Spatial and temporal expression of endosperm transfer  cell-specific promoters in transgenic rice and barley.Plant Biotechnol J 6, 465-476.

Lorch,Y.,LaPointe,J.W.,and Kornberg,R.D.(1987).Nucleosomes inhibit  the initiation of transcription but allow chain elongation with the displacement of  histones.Cell 49,203-210.

Martin-Trillo,M.,Lazaro,A.,Poethig,R.S.,Gomez-Mena,C.,Pineiro, M.A.,Martinez-Zapater,J.M.,and Jarillo,J.A.(2006).EARLY IN SHORT  DAYS 1(ESD1)encodes ACTIN-RELATED PROTEIN 6(AtARP6),a putative  component of chromatin remodelling complexes that positively regulates FLC  accumulation in Arabidopsis.Development 133,1241-1252.

Mavrich,T.N.,Jiang,C.,Ioshikhes,I.P.,Li,X.,Venters,B.J.,Zanton,S.J., Tomsho,L.P.,Qi,J.,Glaser,R.L.,Schuster，S.C.,et al.(2008).Nucleosome  organization in the Drosophila genome.Nature 453,358-362.

Meneghini,M.D.,Wu,M.,and Madhani,H.D.(2003).Conserved histone  variant H2A.Z protects euchromatin from the ectopic spread of silent  heterochromatin.Cell 112,725-736.

Michael,T.P.,Mockler,T.C.,Breton,G.,McEntee,C.,Byer,A.,Trout,J.D., Hazen,S.P.,Shen,R.,Priest,H.D.,Sullivan,C.M.,et al.(2008).Network  discovery pipeline elucidates conserved time-of-day-specific cis-regulatory  modules.PLoS Genet 4,e14.

Mittler,R.(2006).Abiotic stress,the field environment and stress  combination.Trends Plant Sci 11,15-19.

Mizuguchi,G.,Shen,X.,Landry,J.,Wu,W.H.,Sen,S.,and Wu,C.(2004). ATP-driven exchange of histone H2AZ variant catalyzed by SWR1 chromatin  remodeling complex.Science 303,343-348.

Nguyen,V.Q.,and Sil,A.(2008).Temperature-induced switch to the  pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1,a conserved  transcriptional regulator.Proc Natl Acad Sci U S A 105,4880-4885.

Petesch,S.J.,and Lis,J.T.(2008).Rapid,transcription-independent loss of  nucleosomes over a large chromatin domain at Hsp70 loci.Cell 134,74-84.

Poethig,R.S.(2003).Phase change and the regulation of developmental  timing in plants.Science 301,334-336.

Polach,K.J.,and Widom,J.(1995).Mechanism of protein access to specific  DNA sequences in chromatin:a dynamic equilibrium model for gene regulation. J Mol Biol 254,130-149.

Raisner,R.M.,Hartley,P.D.,Meneghini,M.D.,Bao,M.Z.,Liu,C.L., Schreiber,S.L.,Rando,O.J.,and Madhani,H.D.(2005).Histone variant H2A.Z  marks the 5'ends of both active and inactive genes in euchromatin.Cell 123, 233-248.

Salome,P.A.,and McClung,C.R.(2005).PSEUDO-RESPONSE  REGULATOR 7 and 9 are partially redundant genes essential for the temperature  responsiveness of the Arabidopsis circadian clock.Plant Cell 17,791-803.

Samach,A.,and Wigge,P.A.(2005).Ambient temperature perception in  plants.Curr Opin Plant Biol 8,483-486.

Segal,E.,and Widom,J.(2009).From DNA sequence to transcriptional  behaviour:a quantitative approach.Nat Rev Genet 10,443-456.

Sung,D.Y.,Vierling,E.,and Guy,C.L.(2001).Comprehensive expression  profile analysis of the Arabidopsis Hsp70 gene family.Plant Physiol 126, 789-800.

Sung,S.,and Amasino,R.M.(2005).Remembering winter:toward a  molecular understanding of vernalization.Annu Rev Plant Biol 56,491-508.

Thambirajah,A.A.,Dryhurst,D.,Ishibashi,T.,Li,A.,Maffey,A.H.,and  Ausio,J.(2006).H2A.Z stabilizes chromatin in a way that is dependent on core  histone acetylation.J Biol Chem 281,20036-20044.

Till,B.J.,Zerr,T.,Comai,L.,and Henikoff，S.(2006).A protocol for  TILLING and Ecotilling in plants and animals.Nat Protoc 1,2465-2477.

Tsankov，A.M.,Brown,C.R.,Yu,M.C.,Win,M.Z.,Silver，P.A.,and Casolari, J.M.(2006).Communication between levels of transcriptional control improves  robustness and adaptivity.Molecular systems biology 2,65.

Whittle,C.M.,McClinic,K.N.,Ercan,S.,Zhang,X.,Green,R.D.,Kelly, W.G.,and Lieb,J.D.(2008).The genomic distribution and function of histone  variant HTZ-1 during C.elegans embryogenesis.PLoS Genet 4,e1000187.

Wilczek,A.M.,Roe,J.L.,Knapp,M.C.,Cooper,M.D.,Lopez-Gallego,C., Martin,L.J.,Muir,C.D.,Sim,S.,Walker,A.,Anderson,J.,et al.(2009).Effects  of Genetic Perturbation on Seasonal Life History Plasticity.Science 323, 930-934.

Willis,C.G.,Ruhfel,B.,Primack,R.B.,Miller-Rushing,A.J.,and Davis, C.C.(2008).Phylogenetic patterns of species loss in Thoreau's woods are driven  by climate change.Proc Natl Acad Sci U S A 105,17029-17033.

Zhang,H.,Roberts,D.N.,and Cairns,B.R.(2005).Genome-wide dynamics  of Htz1,a histone H2A variant that poises repressed/basal promoters for  activation through histone loss.Cell 123,219-231.

Zilberman,D.,Coleman-Derr,D.,Ballinger,T.,and Henikoff，S.(2008). Histone H2A.Z and DNA methylation are mutually antagonistic chromatin marks. Nature 456,125-129.