用于分化干细胞的重量克分子渗透压浓度控制

摘要

本公开提供从干细胞产生胚层的方法，包括在具有小于340mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的培养基中培养干细胞。本公开还包括从胚层产生不同细胞谱系以及通过免疫学方法检测它们的方法。本公开还提供用于定向祖细胞产生、分离、培养和增殖和用于从三个胚层产生分化细胞的方法。本公开还提供用于诱导三个胚层的培养基。

说明书

相关申请

本申请要求申请日为2010年6月15日、申请号为61/354,947以及申请日 为2009年10月13日、申请号为61/251,130的同时待审的美国临时申请的优先 权，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本公开涉及将干细胞分化成胚层并且进一步分化成细胞谱系的方法。本公 开还涉及用于所述分化的培养基。

背景技术

人胚胎干细胞(ES)是从发育中的胚泡分离的多能细胞。诱导性多能干细胞 (iPS细胞)是最初从通过遗传方法和非遗传方法重新编程的身体体细胞分离的 多能细胞(对于综述见Amabile和Meissner，2009)。ES细胞以及iPS细胞担当 用于研究分化事件的良好体外系统，以及作为大量产生多种特化细胞类型的无 限来源用于基础研究、药物筛选和再生性治疗应用。

从人多能干细胞，包括人胚胎干细胞和诱导性多能干细胞，诱导某一胚层 细胞类型和随后的永久组织类型的方案有很多，且不相同并且当前没有标准化。 它们通常涉及使用3大类方案的分化(对于综述见Murry和Keller，2008)：

1.基于多能干细胞与其它细胞类型例如饲养细胞(例如D’Amour等，2005， Perrier等，2005)或者体细胞类型(例如induction of cardiomyocytes via co-culture  with murine endoderm-like cell lines(通过与鼠内胚层样细胞系共培养诱导心肌 细胞)(Mummery等，2007))的共培养；在以饲养细胞为条件的培养基中，这诱 导某一胚层命运(Schulz等，2003)或者可选地添加因子(D’Amour等，2005)；

2.基于具有或者缺乏血清并且加入形态发生素情况下作为单层的附着培 养(Nat等，2007；Chambers等，2009)；

3.基于形成称作胚状体(EBs)的3-D聚集体。EBs中的细胞是多能性的，具 有发育成为3个胚层(内胚层、中胚层或者外胚层)任一胚层细胞的倾向(Odorico 等，2001)。通常，还在EB形成时直接加入形态发生素以充当诱导指示或者在 随后时间点加入(例如在EBs平板接种之后)以选择性地支持所希望细胞谱系的 存活(见胚胎干细胞方案)。

这些方案的主要缺点可以总结如下。方案是每一实验室特异性的并且非常 依赖于技术员和实验室，这使得这些方案很难在无需巨大时间和精力投入情况 下而转移和在其它实验室中再现。在上面3种不同类方案中使用的培养基配方 由许多种在各个实验室和方案之间不一致的培养基成分、添加物、补充混合物 组成。培养基中各个成分以及其工作浓度的详细信息常常难以得到，特别是当 使用来自商业供应商的预混合补充物时。

甚至在最确定的条件下从多能干细胞衍生的培养物是内在异质性的，由不 同谱系的和处于不同发育阶段的细胞类型组成。异质性可以解释为当在一些方 案中操作细胞时所使用的时间点处，内在的细胞之间信号传导和变化。已经应 用于增加正在诱导的所希望细胞类型百分数的一种解决方法是除了使用类似形 态发生素的细胞因子或者生长因子添加到培养基中。这非常昂贵并且依赖于来 源而易变。

控制异质性的另一个通用方法是使用选择策略以得到所希望的细胞类型， 例如机械选择和使用某些培养基补充物和因子促进选择性存活。机械选择极其 冗长并且还几乎不能产生完全纯的所希望细胞类型的群体。使用某些补充物用 于诱导细胞类型(例如用于神经诱导的N2补充物)的主要缺点是，在真正祖细胞 被分离后的方案后期阶段干扰细胞存活(Dhara等，2008)。

许多方案的另一个缺点是得到纯的分化细胞群体所需要的时间，特别是当 方案是多步骤的并且包括如上所述的选择策略时。整个过程会占用数周时间。

衍生自人多能干细胞的分化的细胞类型是治疗方法例如细胞移植的目的。 当前研究目标集中于从人多能干细胞培养物和分化的谱系中去除动物来源的蛋 白质(Mallon等，2006)。在许多当前方案中，用于诱导胚层的所谓的饲养细胞 通常来源于小鼠组织。此外，EB特别是向中胚层的分化常常涉及在培养基中使 用胎牛血清，它是未表征的动物来源产品。

单层培养中细胞的平板接种密度在许多方案中常常没能很好地确定，并且 由于如上所述细胞内在信号传导而会影响所诱导的希望细胞类型的百分数。使 用基于EB形成的分化方案也可潜在地影响早期诱导事件，这涉及EB大小和形 状具有差异。

文献中有一些证据表明，培养基的重量克分子渗透压浓度影响细胞增殖、 存活和分化。例如，mTeSR^TM培养基的重量克分子渗透压浓度被调整成与在大 多数细胞培养基中使用的更标准的290-330mOsm/kg重量克分子渗透压浓度相 比而言更高的重量克分子渗透压浓度340mOsm/kg，以更好地维持人ES细胞 的未分化状态(Ludwig等，2006)。另一方面，分化的细胞类型，例如从CNS分 离的原代神经元与标准重量克分子渗透压浓度相比在具有低重量克分子渗透压 浓度(230-280mOsm/kg)的培养基中存活更佳(Brewer等，1993；Brewer和Price 1996；Kivell等，2000)。可用的信息表明，特定的重量克分子渗透压浓度或者 有效地用于维持细胞处于未分化状态、促进存活或者维持已经分化的细胞或者 成熟细胞处于分化状态。

在文献中还广泛讨论了用于多能干细胞分化的方案缺乏标准化(关于综述 见Sanchez-Pernaute和Sonntag，2006)。

人ES细胞能够如下在体外产生神经组织，或者

1.由鼠或人来源的某些胚胎成纤维细胞固有的活性指导。该活性被 称为基质来源诱导活性或SDIA(Perrier等，2004，Sonntag等，2007)；

2.作为像团块或者单细胞的单层在附着条件下和由于添加补充物例 如N2和B27(Nat等，2007)自发产生或者通过添加形态发生素指导 (Osafune等，2007)；

3.作为称作胚状体(EBs)的分化细胞聚集团块自发产生，据信这确实 存在，因为EB内部存在诱导因子，模拟在早期胚胎中发生的事件。这些 EBs包含所有三个胚层的细胞，包括外胚层谱系的神经元细胞(Odorico等， 2001，Zhang等，2001，Yan等，2005)。

到目前为止，诱导神经外胚层的三种上述方法均是效率差的并且导致产生 异质的细胞群体，这些细胞当中许多细胞是非神经系的。

然而，当人胚胎干细胞(hESC)暴露于类似形态发生素的视黄酸(Schuldiner 等，2001)、Fgf2(Zhang等，2001)、条件培养基(Schulz等，2003；Shin等，2006)、 骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂(Itsykson等，2005，Gerrard等，2005，Sonntag 等，2007)或SMAD信号抑制剂例如SB431542(Chambers等，2009；Kim等， 2010)时达到了更高效率的神经/神经元分化。

虽然这些方案增加了神经细胞的发生，但是这些方案中的大多数必须随后 从该混合物中选择神经细胞，以便从ES细胞的分化培养物得到相对纯的神经 元细胞群体。在体外，早期出现的神经祖细胞在形态上与其它细胞类型不同， 并且表征为形成放射状构造的柱状上皮细胞，称作“神经玫瑰花状结构”(Zhang 等，2001，2005；Elkabetz等，2008)。这些结构包含表达早期神经外胚层标志 物例如Pax6和Sox1的细胞，并且能够响应适当的发育指示分化成不同的区域 特异性神经元和神经胶质细胞类型(Yan等，2005，Perrier等，2004；Li等， 2005)。随着培养时间的推移，Pax6阳性细胞下调Pax6表达并维持Sox1表达。 然而，它们也开始表达巢蛋白(Nestin)。当将神经板阶段的神经前体与神经 管闭合后出现的神经前体比较时，在体内神经发育中观察到相似的蛋白质表达 谱(Jessell 2000)。当前，巢蛋白和Sox1蛋白质的共表达以及“神经玫瑰花状结 构”的形成被认为是检测神经祖细胞的可靠标准(Elkabetz等，2008；Elkabetz 和Studer 2009；Koch等，2009；Peh等，2009)。

无需任何额外选择过程而控制人多能细胞分化成纯的或者高度富集群体神 经祖细胞，并且随后这些细胞分化成中枢神经系统(CNS)的3种细胞类型：神 经元、星形细胞和少突胶质细胞，将是本领域非常希望的，因为所有这些细胞 群体将为CNS发育和疾病基础和应用研究提供现实优势。

总之，本领域缺乏标准培养基配方和方案以在短时间内诱导3个胚层并且 随后诱导从它们衍生的更佳特化的细胞类型。本领域还苦于缺乏易于在不同实 验室中再现的和技术员依赖性的标准化方案。

发明内容

本发明人已经通过开发允许以选择性和标准化方式得到期望的分化细胞类 型的培养基配方，克服了多能干细胞分化领域中的一些主要局限。本发明人已 经证明，通过处理培养基的重量克分子渗透压浓度可以偏向于从未分化多能干 细胞早期诱导3个胚层：中胚层，外胚层和内胚层。此类培养基可以提供无形 态发生素、无血清和无饲养细胞的系统，用于产生纯的胚层祖细胞群体。

因此，本公开提供产生胚层祖细胞群体的方法，包括在具有260至340 mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的培养基中培养干细胞以及使细胞分化成胚层 祖细胞。

在一个实施方案中，本公开提供产生胚层祖细胞群体的方法，包括：

(a)将多能干细胞解离成为团块或单细胞；

(b)将来自a)的解离的细胞在具有260至340mOsm/kg重量克分子渗透压 浓度的培养基中培养；和

(c)将b)的细胞解离，将细胞平板接种于包被的培养皿上，在培养基中培 养至少1天以产生胚层祖细胞。

在一个实施方案中，培养b)中的解离的细胞包括在微孔装置中培养来自a) 的解离细胞达大约24小时以形成聚集体，在微孔装置中在培养基中继续培养超 过24小时，然后将聚集体释放并附着于包被的培养皿上，在培养基中培养至少 1天。在一个实施方案中，在将聚集体释放和附着于包被培养皿上之前，在微 孔装置中培养最长达14天，可选5-6天。在一个实施方案中，聚集体在微孔装 置中培养最长达11天。

在另一个实施方案中，培养b)中的解离的细胞包括在微孔装置中在培养基 中培养来自a)的解离细胞大约24小时以形成聚集体，从微孔装置释放聚集体， 然后将所释放的聚集体在培养基中悬浮培养至少1天，将聚集体解离并附着于 包被的培养皿上并且在培养基中培养至少1天。在一个实施方案中，在将聚集 体解离并附着于包被的培养皿上之前，细胞悬浮培养最长达14天，可选5-6天。

在又一个实施方案中，培养b)中的解离的细胞包括将来自a)的解离的细胞 在培养基中悬浮培养至少1天，然后将细胞解离并附着于包被培养皿上，并且 在培养基中培养至少1天。在一个实施方案中，在解离和附着于包被的培养皿 上之前细胞悬浮培养最长达14天，可选5-6天。

在再一实施方案中，培养b)中的解离的细胞包括来自a)的解离的细胞附着 于包被的培养皿上并且在培养基中培养至少3天。在一个实施方案中，细胞在 包被的培养皿上于培养基中培养最长达14天，可选5-6天。在一个实施方案中， 附着的细胞在饲养细胞上培养。

在一个实施方案中，培养基包含Dulbecco极限必需培养基并且任选还包含 维生素、微量元素、硒、胰岛素、脂类、b-巯基乙醇、非必需氨基酸、抗生素、 bFGF、B27、N2或其混合物。在一个实施方案中，培养基包含如表2中所示成 分。

在一个实施方案中，干细胞是哺乳动物多能干细胞，任选人多能干细胞。 在另一实施方案中，多能干细胞是诱导性多能干细胞或胚胎干细胞。在又一个 实施方案中，胚层是外胚层的、内胚层的和/或中胚层的。

在一个实施方案中，聚集体或团包括胚状体。在一个实施方案中，胚状体 包含500至20,000个细胞。

在一个实施方案中，当解离的细胞首次在微孔装置中培养和/或悬浮培养 时，培养基是260至280mOsm/kg用于诱导外胚层祖细胞。在另一实施方案中， 当解离细胞直接平板接种于包被的培养皿上时，培养基的重量克分子渗透压浓 度是270至320m mOsm/kg用于诱导外胚层祖细胞。

本文还提供在具有260-340mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的培养基中维 持单个神经祖细胞的方法，包括根据在此所述的方法产生外胚层祖细胞；从培 养物解离外胚层祖细胞；将所述祖细胞平板接种于培养基中并培养至少1天。 在一个实施方案中，重量克分子渗透压浓度是大约270mOsm/kg。在另一实施 方案中，培养基包含bFGF。在又一个实施方案中，祖细胞平板接种并培养至少 4天。在再一实施方案中，外胚层祖细胞进一步分化形成神经元、少突胶质细 胞或星形细胞。

在另一实施方案中当解离的细胞首次在微孔装置中培养和/或悬浮培养时， 培养基的重量克分子渗透压浓度高于280mOsm/kg，任选290-340mOsm/kg， 以用于诱导内胚层的和/或中胚层祖细胞。在另一实施方案中，当解离细胞直接 平板接种于包被的培养皿上时，培养基的重量克分子渗透压浓度高于320 mOsm/kg，任选320至340mOsm/kg，以用于诱导内胚层和/或中胚层祖细胞。

在此还提供在具有290-340重量克分子渗透压浓度的培养基中维持单个中 胚层和/或内胚层祖细胞的方法，包括根据在此所述方法产生中胚层和/或内胚层 祖细胞；从附着的培养物解离中胚层和/或内胚层祖细胞；以及平板接种并培养 所述祖细胞。在一个实施方案中，中胚层和内胚层祖细胞进一步分化形成间充 质干细胞、软骨细胞、心肌细胞、造血干细胞、骨骼肌细胞、胰腺细胞或肝脏 细胞。

在此还提供用于诱导胚层分化的培养基成分，和用于可调节细胞分化的试 剂的或者用于一级或二级筛选通过在此所述方法产生的细胞的筛选实验。

根据下列详细说明，本公开的其它特征和优点将变得显而易见。然而，应 当理解，详细说明和特定实施例表明了本公开的优选实施方案，仅以例证方式 给出，因为根据该详细说明，处于本公开精神和范围内的多种改变和修饰对本 领域技术人员而言将变得显而易见。

附图说明

现关于附图说明本发明：

图1显示在BD Matrigel^TM(H9p51)上培养第5天的人胚胎干细胞。放大倍 数：2×(左)，10×(右)。

图2显示在小鼠成纤维细胞(MEF)上培养第4天的人胚胎干细胞。放大倍 数：2×。

图3显示未分化的多能人ESCs(左侧)和显示出分化征兆的培养物(右侧)的 形态。上：放大倍数2×，下：10×。

图4显示AggreWell中的EB形成：单细胞悬液分布在AggreWell^TM400板 的单个孔中。每一微孔具有2000个细胞。放大倍数：2×(左)和10×(右)。

图5显示在悬浮培养1天后刮下的EB。放大倍数：2×(左)和10×(右)。

图6显示在AggreWell^TM400板中孵育24小时后的EB。通过在 AggreWell^TM400板中强力聚集形成的EB应用在细胞滤网上以去除单细胞。2 ×、10×和40×放大倍数。

图7显示在附着培养条件中在第5天从人胚胎干细胞诱导的神经玫瑰花状 结构。所使用的培养基是mTeSR1-F 270mOsm/kg+1×B27/N2A(上行)和 mTeSR1-F320mOsm/kg+1×B27/N2A(下行)。箭头指向玫瑰花状结构。左列： 放大倍数2×，右列：放大倍数10×。

图8显示在AggreWell^TM400中，在基于EB的条件下，在3种不同培养基 中诱导的神经玫瑰花状结构。上行：mTeSR1-F 260mOsm/kg；中行： mTeSR1-F 270mOsm/kg；下行：mTeSR1-F280mOsm/kg。箭头指向玫瑰花 状结构。左列：放大倍数2×，右列：放大倍数10×。

图9显示在mTeSR1-F 260mOsm/kg(33.3％)；mTeSR1-F 270mOsm/kg (40.6％)或mTeSR1-F 280mOsm/kg(30％)中诱导和培养EB的实验的平均玫瑰 花状结构计数。

图10显示在mTeSR1-F270mOsm/kg(上行，左边2个图)；mTeSR1-F 290mOsm/kg(上行，右边2个图)；mTeSR1-F320mOsm/kg(下行，左边2个 图)或mTeSR1-F340mOsm/kg(下行，右边2个图)中悬浮培养5天后的附着 EBs的形态。放大倍数：2×(每一条件中的左边图)和10×(每一条件中的右边 图)。

图11显示3天后的附着EB。对巢蛋白(左列)和Sox1(右列)进行免疫细胞 化学染色。将存在Sox1表达的图像区域划界(白色线)。在mTeSR1-F 270 mOsm/kg(上行)或mTeSR1-F 340mOsm/kg(下行)中形成EBs。与在 mTeSR1-F340mOsm/kg中诱导的细胞相比，在mTeSR1-F 270mOsm/kg中 诱导的细胞中，表达Sox1的细胞的区域明显更大。放大倍数20×。

图12显示在mTeSR1-F 320mOsm/kg(13％)或mTeSR1-F 340mOsm/kg (7.9％)中诱导和培养EBs的各个实验的平均玫瑰花状结构计数。

图13显示在使用1×PBS(无Ca，Mg)，pH 7.4的选择性神经祖细胞解离 过程中细胞形态学图片。上行，左图：解离前的玫瑰花状结构集落。上行，中 图：解离过程中(20分钟)，上行，右图：解离过程中(40分钟)。下行，左图： 解离过程中(60分钟)，下行，中图：解离后(当神经祖细胞通过研磨被剥离时(90 分钟)，下行，右图：研磨后仍然留在培养皿上的细胞。放大倍数：除了下行左 图和中图之外均为：10×；下行左图和中图：2×。

图14显示以1×PBS(无Ca，Mg)，pH 7.4选择性解离后，平板接种第3 天(上行)，第6天(中行)和第12天(下行)的神经祖细胞。左列：mTeSR1-F 270 mOsm/kg和右列：mTeSR1-F340mOsm/kg。放大倍数：左：4×，右：10×。

图15显示在以PBS选择性解离后6天的神经祖细胞。将细胞平板接种并 使用巢蛋白抗体和Sox1抗体(右列)开展免疫细胞化学分析。左列表示使用 DAPI作为细胞核复染的相同细胞。细胞最初在mTeSR1-F 270mOsm/kg(上行) 或mTeSR1-F340mOsm/kg(下行)中诱导和生长。明显地，在于mTeSR1-F 340mOsm/kg中得到的神经祖细胞中，较少的细胞被两种抗体染色。放大倍数 20×。

图16显示在选择后2天，从在mTeSR1-F 270mOsm/kg中形成、生长和 附着的EBs人工选择的玫瑰花状结构集落。放大倍数10×。

图17显示神经祖细胞传代，图片于附着后2天(左)或者附着后5天(右)拍 摄。放大倍数10×。

图18显示使用抗TUJ1抗体染色的来源于在mTeSR1-F 270mOsm/kg(左) 中但不在mTeSR1-F340mOsm/kg(右)培养的神经祖细胞的神经元。TUJ1和 Sox1抗体染色用单独的箭头显示。Sox1在神经元中不表达。放大倍数20×。

图19显示(A)在BD Matrigel^TM上培养的在第39次传代5天时的人胚胎干 细胞系H1和(B)在第33次传代5天时的人诱导性多能干细胞系4D1。放大倍数： 2×(A，B)和10×(C)。

图20显示作为单细胞悬液传代后培养第5天大约70％汇合时的人胚胎干细 胞系集落(H9)(A，B)和H9以2×10⁴每cm²的密度重新平板接种一天后的集 落(C)。放大倍数2×(A)，10×(B和C)。

图21显示收集24小时后和收集前(A和B)AggreWell^TM800板的微孔内， 从4D1多能干细胞产生的EBs。在悬浮培养2天(C)和4天(D和E)后从 AggreWell^TM800收集的EBs。放大倍数：4×(A)，10×(B，E)，2×(C，D)。

图22显示从附着至聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白板第3天的EB中观察到的神 经玫瑰花状结构的代表性图像(A-D)。此处所示的每EB～2000个细胞的附着 EBs是从人诱导性干细胞系4D1使用AggreWell^TM800先前产生的。放大倍数： 2×(A)，10×(B-D)。

图23显示在从细胞系4D1(A-D)和H9(E-H)产生的附着至聚-L-鸟氨酸/ 层粘连蛋白平板的EB中观察到的神经玫瑰花状结构(少数实例用箭头标示)。包 含2000个细胞每EB(A-D)和5000个细胞每EB(E-H)的附着EB在mTeSR1-F 270mOsm/kg(A，B，E，F)或mTeSR1-F 340mOsm/kg(C，D，G，H)中培养。评分结 果还表示为相应图像内的％。放大倍数2×(A，C，E，G)，10×(B，D，F，H)。

图24显示从H9人胚胎干细胞先前产生的不同大小的EBs平板接种后1天 的附着EBs。不同大小的EBs如下：500个细胞每EB(A和B)，1000个细胞每 EB(C和D)和2000个细胞每EB(E和F)。放大倍数2×左列(A，C和E)，10 ×右列(B，D和F)。

图25显示EBs从微孔装置收集并平板接种于聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被 平板上第2天时的形态。评分结果表示为相应图像内的％。在mTeSR1-F 270 mOsm/kg(A，B和C)中产生的EBs和在mTeSR1-F 340mOsm/kg(D，E和F) 中产生的EBs。测试的EBs大小为2000个细胞每EB(C和F)和500个细胞每 EB(A，B，D和E)的EB。放大倍数：2×(A，C，D，F)和10×(B，E)。

图26显示收集和平板接种EBs前第5天AggreWell^TM800微孔内不同大小 的EBs。显示了下列EB大小：2000个细胞每EB大小的EBs(A和B)，5000个 细胞每EB大小的EBs(C和D)，10000个细胞每EB大小的EBs(E和F)，15000 个细胞每EB大小的EBs(G)和20000个细胞每EB大小的EBs(H)。放大倍数： 4×(A，C，E，H)，10×(B，D，F，G)；

图27显示从微孔装置收集的和平板接种于聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白平板上 1天后的不同大小的EBs：显示了下列EB大小：2000个细胞每EB大小的EB s(A，B)，5000个细胞每EB(C，D)，10000个细胞每EB(E，F)，15000个细胞每 EB(G，H)和20000个细胞每EB(I，J)。放大倍数：2×(A，C，E，G，I)和10×(B，D，F，H，J)。

图28显示在mTeSR1-F 270mOsm/kg(A-D)和mTeSR1-F 340mOsm/kg (E-H)中产生和平板接种于聚-D-鸟氨酸/层粘连蛋白第2天的EBs的形态。显示 了下列EB大小：2000个细胞每EB大小的EB(A，B，E，F)和5000个细胞每EB 大小的EB(C，D，G，H)。放大倍数：2×(A，C，E，G)和10×(B，D，F，H)。

图29显示在具有不同重量克分子渗透压浓度培养基中产生，之后平板接种 于相同培养基中的聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被平板上2天后的EBs附着。在 mTeSR1-F 270mOsm/kg(A，B)，mTeSR1-F 320mOsm/kg(C，D)，mTeSR1-F 340mOsm/kg(E，F)，mTeSR1-F 400mOsm/kg(G，H)和mTeSR1-F 450 mOsm/kg(I，J)中先前产生的附着的EBs。放大倍数：左2×(A，C，E，G，I)和10× (B，D，F，H，J)。

图30显示对于在具有不同重量克分子渗透压浓度(mTeSR1-F 270 mOsm/kg；mTeSR1-F 320mOsm/kg，mTeSR1-F340mOsm/kg和 mTeSR1-F 400mOsm/kg)的培养基中产生的附着的EBs 2天后的评分结果。在 第1天视觉检查包含mTeSR1-F 450mOsm/kg的培养基中玫瑰花状结构的存 在。

图31显示附着后3天的EBs。EB是从已经在mTeSR1-F 270mOsm/kg(A) 或mTeSR1-F 340mOsm/kg(B)中作为单细胞悬液传代4次(p51-p55)的人胚胎 干细胞系H9先前产生的。放大倍数2×。

图32显示在EB形成前第52次传代5天时的H9细胞(A-D)。圈内区域表 示低放大倍数(A，C)下集落的分化的区域和在高放大倍数下的同一区域(B，D)。 在此处显示在mTeSR1-F 270mOsm/kg中先前形成的，附着于聚-L-鸟氨酸/ 层粘连蛋白包被平板上2天后的EBs(E，F)。评分结果表示为相应图像内的％。 在此处显示在mTeSR1-F 340mOsm/kg中先前形成的，附着于聚-D-鸟氨酸/ 层粘连蛋白包被平板上2天后的EBs(G，H)。放大倍数：2×(A，C，E，G)和10× (B，D，F，H)。

图33显示在平板接种后1天，从hESC系H7p38产生的附着的EBs。包 含5000个细胞每EB的EBs在mTeSR1-F 270mOsm/kg(A，B)或mTeSR1-F 340mOsm/kg(C，D)中产生。放大倍数2×(A，C，D)，10×(B)。

图34显示在平板接种后2天，从hESC系H9p44产生的附着的EBs。包 含2000个细胞每EB的EBs在Knockout^TM-D-MEM 270mOsm/kg(A，B)或 Knockout^TM-D-MEM 340mOsm/kg(C，D)中产生。评分结果表示为相应图像内 的“％”。放大倍数2×(A，C)，10×(B，D)。

图35显示在即将释放和平板接种EBs之前，在AggreWell^TM400微孔内第 5天的从hESC系H9p44产生的具有2000个细胞每EB大小的EBs(A，D)。B， C，E，F显示平板接种2天后的附着EB。EB在Neurobasal^TM270mOsm/kg(A， B，C)或Neurobasal^TM 340mOsm/kg(D，E，F)中产生。评分结果表示为相应图 像内的“％”。放大倍数2×(B，E)，4×(A，D)和10×(C，F)。

图36显示平板接种后3天，分别从hESC系H9p41，p45和p44产生的包 含500(A，B，E，F)，2000(C，D)和5000个细胞每EB(G，H)的附着EBs。 EBs在mTeSR1-F 270mOsm/kg(BSA批次2)(C，G)，mTeSR1-F 270 mOsm/kg(BSA批次3)(A，B)，mTeSR1-F 340mOsm/kg(BSA批次2)(D， H)或mTeSR1-F 340mOsm/kg(BSA批次3)(E，F)中产生。评分结果表示为 相应图像内的“％”。放大倍数2×。

图37显示平板接种后2天，从hESC系H9p44和p53产生的，包含2000(A， B)，5000(C，D)和10000个细胞每EB(E，F)的附着EBs。G，H显示从hESC 系H1p59产生的每一个包含2000个细胞的附着EBs。所有EB均在mTeSR1-F 270mOsm/kg(BSA批次2)中产生。放大倍数2×(A，C，E，G)，10×(B，D， F，H)。

图38显示平板接种后2天，从hESC系H9p52产生的附着EBs。包含2000 个细胞每EB的EBs在mTeSR1-F 270mOsm/kg(A，B)或mTeSR1-F 340 mOsm/kg(C，D)中产生。评分结果表示为相应图像内的“％”。放大倍数2×(A， C)，10×(B，D)。

图39显示平板接种后2天，从hESC系H9p64产生的附着EBs。包含2000 个细胞每EB的EBs使用AggreWell^TM400(A-D)或AggreWell^TM800(E-H)在 mTeSR1-F 270mOsm/kg(BSA lot 2)(A，B，E，F)或mTeSR1-F 340mOsm/kg (C，D，G，H)中产生。评分结果表示为相应图像内的“％”。放大倍数2×(A， C，E，G)，10×(B，D，F，H)。

图40显示平板接种后2天，从hESC系H9p52产生的包含2000个细胞每 EB的附着EBs。EB在TeSR^TM2-F 270mOsm/kg(包含HSA)(A，B)或TeSR^TM2-F 340mOsm/kg(包含HSA)(C，D)中产生。评分结果表示为相应图像内的“％”。 放大倍数2×(A，C)，10×(B，D)。

图41显示在悬浮培养(ULA皿)然后平板接种于包被平皿上6天后，从hESC 系H9p52产生的附着EBs。EBs在mTeSR1-F 270mOsm/kg(A)，补充有20 ng/mL bFGF的mTeSR1-F 270mOsm/kg(B)或补充有20ng/mL bFGF、1％B27 和1％N2A的mTeSR1-F 270mOsm/kg(C)中产生。D-F显示平板接种后4天 的附着EB。这些EBs在平板接种于补充有1％N2A的mTeSR1-F 270 mOsm/kg(D)，补充有100ng/mL FGF8和200ng/mL SHH的mTeSR1-F 270 mOsm/kg(E)或补充有1％B27的mTeSR1-F 270mOsm/kg(F)之前在 AggreWell^TM800平板上培养5天。放大倍数2×(A，B，C，D，F)，10×(E)。

图42显示平板接种后不同天数的，从hESC系H9p36和p42产生的附着 EB。包含2000个细胞每EB的EBs在mTeSR1-F 270mOsm/kg中产生。在(A) 中所示的EBs在EB形成后第1天时平板接种并且在平板接种后第3天时显示 (总共培养4天)。在(B)中所示的EBs在EB形成后第1天时平板接种并且在平 板接种后第5天时显示(总共培养6天)。在(C)中所示的EBs在EB形成后第2 天时平板接种并且在平板接种后第1天时显示(总共培养3天)。在(D)中所示的 EBs在EB形成后第2天时平板接种并且在平板接种后第5天时显示(总共培养 7天)。在(E，F)中所示的EBs在EB形成后第3天时平板接种并且在平板接种 后第3天时显示(总共培养6天)。在(G)中所示的EBs在EB形成后第4天时平 板接种并且在平板接种后第2天时显示(总共培养6天)。在(H)中所示的EBs在 EB形成后第5天时平板接种并且在平板接种后第2天时显示(总共培养7天)。 (I)显示用针对神经标志物Sox1的抗体染色的在平板接种第1天的附着EBs的 FACS图(0.77％的阳性细胞)。(J)显示在平板接种第5天的EB的Sox1阳性细胞 的FACS图(35.21％的阳性细胞；二者(I和J)中的左图表示对活细胞的门控 (gating))。放大倍数2×(A-E，G，H)，10×(F)。

图43显示在平板接种后不同天数时，从hESC系H9p36和p42产生的附 着EBs。包含2000个细胞每EB的EBs在mTeSR1-F 270mOsm/kg中产生。 在(A，B)中所示的EBs在EB形成后第7天时平板接种并且在平板接种后第2 天时显示(总共培养9天)。在(C，D)中所示的EBs在EB形成后第8天时平板 接种并且在平板接种后第2天时显示(总共培养10天)。在(E，F)中所示的EBs 在EB形成后第11天时平板接种并且在平板接种后第2天时显示(总共培养13 天)。在(G，H，I)中所示的EBs在EB形成后第11天时平板接种并且在平板接 种后第5天时显示(总共培养16天)。(G)中的圈标记玫瑰花状结构，(H)中的细 箭头标记神经祖细胞并且(I)中的粗箭头标记成熟的神经元。放大倍数2×(A，C， E)，10×(B，D，F，G，H，I)。

图44显示平板接种于不同表面上之后3天的从hESC系H9p38产生的附 着EBs。包含2000个细胞每EB的EBs在mTeSR1-F 270mOsm/kg中产生。 (A)显示平板接种于以聚-L-鸟氨酸和1μg/mL层粘连蛋白包被的平皿上的EBs。 (B)显示平板接种于以聚-L-鸟氨酸和10μg/mL层粘连蛋白包被的平皿上的 EBs。(C)显示平板接种于以聚-L-鸟氨酸和20μg/mL层粘连蛋白包被的平皿上 的EBs。放大倍数2×。

图45显示在超低附着(ULA)碟形板中悬浮培养5天之后第1天的神经球。 神经球从最初在具有270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的单独的 mTeSR1-F(A)或者补充有1％B27的具有270mOsm/kg重量克分子渗透压浓 度的mTeSR1-F(B)或者补充有1％N2A的具有270mOsm/kg重量克分子渗透 压浓度的mTeSR1-F(C)中形成的附着EBs中产生。箭头指向来自附着神经球 的生长出来的神经元以及延伸的轴突。

图46显示平板接种后第6天附着的EBs。EBs在具有260mOsm/kg重量克 分子渗透压浓度的mTeSR1-F(A-C)或具有270mOsm/kg重量克分子渗透压浓 度的mTeSR1-F(D-F)中形成并且在AggreWell^TM800内培养13天。A-F中神 经玫瑰花状结构用粗箭头指示并且神经元用细箭头指示。放大倍数10×(A，B， C，E，F)，4×(D)。

图47显示平板接种后4天，从hESC系H9p47产生的附着EBs。hESC或 者培养于hESC维持培养基中直至EB形成(A)或者在mTeSR1-F 320mOsm/kg 中预调整24小时(B)。然后，EBs在mTeSR1-F 270mOsm/kg中产生并悬浮培 养5天(ULA平皿)，之后允许它们附着。评分结果表示为相应图像内的“％”。 放大倍数2×。

图48显示神经祖细胞(NPC)，其从通过不同方法解离的附着EBs得到。 EB已经在AggreWell^TM400和具有270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的 mTeSR1-F中从hESCs系H9p47先前产生。在EBs平板接种之前，它们被悬 浮培养(ULA平皿)5天。(A)中所示的NPC使用基于无酶PBS的细胞解离缓冲 液、0.02％EDTA溶液(B)，1mg/mL分散酶(C)、Accutase^TM(D)、Neurocult化 学解离试剂盒(小鼠)(E)或者0.05％胰蛋白酶-EDTA(F)从附着的EBs衍生。放 大倍数10×。

图49显示从附着EBs得到的神经祖细胞(NPC)，所述的附着EBs使用不 同解离方法在平板接种后3天时解离，所述神经祖细胞使用免疫细胞化学(ICC) 对NPC标志物Sox1(对细胞的细胞核染色)和巢蛋白(对细胞的细胞质染色；(C) 中的箭头)染色。(A)中的NPCs来源于使用Accutase^TM解离的附着EBs。(B)中 所示的NPCs来源于使用HBSS解离的附着EBs。(C)中所示的NPCs来源于使 用无Ca++和Mg++的D-PBS解离的EBs。放大倍数20×。

图50显示在平板接种后不同天数的从hESC系H7和H9(分别第38或35、 36、41、45代)产生的包含2000、5000和10000个细胞/EB的附着EBs。EBs 还在不同时间点从AggreWell^TM800平板释放。在(A，B)中所示的附着EB(在最 初形成时为5000个细胞/EB)被释放并且在第5天时平板接种，并且图片是平板 接种后第7天时的典型细胞形态。在(C，D)中所示的附着EBs(在最初形成时为 10000个细胞/EB)被释放并在第5天时平板接种，并且图片是平板接种后第7 天时的典型细胞形态。在(E，F)中所示的附着EBs(在最初形成时为2000个细胞 /EB)被释放并在第11天时平板接种，并且图片是平板接种后第5天时的典型细 胞形态。(G，H)中所示的附着EB(在最初形成时为10000个细胞/EB)被释放并 且在第6天时平板接种，并且图片是平板接种后第8天时的典型细胞形态。放 大倍数2×(A，C，E，G)，10×(B，D，F，H)。

图51显示来自解离的附着EBs(在图50中说明)的平板接种后5(A，B)或6 天(C-I)的NPC。EBs在不同天数时从AggreWell^TM800平板先前释放。(A，B) 中所示的NPCs在EBs(2000个细胞/EB)附着后第5天时解离，所述EBs在第8 天从AggreWell^TM800释放。在(C)中所示的NPCs在EBs(10000个细胞/EB)附着 后第8天时解离，所述EBs在第6天从AggreWell^TM800释放。(D，E，F)中所 示NPCs在EBs(5000个细胞/EB)附着后第7天时解离，所述EBs在第5天时从 AggreWell^TM800释放。(G，H)中所示的NPCs在EBs(10000个细胞/EB)附着后 第7天时解离，所述EBs在第5天时从AggreWell^TM800释放。(I)中所示的NPCs 在EBs(5000个细胞/EB)附着后第6天时解离，所述EBs在第5天时从 AggreWell^TM800释放。放大倍数20×(A，D，G)，40×(B，C，E，F，H，I)。

图52显示从解离的附着的EBs分离并平板接种(在图50中说明)后4天的 NPCs。EBs在不同天数时从AggreWell^TM800平板释放。在(A)中所示的NPCs 在EBs(2000个细胞/EB)附着后第11天时分离，所述EBs在第7天时从 AggreWell^TM800释放。(B)显示相同NPCs对神经元标志物PSA-NCAM的免疫 细胞化学(ICC)染色(箭头指向玫瑰花状结构的阳性染色的腔)。(C)显示相同 NPCs对于神经元玫瑰花状结构标志物ZO-1的ICC染色，特异性地对玫瑰花状 结构的腔染色(箭头)。(D)中所示的NPCs在EBs(2000个细胞/EB)附着后第9天 时分离，所述的EBs在第9天时从AggreWell^TM800释放。(E)显示相同NPCs 对于神经元标志物Sox1的ICC染色(圈表示存在的一些玫瑰花状结构)。(F)显 示相同NPCs对于神经元标志物巢蛋白的ICC染色(如在此处通过箭头所标记， 巢蛋白染色细胞质，所有细胞均为阳性)。(G)中所示的NPCs在EBs(2000个细 胞/EB)附着后第7天时分离，所述EBs在第11天时从AggreWell^TM800释放。 (H)显示相同NPCs对于神经元标志物巢蛋白的ICC染色(所有细胞均为阳性)。 所有染色的细胞使用DAPI复染成蓝色。放大倍数10×(A、D、G)，20×(B、C、 E、F、H)。

图53显示了图表，其总结来自图50-52的结果，包括在第2代结束时NPCs 的年龄和NPCs的来源列表：1.EBs从它们的微孔释放的日期，2.NPCs从附着 EBs(示于图50中)分离的日期，3.附着EBs(示于图50中)解离时的总天数，4.每 一EB的细胞数，和5.取得NPCs(示于图51或52中)全部照片的日期，其等于 培养的天数。

图54显示从hESC系H9p65产生的附着的EBs和分离的NPCs。EBs在 AggreWell^TM800平板中以2000个细胞每EB的大小形成。EBs在平板中培养 12天直到它们被释放。(A-D)显示平板接种后第4天时附着的EBs。(E-H)显示 从附着的EB分离后并且平板接种于1、5、10和20μg/ml层粘连蛋白上3天 后的NPCs(分别为E-H)。(I-L)显示平板接种后7天的相同的NPCs。放大倍数 10×。

图55显示在图54中所示的NPCs，其在当平板接种于10μg/ml层粘连蛋 白或者20μg/ml层粘连蛋白上时的第3天，以及在当平板接种于1μg/ml层粘 连蛋白或5μg/ml层粘连蛋白上时的第7天用抗TUJ-1的抗体染色(神经元可以 通过它们明亮的外观和它们所延伸出的轴突鉴定)。使用DAPI将细胞复染成蓝 色。放大倍数20×。

图56显示从hESC系H9产生的附着EBs和分离的NPCs。EBs在 AggreWell^TM800中产生并且在第11天时释放并平板接种。在附着后第11天时 对附着EBs照相(A、B、D、E)。NPCs衍生自这些附着的EBs并且在平板接种 后第3天时显示(C、F)。mTeSR1-F 270mOsm/kg(A-C)或mTeSR1-F 340 mOsm/kg(D-F)用于EBs形成，附着EBs的培养和随后的NPCs培养。放大倍 数2×(A、B、D、E)，10×(C、F)。

图57显示用抗神经标志物巢蛋白、神经元标志物TUJ1(A、B)和神经标志 物Sox1(C)的抗体染色的图56中所示的NPCs。(A)和(B)中的箭头标记巢蛋白阳 性细胞的高密度区域(在(B)中较少)。许多细胞表达Sox1。放大倍数20×。

图58显示来源于hESC系H9p36和p41的NPCs。EBs在AggreWell^TM800 中以不同大小形成(2000、5000和10000个细胞/EB)并且在第5或7天时释放。 NPCs在第11天(对于2000个细胞/EB)或者第7天(5000和10000个细胞/EB) 时从附着的EB分离。(A)显示NPC从先前在AggreWell中培养7天的EBs(2000 个细胞/EB)分离，作为附着的EB培养物生长11天，并且然后在培养第4天时 用HBSS处理。(B)显示在第7天时使用HBSS从附着的EBs分离第6天的NPCs； 这些EBs(10000个细胞/EB)在AggreWell中先前培养5天。C)显示在使用HBSS 从(A)解离后，培养第3天时第2代的NPCs。这些NPCs平板接种于聚-L-鸟氨 酸/层粘连蛋白包被的平皿上。(D)显示在使用TryplE从(B)解离细胞后，培养第 1天时第二代的NPCs。这些NPCs平板接种于matrigel包被的平皿上。E)显示 在使用胰蛋白酶从(C)解离细胞后，培养第3天第3代的NPCs。这些NPCs平 板接种于聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的平皿上。(F)显示在使用TryplE从(D) 解离细胞后，培养第4天时第3代的NPCs。这些NPCs平板接种于聚-L-鸟氨 酸/层粘连蛋白包被的平皿上。放大倍数10×。

图59总结图58中所述结果。(A)显示用脑神经标志物musashi和用玫瑰花 状结构标志物ZO-1染色的第1代在第5天的NPCs(所有细胞为musashi阳性的， ZO-1对突出的玫瑰花状结构的腔染色)。(B)显示针对神经元标志物TUJ-1染色 的第一代在第6天(p1d6)的NPCs(箭头标记着一些轴突结构)。放大倍数20×。

图60显示针对神经标志物Pax6(A，E)和Sox1(B，F)染色的附着EBs。(C， G)表示两个标志物的重叠并且(D，H)显示细胞的DAPI复染。包含500个细胞 /EB的EBs在AggreWell^TM400中从hESC系H9p63形成并且在5天后释放并 平板接种。诱导培养基mTeSR1-F 270mOsm/kg用于培养(A-D)中所示附着 EBs，而mTeSR1-F340mOsm/kg用于培养(D-H)中所示的附着EBs。从(A、C 和D)与(E、G和H)相比中可以看出，来源于在mTeSR1-F 270mOsm/kg中形 成并培养的EBs的细胞表达更多的神经标志物Pax6和Sox1。放大倍数10×。

图61显示来自不同实验的和在平板接种后不同天时针对神经标志物Pax6 和Sox1(A)，Sox1和巢蛋白(B)以及Sox1和巢蛋白(C)共染色的附着EBs，以证 明神经祖细胞的丰度。所有细胞分别共表达所有3种标志物组合。放大倍数10 ×。

图62显示来自不同实验的和在平板接种后不同天时针对神经标志物Pax6 和玫瑰花状结构标志物ZO-1(A)，神经标志物Sox1和玫瑰花状结构标志物ZO-1 (B)以及放射状神经胶质标志物BLBP和神经标志物巢蛋白(C，D)共染色的附着 EBs。(A)和(B)中的所有细胞双阳性并且(C)和(D)中的玫瑰花状结构是巢蛋白和 BLBP双阳性的，在照片上显得明亮。放大倍数10×(A、B)，20×(C、D)。

图63显示平板接种后2天的附着EBs。EBs在mTeSR1-F 270mOsm/kg(A) 或mTeSR1-F 340mOsm/kg(B，C)中从hESC系H9p51产生。(A)中的窄箭头 指向神经玫瑰花状结构。(B和C)中的宽箭头指向附着EBs周围的扁平细胞。 注意在这些例子中不存在神经玫瑰花状结构。放大倍数10×。

图64显示表示在第2天(在图63中说明)从附着EB是分离的神经玫瑰花状 结构细胞和非神经“扁平”细胞中，巢蛋白(深灰色)和Sox1(浅灰色)转录物表 达的qPCR结果(相对定量(RQ值))的图表，所述附着EBs分别在mTeSR1-F 270mOsm/kg或mTeSR1-F340mOsm/kg从H9p52hEScs先前产生。

图65显示在第1代第8天的NPCs(H9；p36细胞)(p1d8)(A)、p2d2(B)和 p3d3(C)。NPC来源于平板接种后第5天时的附着EBs(在第5天时从AggreWell 释放)。在第1代和第2代观察到大部分的NPC，而在第3代时自发出现神经元 亚群体。(D)显示p1中针对神经标志物巢蛋白和神经元标志物TUJ-1染色的细 胞。(E)显示p3中针对神经标志物巢蛋白和神经元标志物TUJ-1染色的细胞。 箭头指向从神经元延伸出的轴突。在(E)中出现的神经元比(D)中更多。放大倍 数10×。

图66显示针对泛神经元标志物TUJ-1(标记为短的粗箭头)(A)和GABA能 神经元标志物GABA(箭头)(B)被共染色的来源于NPCs的自发分化的神经元。 (C)显示TUJ-1和GABA染色的重叠并且显示并非全部神经元是GABA能神经 元。(B)和(C)中的箭头标记阳性GABA能神经元。(D)GFAP阳性细胞(粗箭头)， 表明在自发分化的NPCs中还鉴定出星形细胞的存在。对TUJ-1阳性染色的神 经元没有与GFAP共染色(细箭头)。放大倍数40×。

图67显示来自hESC系H9第55代作为单细胞悬液传代4次的神经诱导。 在mTeSR1-F 270mOsm/kg(A，D)，补充有1％N2A、1％B27的mTeSR1-F 270mOsm/kg(B，E)或补充有2％的B27mTeSR1-F 270mOsm/kg中在matrigel 上神经外胚层诱导后7天的附着NPC培养物。放大倍数2×(A-C)，10×(D-F)。

具体实施方式

本发明的方法

诱导胚层祖细胞

本发明人已经开发了通过在具有控制的重量克分子渗透压浓度的培养基中 培养干细胞而诱导胚层祖细胞的方法。

因此，本公开提供了产生胚层祖细胞群体的方法，包括在具有低于340 mOsm/kg，任选在240-340mOsm/kg或260-340mOsm/kg范围内重量克分子渗 透压浓度的培养基中培养干细胞，以及允许细胞分化成胚层祖细胞。

在一个实施方案中，本公开提供了产生胚层祖细胞群体的方法，包括：

(a)将多能干细胞解离成为团或单细胞；

(b)将来自a)的解离的细胞在具有260至340mOsm/kg重量克分子渗透压 浓度的培养基中培养；以及

(c)将b)的细胞解离，将细胞平板接种于包被的培养皿上，并在培养基中 培养至少1天以产生胚层祖细胞。

在一个实施方案中，在b)中培养解离细胞包括在微孔装置中培养来自a)的 解离细胞大约24小时以形成聚集体，并且在微孔装置中在培养基中继续培养超 过24小时，然后将聚集体释放并附着于包被的培养皿上，并且在培养基中培养 至少1天。聚集体在释放和附着于包被培养皿上之前可选地在微孔装置内培养 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天。

在另一个实施方案中，在b)中培养解离细胞包括在微孔装置中在培养基中 培养来自a)的解离细胞大约24小时以形成聚集体，从微孔装置释放聚集体，然 后将所释放的聚集体在培养基中悬浮培养至少1天，将聚集体解离并附着于包 被的培养皿上并且在培养基中培养至少1天。聚集体在释放和附着于包被培养 皿上之前可选地悬浮培养2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更 多天。

在又一个实施方案中，在b)中培养解离细胞包括将来自a)的解离的细胞 在培养基中悬浮培养至少1天，然后将细胞解离并附着于包被培养皿上，并且 在培养基中培养至少1天。在该方法中，EBs通过刮取方法从干细胞产生，并 且在培养基中培养至少1天。聚集体在解离和附着于包被培养皿上之前可选地 悬浮培养2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天。

在再一实施方案中，在b)中培养解离细胞包括将来自a)的解离的细胞附着 于包被的培养皿上或者饲养细胞上并且在培养基中培养至少3天。细胞任选贴 壁培养3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天。

术语“重量克分子渗透压浓度”如在此使用指根据每千克溶剂中溶质的渗 透压摩尔的溶液浓度。每千克溶剂中溶质的渗透压摩尔与每kg中颗粒数目等 效。在这种情况下，每kg溶剂中的离子浓度(源于盐：NaCl＝2)是涉及分子/kg 的重量摩尔浓度(mol/kg)的两倍。本领域技术人员将能够容易地确定为得到特定 重量克分子渗透压浓度的培养基所需要盐的量。此种确定的一个实例可以在实 施例5中找到。

干细胞培养基是本领域已知的。在一个实施方案中，培养基是无血清的。 在另一个实施方案中，培养基包含Dulbecco’s基本成分培养基。培养基可进一 步包含维生素、微量元素、硒、胰岛素、脂类、β-巯基乙醇、非必需氨基酸、 抗生素、bFGF、B27、N2或其混合物。典型培养基的实例包括mTeSR1-F、 Knockout^TM D-MEM，Neurobasal^TM培养基和TeSR^TM2。某些成分也可用于培养 基将干细胞分化，例如B27、bFGF和N2通常用于外胚层诱导。这些成分的组 合还可以用于中胚层和内胚层诱导。在一个实施方案中，在此所述的培养基包 括包含表2所示成分的多能性或无因子培养基，并且如在此所述通过加入盐将 重量克分子渗透压浓度调整至希望的水平。

术语“干细胞”如在此使用指具有自我更新能力的细胞。在一个实施方案 中，干细胞是多能干细胞。术语“多能性”如在此所使用指保持分化成多种细 胞类型能力的未分化细胞。在一个实施方案中，多能性如实施例4中所述通过 形态学确定。在此种实施方案中，当细胞为其一部分的集落表现出少于1％分化 时，则认为该细胞是多能性的。在一个实施方案中，多能干细胞是胚胎干细胞。 在另一个实施方案中，多能干细胞是使用遗传学或者化学方法来源于任何体细 胞的诱导性多能干细胞。

胚胎干细胞可以从早期哺乳动物胚胎-胚泡的内细胞团得到。诱导性多能干 细胞(iPSCs)通过使身体体细胞再编程得到。术语“多能干细胞”包括，但不限 于，培养的胚胎干细胞系和从任何组织衍生的诱导性多能干细胞系。诱导性多 能干细胞可以衍生自哺乳动物细胞。还已经在非哺乳动物来源例如斑马鱼、果 蝇和蝾螈中发现干细胞。在一个实施方案中，多能干细胞是人的。

在一个实施方案中，聚集体或团在Y27632(ROCK抑制剂)存在下形成，加 入Y27632以增加单个干细胞的存活。

术语“聚集体”如在此所使用指细胞粘附至另一细胞或者一个以上细胞粘 附在一起或者一群细胞粘附在一起。此种聚集体从人多能干细胞汇合或半汇合 培养被破坏之后的细胞形成，或者从通过人多能干细胞汇合或半汇合培养被破 坏所得到的细胞团形成。术语“胚状体”或“EB”如在此所使用指衍生自人多 能干细胞的三维聚集体。胚状体使用多种方案形成，包括刮取人多能干细胞。 聚集体和胚状体可互换使用。然而在一些情况下，聚集体特别指当使用如实施 例7中所示称作AggreWell^TM400或者如实施例24中所示的称作 AggreWell^TM800的微孔装置时的聚集体。在一个实施方案中，胚状体包含500 至20,000个细胞。

在再一实施方案中，在c)中的解离和贴壁培养在所述培养基中培养至少1 天，可选3-6天。

术语“解离”如在此所使用指使细胞的聚集体或团解散成为更小的聚集体 或不同大小或单细胞悬液。在此所述的细胞的解离可以通过任何方法实现，包 括但不限于，酶学、化学或机械方法。在一个实施方案中，解离包括机械方法。 在另一个实施方案中，解离包括酶学方法，例如Accutase、分散酶、Neurocult化学解离试剂盒或胰蛋白酶。

在一个实施方案中，包被培养皿包含促进细胞附着的因子，例如细胞外基 质分子、合成的分子、合成的肽或化学底物。在另一个实施方案中，包被培养 皿包含聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白、单独的层粘连蛋白或者Matrigel。本领域技术 人员容易确定层粘连蛋白的浓度，所述浓度包括，1-20μg/mL，例如1μg/mL、 5μg/mL、10μg/mL或20μg/mL。本领域技术人员容易确定聚-L-鸟氨酸浓度， 所述浓度包括，1-100μg/mL，例如1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL或20μg/mL。

术语“分化”如在此所使用指不太特定的细胞例如干细胞变成更加特定的 细胞类型的过程，以致于其定向于特定谱系，包括但不限于，某些祖细胞以及 更加特定的体细胞。本领域容易获得用于干细胞分化的条件。

术语“胚层祖细胞”如在此所使用指能够分化成在哺乳动物胚胎发生过程 中所形成的三层细胞的细胞。因此，在一个实施方案中，胚层是外胚层的，指 发育成皮肤和神经组织的外面胚层；内胚层的，指发育成消化和呼吸系统内层 的内部胚层；和/或中胚层的，指发育成肌肉、骨骼和软骨和血液和结缔组织的 中间胚层。

外胚层的分化

本发明人已经表明，对于首先在微孔装置中培养和/或悬浮培养的解离的细 胞通过在具有260至280mOsm/kg范围重量克分子渗透压浓度的培养基中培养 干细胞，和对于根据在此所述方法直接平板接种于包被培养皿上的解离细胞通 过在具有270至320mOsm/kg范围重量克分子渗透压浓度的培养基中培养干细 胞，可诱导外胚层的胚层。因此，在一个实施方案中，培养基的重量克分子渗 透压浓度是260至280mOsm/kg，用于诱导外胚层祖细胞。在另一个实施方案 中，在此处所述方法中使用的培养基重量克分子渗透压浓度是270至320 mOsm/kg，用于诱导外胚层祖细胞。

在另一实施方案中，在此所述的方法还包括基于选自Pax6、Sox1、Sox2、 A2B5、CD15、CD24、CD29、CD81、CD133、PSA-NCAM、波形蛋白(Vimentin)、 Musashi1、Musashi2和巢蛋白的与神经细胞命运有关的标志物的存在鉴定外胚 层或神经祖细胞。

本公开还提供了在具有260-340mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的培养基 中维持单个神经祖细胞的方法，包括根据在此所述的方法产生外胚层祖细胞， 从附着培养物解离外胚层祖细胞；将所述祖细胞平板接种并培养至少1天。在 一个实施方案中，在bFGF存在下维持单个神经祖细胞。在另一个实施方案中， 祖细胞平板接种并培养至少4天。在一个实施方案中，细胞平板接种于包被培 养皿上。在一个实施方案中，包被培养皿包含促进细胞附着的因子，例如细胞 外基质分子、合成的分子、合成的肽或化学底物。在另一个实施方案中，包被 培养皿包含聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白。典型的层粘连蛋白浓度如在此所述。

在一个实施方案中，bFGF浓度为10-100ng/mL。在另一个实施方案中，细 胞增殖并维持培养至少3代。在一个实施方案中，如在此所述细胞在包被培养 皿上增殖并维持。

本发明人发现，使用pH 7.0至8.0的无Ca²⁺和Mg²⁺1×PBS缓冲液的缓冲 液对贴壁培养物孵育可以选择性地释放或解离单个神经祖细胞。因此，在另一 个实施方案中，单个神经祖细胞在包含pH 7.0至8.0的无Ca²⁺和Mg²⁺1×PBS 或1×Hank’s缓冲溶液的缓冲液中解离。在一个实施方案中，单个细胞在缓冲 液中孵育1至2小时。在另一个实施方案中，细胞在缓冲液中孵育30-90分钟。

在又一个实施方案中，细胞在包含DMEM-F12、N2、B27或其组合、非必 需氨基酸、激素、脂类、BDNF、GDNF、抗坏血酸、视黄酸、TGFβ(神经元)、 音猬因子(sonic hedgehog(SHH))、甲状腺激素、BMP家族任何成员、EGF 和PDGF(少突胶质细胞)、环巴胺或任何其它SHH抑制剂(星形细胞)的神经元 细胞分化培养基中培养，以产生分化的细胞。如本文所述分化的细胞任选在包 被培养皿上增殖和维持。对于分化，去除bFGF。在一个实施方案中，分化的细 胞包括神经元、星形细胞或少突胶质细胞，它们任选地基于选自TUJ1、MAP2(神 经元)、A2B5、GFAP、GLAST(神经胶质细胞、星形细胞和放射状胶质细胞)、 FGFR1、FGFR2、FGFR3、GFR4、O4、OLIG2、GalC和NG2(少突胶质细胞) 的标志物的存在而鉴定。

内胚层/中胚层的分化

本发明人已经证明，对于在通过在此所述方法平板接种于包被培养皿上之 前在微孔装置中培养和/或悬浮培养的解离的细胞，通过在高于280mOsm/kg， 可选290-340mOsm/kg范围重量克分子渗透压浓度的培养基中培养干细胞，和 对于根据在此所述方法直接平板接种于包被培养皿上的解离细胞，通过在高于 320mOsm/kg，任选320至340mOsm/kg范围重量克分子渗透压浓度的培养基 中培养干细胞，可诱导内胚层/中胚层的胚层。因此，在另一个实施方案中，在 此处所述方法中使用的培养基的重量克分子渗透压浓度高于280mOsm/kg，用 于诱导内胚层/中胚层祖细胞。在另一个实施方案中，培养基的重量克分子渗透 压浓度是290至340mOsm/kg，用于诱导内胚层/中胚层祖细胞。在又一个实施 方案中，在此处所述方法中使用的培养基的重量克分子渗透压浓度高于320 mOsm/kg，用于诱导内胚层/中胚层祖细胞。在另一实施方案中，培养基的重量 克分子渗透压浓度是320至340mOsm/kg，用于诱导内胚层/中胚层祖细胞。

在一个实施方案中，重量克分子渗透压浓度高于280mOsm/kg，任选高于 320mOsm/kg的培养基，提供了中胚层命运的分化，其可以产生间充质干细胞、 软骨细胞、心肌细胞、造血干细胞和骨细胞。在另一个实施方案中，重量克分 子渗透压浓度高于280mOsm/kg，任选高于320mOsm/kg的培养基提供了内胚 层命运的分化，其可以产生胰腺、肠细胞和肝脏细胞。

在另一实施方案中，在此所述的方法还包括基于选自Sox17、HNF1β、 HNF3β、Gata4、Gata6、CXCR4(CD184)、AFP(内胚层)和Bry、MixL1、Snail、 Bmp2、Bmp4、CD31和CD34(中胚层)的标志物的存在鉴定内胚层和/或中胚层 祖细胞。

本公开还提供了在具有290至340mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的培养 基中维持单个内胚层或中胚层祖细胞的方法，包括根据在此所述方法产生内胚 层或中胚层祖细胞，从贴壁培养物解离单个的内胚层或中胚层祖细胞；平板接 种并培养所述祖细胞。在一个实施方案中，如在此所述细胞平板接种于包被培 养皿上。

在一个实施方案中，向培养基中加入诱导因子以得到内胚层和中胚层。因 子，例如，包括BMP和FGF家族成员以及激活蛋白A(activin A)(Boyd等， 2009；Kubo等，2004；Lee等，2009，Takei等，2009，Sulzbacher等，2009)。

在一个实施方案中，细胞增殖并维持培养至少3代。在一个实施方案中， 如在此所述细胞在包被培养皿上增殖并维持。

本发明人发现，使用pH 7.0至8.0的无Ca²⁺和Mg²⁺1×PBS缓冲液的缓冲 液对贴壁培养物孵育可以释放或解离单个外胚层神经祖细胞。因此，在另一个 实施方案中，通过在具有pH 7.0至8.0的无Ca²⁺和Mg²⁺1×PBS缓冲液的缓冲 液中解离，从培养物释放外胚层细胞，从而留下内胚层和/或中胚层细胞附着至 平板上以便培养，得到内胚层或中胚层祖细胞。内胚层和中胚层祖细胞不脱离 表面，因此该方法去除外胚层祖细胞，留下了内胚层和中胚层细胞的富集群体， 其然后可以被解离。

在又一个实施方案中，细胞在中胚层或内胚层细胞分化培养基中培养以产 生分化的细胞。所述的分化的细胞任选在此处所述的包被培养皿上增殖和维持。 此类分化培养基包括，但不限于，胎牛血清(FBS)、BMP和FGF家族成员、滤 泡抑素(follistatin)、诺金(Noggin)和激活蛋白A。在一个实施方案中，分 化的细胞包括间充质干细胞、软骨细胞、心肌细胞、造血干细胞、骨骼肌细胞(中 胚层)、胰腺细胞、肠细胞或肝脏细胞(内胚层)。

在另一实施方案中，分化的细胞谱系使用分化标志物鉴定，所述分化标志 物包括但不限于Stro1、胶原2、MyoD、Sox9、肌动蛋白、Msx2、Runx2、Dlx5(间 充质干细胞)；CD44、CD151、Sox9、骨粘连蛋白(Osteonectin)、胶原2(软 骨细胞)、MyoD(心肌细胞)、CD34、CD31、CD133、Tie2(造血干细胞)、肌动 蛋白、α-辅肌动蛋白、MyoD、结蛋白(Desmin)(骨骼肌细胞)、Islet1、Islet2、 Pdx1、胰岛素(胰腺细胞)、Hnf1β、Cdx2(肠细胞)、白蛋白、ApoE(肝脏细胞)。

本公开的实验

通过在此所述方法产生的细胞允许实验性分析神经系统早期发育过程中的 事件，和鉴定具有例如用于诱导再生过程的治疗潜能的新的基因和多肽因子。 另外的药物应用可包括开发毒性实验和药物开发平台，例如高通量筛选神经保 护性化合物。在体外从hES细胞产生神经祖细胞将充当用于神经变性疾病潜在 细胞治疗和用于递送和表达神经系统中因子的无限细胞来源。

通过在此所述方法产生的神经祖细胞和分化的神经细胞可以用于人神经发 育的细胞和分子生物学研究、用于发现在神经分化和再生中起作用的基因、生 长因子和分化因子、用于药物开发和用于开发用于致畸、毒性和神经保护效应 的筛选实验。

因此，本公开提供了筛选胚层细胞的方法，包括

(a)通过在此所述方法制备外胚层、内胚层和/或中胚层的胚层 细胞培养物；

(b)以一种或者多种测试试剂处理胚层细胞；和

(c)对处理的胚层细胞进行分析。

在一个实施方案中，提供了筛选神经祖细胞的方法，包括

(a)通过在此所述方法制备神经祖细胞培养物；

(b)以一种或者多种测试试剂处理神经祖细胞；和

(c)对处理的神经祖细胞进行分析。

在一个实施方案中，测试试剂是测试对胚层细胞或神经祖细胞向特定细胞 类型分化效应的化学物质或其他物质。在此种实施方案中，分析可以包括检测 分化的细胞类型的标志物。对于源于外胚层或神经祖细胞的神经分化，标志物 包括但不限于，巢蛋白、Sox1和TUJ1。对于源于内胚层细胞开始的内胚层分 化，标志物包括但不限于，Sox7、Sox17、HNF1β、HNF3β、Gata4、Gata6、 CXCR4(CD184)、甲胎蛋白(AFP)(内胚层)。对于源于中胚层细胞的中胚层分化， 标志物包括但不限于Bry、MixL1、Snail、Bmp2、Bmp4、CD31、CD34(中胚层)。 在一个实施方案中，筛选实验用于鉴定具有治疗潜能的化合物，所述治疗潜能 例如用于诱导再生过程或者提供神经保护性化合物。

在另一个实施方案中，测试试剂是化学物质或者药物，并且筛选用作对于 化学物质或药品的一级筛选或者二级药理学和毒理学评价筛选。

本公开的培养基

本公开还提供了用于诱导胚层祖细胞的培养基组合物。在一个实施方案中， 培养基具有低于340mOsm/kg的重量克分子渗透压浓度。在另一个实施方案中， 培养基具有240至340mOsm/kg的重量克分子渗透压浓度。在又一个实施方案 中，培养基具有260至340mOsm/kg的重量克分子渗透压浓度。

本公开还提供了用于诱导外胚层的胚层祖细胞的培养基组合物。在一个实 施方案中，培养基具有260至280mOsm/kg的重量克分子渗透压浓度。在另一 个实施方案中，培养基具有270至320mOsm/kg的重量克分子渗透压浓度。本 公开进一步提供了用于诱导中胚层和/或内胚层的胚层祖细胞的培养基。在一个 实施方案中，培养基具有高于280mOsm/kg，任选290至340mOsm/kg的重量 克分子渗透压浓度。在另一个实施方案中，培养基具有高于320mOsm/kg，任 选320至340mOsm/kg的重量克分子渗透压浓度。

培养基可以是可用于干细胞分化的任何培养基。例如，培养基任选地是无 多能性因子或者无因子的的培养基，包含表2中所示成分并且调节成所希望重 量克分子渗透压浓度，任选260-340，260-280，290-340或大约270mOsm/kg。 本领域技术人员将容易地理解如何调节溶液的重量克分子渗透压浓度，例如， 如实施例5中所述，可以通过加入盐调节重量克分子渗透压浓度。简言之，使 用下列公式计算加入至5×补充物的盐的量：例如为了在将5×补充物(100 mOsm/kg的最初重量克分子渗透压浓度)和基础培养基(在这里：300mOsm/kg 的最初重量克分子渗透压浓度)混合之后得到270的重量克分子渗透压浓度：

[270-((0.8×300mOsm)+(0.2×100mOsm))]/2000×58.44×1.05＝0.30 g/L of NaCl

可以由任何其它培养基制备方法以及开始培养基，通过调节NaCl的浓度 实现270的重量克分子渗透压浓度。

上面的公开总体性地描述了本公开。通过参考下列特定实施例可以更加全 面的理解。这些实施例仅以解释说明目的描述并且不旨在限制本公开的范围。 等效的变形和取代物也包括在内，如果情况可能有利或使得有利。尽管在本文 中已经采用了特定术语，但是此类术语旨在说明，不是为了限制的目的。

下列非限定性实例对本公开进行说明：

实施例

实施例1.在BD Matrigel^TM包被上在成分确定的无血清培养基中人多能干 细胞作为聚集体的培养

人多能细胞维持在BD Matrigel^TM包被平皿上在成分确定的无血清培养基 中。详细的方案可以在干细胞技术公司(STEMCELL TECHNOLOGIES INC) 的用于维持人多能干细胞的手册#29106“人胚胎干细胞在mTeSR1中的维持 (Maintenance of Human Embryonic Stem Cells in mTeSR1)”中找到，其包括 用于BD Matrigel^TM包被的方法。当集落变大，开始融合和与它们的边缘相比 具有致密和相亮的中心时(见图1)将细胞传代。取决于所接种聚集体的大小和密 度，在最初接种后5-7天将培养物传代。

从干细胞培养物吸取培养基，将细胞用DMEM/F-12(2mL/孔)洗涤。每孔 加入1mg/mL浓度的分散酶(STEMCELL TECHNOLOGIES INC.目录号07923) 1mL。将平皿于37℃放置7分钟。

一旦集落边缘出现轻微的回折，则去除分散酶，并且每个孔用2mL DMEM/F-12/孔轻轻洗涤2-3次以稀释掉任何残留的分散酶。向孔中加入2mL/ 孔DMEM/F-12或mTeSR1，并且用细胞刮(例如Corning目录号3010)或者血 清学移液管吸头刮下集落。

将脱离的细胞聚集体转移至15mL圆锥形管中并将孔用另外2mL DMEM/F-12洗涤以收集任何残留的聚集体。将包含残留细胞的洗涤培养基加入 到同一15mL管中。

将包含聚集体的15mL管于室温(15-25℃)以300×g离心5分钟。吸掉上 清液。对于在15mL管中收集的每孔的hESC聚集体，加入1-2mL的mTeS1。 通过使用P1000微量移液器轻轻地上下吹吸(1-2次)将沉淀物重悬。细胞保持为 聚集体。使用“团块计数”法估计团块的数量。为了计数合适大小(直径～50-60 μm)的可能附着且生长的团块，使用置于显微镜目镜中的测微尺。为了进行团 块计数，将30μL的DMEM/F-12等分入96-孔平底板的2个孔中。在这些孔底 部的中心画上“+”以充当计数栅。向每一孔中加入5μL新鲜混合的团块悬浮 液。对大约3500μm²或更大的团块一式两份计数。这相当于直径大约60μm的 团块。使用公式估计每μl的团块总数：

每μl的团块总数＝计数的团块x/5μL悬浮液总体积。

根据接种的孔或平皿的大小将定义数目的团块进行平板接种。为了确保合 适接种密度，使用表1中的指导计算用于接种新平皿的团块悬浮液体积(y)。例 如对于6-孔的(y)等于：350/每μl计数的团块数。

用新的每BD Matrigel^TM包被的6孔板孔以2mL mTeSR1进行hESC聚集 体平板接种。将板数次快速、短暂、前后和左右移动以便将细胞均匀分散在孔 表面上。将板置于37℃培养箱中。在mTeSR1和BD Matrigel^TM中培养的hESC 可以用作本发明分化方案细胞的持续来源。图1显示第51代培养第5天的未分 化H9hESC。

实施例2.用于hES细胞维持培养物的小鼠胚胎成纤维细胞层(MEF)的制 备

根据标准方案(WiCell Research Institute网址：https://www.wicell.org以及 Dravid等，Human Embryonic Stem Cell Protocols，Humana press)制备辐射胚胎的 第13天的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF’s)(CF-1小鼠品系)。将人多能干细胞平板 接种于MEFs上的前一天，根据WiCell Research Institute的标准方案将一瓶辐 射的MEF解冻到标准“MEF-培养基”中。平板接种大约2×10⁴个细胞/cm²， 这相当于大约2×10⁵个细胞每6孔板孔。图2显示在MEF上培养的第4天时 的hESC。

实施例3.人多能干细胞在小鼠饲养细胞上的培养

维持在小鼠饲养细胞上的人多能干细胞还可以用作本发明分化方案细胞的 持续来源。

根据可以在WiCell Research Institute网站(https://www.wicell.org)和Dravid 等，Human Embryonic Stem Cell Protocols，Humana press)上找到的WiCell  Research Institute的标准方案，H9hESC生长于hESC培养基(DMEM-F12 (STEMCELL TECHNOLOGIES INC.，目录号36254)，25％基因敲除代血清 (knock-out serum replacer)(Invitrogen，目录号10828028)，200mM L-谷氨酰 胺(Invitrogen，目录号25030081)，0.1mM β-巯基乙醇(Sigma，目录号63689)， 1×NEAA溶液(Invitrogen，目录号11140050)，4ng/ml bFGF(STEMCELL  TECHNOLOGIES INC.，目录号02634))中的MEF’s上(见实施例2)。

简言之，当饲养细胞层超过2周龄，分离细胞；集落开始合并或者变大具 有致密中心。对于人多能干细胞的传代，在每6孔板孔中使用DMEM/-F12中 的1mg/ml IV型胶原酶(STEMCELL TECHNOLOGIES INC.，目录号07909)溶 液。吸掉培养基并且加入胶原酶溶液于37℃下5分钟。使用5-ml血清学移液 管，将细胞从板上刮下，同时慢慢地上下吹吸胶原酶溶液以洗涤表面的细胞。 将悬浮液转移至15-ml圆锥形管(Falcon)中并且以300g离心5分钟。吸掉上清 液并且加入2-3ml的hESC培养基。通过轻轻拍打管，将沉淀物重构并在此以 300×g再次离心5分钟。其间，培养基被从MEF’s吸掉并且细胞被1×PBS(无 Ca，Mg)，pH 7.4洗涤2次。去除沉淀hESC的上清液并且加入12ml新鲜的 hESC培养基。使用10-ml血清学移液管，将沉淀小心地重悬并将细胞悬浮液分 配到MEFs的6-孔板上(这等于hESC 1∶6的分离比率)。前后左右移动平板数 次以将细胞均匀分布。然后将平板放回到培养箱中。

实施例4.在BD Matrigel^TM上mTeSR1中生长的人多能干细胞(hPSC)多 能性的形态学评价

为了能成功诱导胚层，使用了高纯度的多能干细胞群体。采用下列标准以 评价细胞的形态学和质量(描述于STEMCELL TECHNOLOGIES INC.的技术手 册#29106中)：如图1中所示，未分化的人多能干细胞生长成为紧密的多细胞集 落。它们表现出高的核质比和突出的核仁。这些集落的特征在于具有清晰的边 界。健康的hPSC集落在中心是多层的，导致当在相差下观察时为相亮细胞的 团块。分化的特征在于边界完整性的丧失、集落内肉眼可见的不均匀的细胞形 态和明显交替细胞类型的出现。通过在显微镜下观察(使用4×和10×物镜)集 落评价多能性百分数。细胞仅当表现出小于1％分化时用于胚层诱导。图3在左 列显示多能干细胞并且在右列显示具有分化中心(红色框和闭合框)的集落实 例。

实施例5.具有不同重量克分子渗透压浓度范围的培养基配方：具有改良 重量克分子渗透压浓度的无因子mTeSR1培养基

完全培养基配方和制备改良TeSR(mTeSR1，STEMCELL  TECHNOLOGIES INC.，目录号05850)的方法公布于Ludwig等，Nature  Biotechnology 3(8)：637，2006中。其基于Ludwig等，Nature Biotechnology 24(2)： 185，2006公布的最初的TeSR配方，并具有下列改良：用牛血清白蛋白(BSA) 代替人血清白蛋白(HSA)。

为了制备无因子mTeSR1(mTeSR1-F)培养基，产生包含5倍浓度所有 mTeSR1试剂的5×补充物，除了下列5种因子之外：GABA、哌啶酸(pipecolic  acid)、bFGF、TGFβ1、氯化锂。培养基的成分示于表2中。

在将5×补充物的成分混合在一起后，通过加入10N NaOH将pH调至7.4。 使用标准的渗透压计测量溶液的重量克分子渗透压浓度。5×补充物的最初重量 克分子渗透压浓度通常大约100mOsm/kg，并且当考虑到为得到mTeSR1-F 而将5×补充物与400mL基础培养基DMEM/F12(Hyclone，目录号 SH30004)(具有大约300mOsm/kg的重量克分子渗透压浓度)结合时，使用盐 (NaCl)增加重量克分子渗透压浓度。必须向5×补充物加入的盐的量使用下列公 式计算：例如为了在将5×补充物和基础培养基混合后得到270的重量克分子 渗透压浓度：

[270-((0.8×300mOsm)+(0.2×100mOsm))]/2000×58.44×1.05＝0.30 g/L NaCl

x量的NaCl加入到5×补充物中。制备4种具有不同重量克分子渗透压浓 度的培养基：260mOsm/kg，280mOsm/kg，320mOsm/kg和340mOsm/kg。

实施例6.针对AggreWell^TM400中的EB形成，产生人多能细胞的单细胞 悬液

从人多能干细胞集落产生单个细胞以及在AggreWell^TM400方案和装置中 使用它们的过程描述于技术手册29146(STEMCELL TECHNOLOGIES INC.) 中。简言之，从培养箱取出包含处于半汇合的未分化H1第46代hESC的10-cm 平板，并且置于无菌组织培养柜中。从H9培养物中吸掉mTeSR1维持培养基， 然后用2mL 1×PBS(无Ca，Mg)，pH 7.4洗涤每一块平板，然后吸掉并丢弃。 使用Accutase(STEMCELL TECHNOLOGIES INC.目录号07920)将贴壁hESC 培养物解离成单个细胞。直接向包含未分化的H9细胞培养物的每一10-cm平 板中加入3mL Accutase。然后将平板于37℃孵育大约10分钟，或者直到通过 轻轻摇动细胞即可容易地从平板上脱落。使用血清学移液管将H1细胞悬液轻 轻地吹吸2-3次以保证任何剩余的团块被完全解离并将仍然附着在平皿表面的 任何细胞脱离。将悬浮液转移至50mL圆锥形管中。用10mL 1×PBS(无Ca， Mg)，pH 7.4洗涤每一平板并将洗涤溶液转移至包含细胞悬浮液的同一50mL 管内。

使用相同的过程将在MEF上生长的H9hESC(见实施例3)解离成单细胞悬 浮液。在EB形成过程中EBs内的大多数饲养细胞死亡，并且认为不会妨碍EBs 内的胚层诱导过程。

将细胞悬浮液于室温(15-25℃)以350×g离心7分钟。吸取上清液并丢弃。 将细胞沉淀在1mL体积的具有270、290、320或340mOsm/kg重量克分子渗 透压浓度的mTeSR1-F培养基中重悬。还向培养基中加入Y27632ROCK抑 制剂(STEMCELL TECHNOLOGIES INC.目录号07171/2)至终浓度10μg/mL 以在EB形成过程中提高细胞存活(Watanabe等，2007)。使用标准技术，通过 将10μL细胞悬浮液样品在90μL台盼蓝(Invitrogen，目录号15250061)中以1∶ 10稀释并在血球计数器上计数未染色的细胞计数活细胞。根据每μl的细胞数计 算对于EB形成(实施例7)使用的细胞体积。一个10-cm平皿的hESC产生7-10 ×10⁶个细胞。

实施例7.使用微孔装置(AggreWell^TM400)在mTeSR1-F 270、290、320 和340mOsm/kg培养基中从人多能干细胞形成EB以诱导3个胚层

使用AggreWell^TM400可以极其有效地产生大小受控的EB。简言之，使用 实施例1的方法将未分化的H1hESC培养至半汇合。如在技术手册#29146 (STEMCELL TECHNOLOGIES INC.)中所述，在无菌组织培养柜中将 AggreWell^TM400板拆除包装。平板的包含8个微孔的每一个孔用1mL的1× PBS(无Ca，Mg)，pH 7.4洗涤，然后通过吸取去除PBS。向AggreWell^TM400 板的每一个孔中加入1mL培养基。为了诱导3个不同的胚层细胞类型：外胚 层、内胚层和中胚层，使用具有4种不同重量克分子渗透压浓度的培养基用于 EB形成：270mOsm/kg、290mOsm/kg、320mOsm/kg和340mOsm/kg(制备： 见实施例4)。还向培养基中加入Y27632ROCK抑制剂至终浓度10μg/mL以在 EB形成过程中提高细胞存活。AggreWell^TM400板在配备平板架的吊桶式转头 中以3000×g离心2分钟以从微孔中去除任何小的气泡。然后将AggreWell^TM400 板放在一边，同时使用实施例6的方法制备H1hESC单细胞悬浮液。向先前制 备的AggreWell^TM400板的每一孔中加入包含2.4×10⁶个细胞的细胞悬浮液体 积。该数量的细胞将分布进大约1200个微孔中，形成每一个具有大约2,000个 细胞的EBs。如上加入培养基，至每孔2mL的终体积。将AggreWell^TM400板 以100×g离心3分钟将细胞捕获到微孔内。将平板于37℃、5％CO₂和95％湿 度下孵育24小时。图4显示在AggreWell^TM400孔的微孔内分布的单个H1hESC 细胞。

实施例8.通过“刮EB”方法形成EB并悬浮培养以诱导向3个胚层的分 化

EB还可通过刮法常规产生，该方法不能够控制EB的大小和形状。为了形 成EBs，使用机械刮取从组织培养平板上抬起贴壁的人多能干细胞集落。将所 得到的大小随机的细胞团块置于非贴壁悬浮培养中，并将EBs在标准组织培养 箱中于37℃、5％CO₂和95％湿度下孵育5天，每2天更换一次培养基。为此， 将平皿向一侧倾斜并且使用1000-μl移液管吸头去除大约一半体积的培养基， 而不扰动EBs。为了诱导3个胚层，使用如实施例7中所述的相同的培养基。 加入新鲜的培养基至5ml。如实施例9和11-13中所述，进一步处理EBs用于 外胚层、中胚层和内胚层诱导。图5显示在mTeSR1-F 270mOsm/kg中形成 后1天刮取的EBs。

实施例9.EB在mTeSR1-F 260、270和280mOsm/kg中悬浮培养5天 以诱导神经外胚层细胞谱系

如实施例7中所述EBs从H9hESC细胞形成。简言之，向AggreWell^TM400 的孔中加入包含2.4×10⁶个人ES细胞的单细胞悬浮液，以产生每一个EB具有 2,000个细胞的大约1200个EBs。

然后在无菌组织培养柜中，通过用1mL一次性移液管吸头轻轻上下吹吸 AggreWell^TM400微孔内的培养基2-3次以脱离大部分的EBs来收集的EBs。为 了收集EBs，将悬浮液通过置于50mL圆锥形管顶部的反向40μm尼龙细胞滤 网(Falcon)以去除未聚集的单个细胞和碎片。每次用1mL的DMEM/F-12进一 步洗涤AggreWell^TM400表面，洗涤5次，吹吸整个表面以脱离所有聚集体。将 所有洗涤物加到细胞滤网膜上。将细胞滤网翻转，保持靠近低附着6孔板孔的 上方。使用mTeSR1-F 260、270或280mOsm/kg培养基将EBs从膜上洗下以 诱导所形成的EBs分化成神经外胚层。使用大约5ml的培养基以从尼龙膜上移 除EBs，将滤网置于6-孔超低附着平皿(STEMCELL TECHNOLOGIES INC.，目 录号27145)的单个孔上。将EB在标准组织培养箱中于37℃、5％CO₂和95％湿 度下孵育5天，每2天更换一次培养基。为此，将平皿向一侧倾斜并且使用 1000-μl移液管吸头去除大约一半体积的培养基，而不扰动EBs。加入新鲜的培 养基至5ml。图6以2×、10×和40×放大倍数显示在AggreWell^TM400板中孵 育24小时后释放的EBs。在从AggreWell^TM400板回收EBs时没有观察到形态 学差异。

实施例10.在包含270至320mOsm/kg范围重量克分子渗透压浓度的培养 基的贴壁单层培养中，诱导人多能干细胞向神经祖细胞的体外分化

为此，使用人多能干细胞作为团块或者作为单细胞层平板接种于BD Matrigel^TM上或者小鼠饲养细胞上。为了将细胞作为团块进行平板接种，使用1 ×PBS(无Ca，Mg)，pH 7.4解离干细胞集落。可选地，可以使用产生hESC团 块的任何酶学、化学或机械方法，例如但不限于胶原酶、分散酶或机械刮取。 在移除培养基后将细胞用1×PBS(无Ca，Mg)，pH 7.4洗涤。室温下，将PBS 留在细胞上大约10分钟。使用5-mL血清学移液管轻轻地上下吹吸细胞并转移 至15mL圆锥形管中。将团块于室温以350×g离心5分钟。去除1×PBS(无 Ca，Mg)，pH 7.4并将细胞重悬于1mL mTeSR1-F 270或320mOsm/kg中， 使用1000μl移液管吸头短暂地注射将它们从管底离开。任选地，向诱导培养 基中加入1×浓度的N2A(STEMCELL TECHNOLOGIES INC.，目录号07152) 和B27(STEMCELL TECHNOLOGIES INC.，目录号07153)。将细胞团块悬浮 液分配于以BD Matrigel^TM包被的6-孔板的5个孔之间。

为了得到用于贴壁诱导的单细胞悬浮液，使用实施例6的方法。将细胞以 大约2×10⁵个细胞每6孔板孔的密度平板接种于mTeSR1-F 270或320 mOsm/kg中。培养基每2天更换一次。

图7显示在诱导5天后从接种的团块出现神经祖细胞。在神经分化过程中， 人多能干细胞经历了形态发生事件，特征为形成放射状构造的柱状上皮细胞， 称作“神经玫瑰花状结构”(Zhang等，2001；Perrier等，2004)。这些结构包 含能够响应合适的发育指示而分化成各种区域特异性神经元和神经胶质细胞类 型的细胞(Perrier等，2004；Li等，2005)。玫瑰花状结构以不同大小和形状出 现，并且可以容易地鉴定。在两种培养基(mTeSR1-F 270和320mOsm/kg)中， 以几乎相同的效率形成玫瑰花状结构并且在3天后可见。诱导期为5-6天。箭 头指向一些玫瑰花状结构实例。

实施例11.在悬浮培养后，于mTeSR1-F 260、270和280mOsm/kg中 将EBs平板接种以便能够生长出神经外胚层的祖细胞

在使用实施例6和7的方法形成和培养EB后，在显微镜下可见EBs。在 于不同重量克分子渗透压浓度中培养的EB中没有观察到明显的形态学差异。

为了能够培养单独的神经祖细胞，使用任选的机械研磨法将EB解离成小 的团块。可选地，其他化学方法单独或者与酶学解离方法相组合，或者酶学解 离可用于此目的。该过程能够使神经祖细胞从这些结构中生长出并且形成多层 的细胞团块和单细胞层。对于机械研磨，使用1000μl移液管吸头将EBs从6- 孔板转移至圆锥形的15mL管中。通过室温孵育5分钟，使EB沉入管底。去 除上清液，使沉淀的EB留在管底。向相应的管中加入1ml新鲜的mTeSR1-F 260、270或280mOsm/kg。使用1000μl移液管吸头，根据EB的稠度通过上下 吹吸5-20次直到产生几乎不包含可见的小团块的细胞悬浮液而将细胞解离。将 一个15mL管的细胞悬浮液(相当于在一个6孔板孔中培养的EBs)分配到6-孔平 皿中的3个孔中，每一个孔包含3片以聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的玻璃盖玻 片(见实施例18)。加入培养基至2ml并且通过轻轻地前后摇动平板将细胞均匀 分布。将平皿放回到37℃。在数小时后观察到贴壁。图8显示2天后的贴壁的 EB。箭头指向一些玫瑰花状结构实例。玫瑰花状结构存在于所有3种培养基中 并且可以在贴壁2天后观察到。如实施例12中所述评估玫瑰花状结构百分数并 因此评估神经诱导有效性。

实施例12.来自在260-280mOsm/kg范围内重量克分子渗透压浓度培养 基中的悬浮培养物的贴壁EBs的形态学评估以确定出现的神经外胚层的百分数

将解离的EBs平板接种(见实施例11)后2天，玫瑰花状结构变得明显(图 8)。这些神经玫瑰花状结构代表着按尺寸排列的玫瑰花状结构、具有多细胞层 的“脊样”玫瑰花状结构和单细胞层的“星形”玫瑰花状结构的混合物。设定 评分标准以评价包含玫瑰花状结构集落的百分数。为了使标准严格，仅计数出 现玫瑰花状结构超过50％的集落。具有较低百分数的集落不包括在内。下列公 式用于计算神经玫瑰花状结构的总百分数：“集落总数/出现玫瑰花状结构超过 50％的集落”。图9总结了玫瑰花状结构计数结果。

实施例13.在具有290至340mOsm/kg重量克分子渗透压浓度范围的 mTeSR1-F中悬浮培养并平板接种EBs以诱导内胚层和中胚层细胞谱系并效 率较低地诱导外胚层的细胞谱系

使用如实施例6和7中所述方法和培养基mTeSR1-F 270、290、320和 340mOsm/kg，使用H1hESC形成EBs并诱导不同胚层的细胞。通过如实施例 11中所述的方法培养EB并附着。与先前实施例中使用的mTeSR1-F 260-280 mOsm/kg相比，使用高于280的重量克分子渗透压浓度的培养基观察到明显的 形态学差异。在290mOsm/kg的重量克分子渗透压浓度，与更低的重量克分子 渗透压浓度相比观察到更少的玫瑰花状结构。图10显示EB贴壁后可以观察到 的细胞形态。图17显示在mTeSR1-F 270mOsm/kg和mTeSR1-F 340 mOsm/kg中诱导的细胞上对巢蛋白和Sox1的免疫细胞化学染色(见实施例17)。 使用270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的培养基观察到许多玫瑰花状结构， 但是其它3个重量克分子渗透压浓度显示玫瑰花状结构形成减少。此外，在培 养基mTeSR1-F 340mOsm/kg中巢蛋白和Sox1的表达没有以在培养基 mTeSR1-F 270mOsm/kg中一样的程度重叠。最有可能的是，在贴壁EB集落 中存在的其它细胞谱系是内胚层和中胚层来源的，这通过它们的扁平和“鹅卵 石样”细胞以及扁平细胞和纺锤体样形态细胞证实，如先前所公开(Odorico等， 2001；Ferreira等，2007，Gerrard等，2005)(见图10)。可能的是这些中胚层和 内胚层祖细胞表达巢蛋白，这是一种以前已经描述的现象(Wiese等，2004)。如 图11中所示，与巢蛋白/Sox1双阳性细胞相比，这些细胞看上去是扁平的。

使用在实施例12中所述的评分标准，估计玫瑰花状结构百分数以及因此外 胚层/神经祖细胞百分数，并且使用mTeSR1-F 320和340mOsm/kg开展试验 的百分数示于图12中。

实施例14.神经玫瑰花状结构集落的选择性脱落和将来自贴壁EB培养物 的神经祖细胞平板接种于mTeSR1260-280mOsm/kg中而不是mTeSR1 340mOsm/kg中

在贴壁条件下最少3天的培养后，用5-6天的培养时间，使用任选的1× PBS(无Ca，Mg)，pH 7.4，将通过机械研磨如实施例12中所述EBs而产生的 集落进行化学解离。可以使用可选的化学方法以及与使用酶相组合的化学方法。 同样，酶可以单独使用或者与机械方法组合使用。任选地，酶是Accutase^TM。

目的是得到可以进一步增殖的单个神经祖细胞群体。发现该方法可选择性 地收集神经祖细胞。这是1×PBS(无Ca，Mg)，pH 7.4的新特征并且以前没有 描述过。其它细胞类型没有有效地脱离平板并且没有在随后的研磨步骤中收集。 图13表明神经祖细胞形态学改变/脱离平板的时间进程。

过程包括在吸掉细胞培养基后使用1×PBS(无Ca，Mg)，pH 7.4的短暂洗 涤。以6-孔平皿的每一孔1ml1×PBS(无Ca，Mg)，pH 7.4覆盖集落。将平皿 在无菌细胞培养箱内室温孵育最少30分钟，可选90分钟一直到最大2小时。 60分钟后，包含神经祖细胞的集落开始从平板上脱落(见图13)。通过试着轻轻 研磨细胞确定收获细胞的最佳时间点(通常90分钟)。如果使用温和研磨没有将 细胞脱离平板，则将细胞进一步与1×PBS(无Ca，Mg)，pH 7.4孵育。一旦细 胞容易地脱落，则进一步研磨细胞(任选5-10×)，这产生几乎单一的细胞悬浮 液。呈现扁平形态并且非神经命运的细胞仍然附着在平板上。将细胞悬浮液转 移至圆锥形的15mL管中并且以300×g离心5分钟。在将细胞重悬于1ml包 含bFGF(10ng/mL)的mTeSR1-F 270mOsm/kg后，将单个6孔板孔的细胞平 板接种于每孔包含3个玻璃载玻片(12mm直径)的预包被的聚-L-鸟氨酸/层粘连 蛋白的6-孔平皿上(见实施例18)。每隔一天更换一次培养基。在这些培养条件 下，细胞将保持不分化达至少3代，可选更多代(见实施例16)，并且还使用实 施例16中所述的方法被进一步处理，进行免疫染色以鉴定神经祖细胞。使用1 ×PBS(无Ca，Mg)，pH 7.4进行脱离是极其有效的并且是神经玫瑰花状结构选 择性的，并且消除了在步骤中同时收集污染性非神经细胞。图14显示平板接种 后3、6和12天后所接种的神经祖细胞，图15显示在细胞平板接种后第6天时 针对神经细胞标志物巢蛋白和Sox1开展的免疫细胞化学染色。

最初接受培养基mTeSR1-F 270mOsm/kg并且使用1×PBS(无Ca，Mg)， pH 7.4解离成神经祖细胞的人ESCs产生对巢蛋白和Sox1共染色的典型玫瑰花 状结构。

从如实施例6、7和13所述最初形成并培养于mTeSR1-F 340mOsm/kg 中的贴壁EB集落不能得到共表达Sox1和巢蛋白的神经祖细胞。

为了总结培养基重量克分子渗透压浓度对胚层诱导，特别是随后是选择神 经祖细胞的外胚层命运诱导的影响，实施例12和13清楚地证明，用于EB形 成和培养的培养基的重量克分子渗透压浓度支配人多能干细胞在它们向成熟细 胞类型分化中所采取的胚层命运。实施例14显示，在260-280mOsm/kg范围重 量克分子渗透压浓度的培养基中得到的那些神经祖细胞可以选择性地传代，并 且不能从在mTeSR1-F 340mOsm/kg中产生和生长的EB得到，这再次强调不 同重量克分子渗透压浓度对细胞命运决定的影响。

实施例15.通过机械选择过程从神经玫瑰花状结构选择神经祖细胞

为了得到高度纯的神经祖细胞群体，从贴壁的EB集落(如在实施例11中 产生)人工分离神经玫瑰花状结构。为此，使用与注射器相连的弯曲的26-号针。 通过使用针从聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白基质切下存在许多玫瑰花状结构的区域， 并用200μl移液管吸头将它们移出平皿而分离玫瑰花状结构。将它们转移至无 菌的1ml管中。在将切下的全部玫瑰花状结构混合后，用200μl移液管吸头 机械性地将它们分散并且平板接种于聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被平皿上(实施 例18)。将从2-3个单个6孔板孔分离的玫瑰花状结构平板接种于一个6孔板孔 中。该过程产生高度纯的神经祖细胞群体，在将它们平板接种于聚-L-鸟氨酸/ 层粘连蛋白(见实施例18)包被的平板上后1天形成如图16中所示的包含玫瑰花 状结构的小的团块。然后根据实施例16中所述方法可将这些团块内的神经祖细 胞进一步传代并维持。

实施例16.神经祖细胞传代方法

可利用不同方法将神经祖细胞传代。下面使用的方法以一致的方式工作产 生神经细胞的单细胞悬浮液。当来自以上实施例14或15的培养的神经祖细胞 达到80-90％汇合(3-4天后)时，通过短时间接触0.5％胰蛋白酶-EDTA (STEMCELL TECHNOLOGIES INC.目录号07910)将神经祖细胞传代。每3-4 天进行传代一次并且概述如下。对于该步骤，吸掉培养基并用1×PBS(无Ca， Mg)，pH 7.4洗涤细胞一次。在吸掉PBS之后，向6孔板孔中的神经祖细胞加 入500-600μl的0.5％胰蛋白酶-EDTA。将平皿于37℃下孵育直到细胞开始从平 皿上脱离或者最长时间5分钟。通过加入等体积包含10％胎牛血清(STEMCELL  TECHNOLOGIES INC.目录号06902)的培养基或1×PBS(无Ca，Mg)，pH 7.4 将胰蛋白酶失活。使用5ml血清学移液管小心地研磨细胞。细胞悬浮液以300 ×g离心5分钟。吸掉上清液并且轻轻地拍打起细胞沉淀以移出细胞。加入500 μl新鲜培养基(mTeSR1-F 270mOsm/kg+10ng/ml bFGF)并且使用1000μl移 液管吸头研磨细胞2-4次。将细胞以1∶3至1∶6的比率分离。每隔一天更换 一次培养基。图17显示平板接种后2天第1代的传代神经祖细胞。

实施例17.通过基于标志物表达的免疫细胞化学鉴定在mTeSR1-F 270 和340mOsm/kg中诱导和生长的神经祖细胞

如实施例6、7、9、11和13所述，使用mTeSR1-F 270或340mOsm/kg 以不同程度诱导外胚层来源的祖细胞。分散的EBs(见实施例11和13)接种于每 孔(以聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被)包含3个玻璃盖玻片(VWR microcoverglass， 目录号89015724)的6孔板孔上。为了评价外胚层祖细胞以及因此评价神经祖细 胞的百分数，针对神经标志物开展免疫细胞化学(图11)。还研究了选择和增殖 (实施例14、15和16；图14和17)之后神经祖细胞的出现。将细胞进行平板接 种后任选地2天，用1×PBS(无Ca，Mg)，pH 7.4洗涤细胞一次并用4％多聚 甲醛室温固定20分钟。用1×PBS(无Ca，Mg)，pH 7.4洗涤盖玻片2次并于4 ℃下将盖玻片储存于1×PBS(无Ca，Mg)，pH 7.4中直到开展免疫细胞化学。

在开展免疫细胞化学当天，用室温1×PBS(无Ca，Mg)，pH 7.4短暂洗涤 细胞。室温下应用由10％正常驴血清(Jackson Immunoresearch Laboratories，目 录号017000121)和0.2％Triton X(Sigma，目录号T9284)的封闭溶液1小时， 同时轻轻摇动。随后，加入包含合适浓度(见下)抗体和2％正常驴血清的一级抗 体溶液室温1小时。

抗体针对Sox1(山羊α-Sox1，1∶200，Neuromics，目录号GT15208)和巢 蛋白(小鼠α-巢蛋白，1∶3000，Millipore，目录号MAB5326)以鉴定早期胚胎 外胚层。在与一级抗体孵育之后，用1×PBS(无Ca，Mg)，pH 7.4室温洗涤细 胞3×15分钟，同时轻轻摇动。使用在驴中产生的抗一级抗体来源物种的、与 FITC(α-小鼠)(Jackson Immunoresearch Laboratories，目录号715095150；1∶500) 或德克萨斯红(α-山羊)(Jackson Immunoresearch Laboratories，目录号 705075003；1∶500)缀合的二级抗体，通过30分钟的孵育步骤检测一级抗体。 为了洗掉非特异性结合，使用1×PBS(无Ca，Mg)，pH 7.4洗涤细胞3次。为 了封装盖玻片，将盖玻片短暂地浸泡在蒸馏水中。向盖玻片上加入一滴包含 DAPI(Vector laboratories，目录号H-1500)的封装溶液，细胞面朝下，将盖玻片 封装在玻璃载玻片上(Corning microslides，目录号2947)。当封装的盖玻片在玻 璃载玻片上完全干燥后，在荧光显微镜下使用对每一荧光团合适的滤镜肉眼观 察免疫荧光。在包含神经玫瑰花状结构的细胞中观察到巢蛋白和Sox1共表达， 所述细胞如图8中所示在mTeSR1-F 270mOsm/kg中诱导和培养。图11显示 与在mTeSR1-F 340mOsm/kg培养的神经祖细胞相比，在mTeSR1-F 270 mOsm/kg培养的神经祖细胞中巢蛋白和Sox1的共表达。在mTeSR1-F 340 mOsm/kg中诱导的贴壁EB集落和神经祖细胞显示该两种标志物总体上染色较 少。

实施例18.以聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被平皿

在所有先前所述的使细胞或EBs附着于培养器皿的实施例中，在培养前制 备细胞外基质或者基质组合。例如，塑料聚苯乙烯细胞培养皿以及位于24-孔板 单个孔内或者作为一式三份位于单个6孔板孔中的玻璃盖玻片，任选地用聚-L- 鸟氨酸/层粘连蛋白包被。简言之，塑料培养皿或者盖玻片用聚-L-鸟氨酸 (Sigma，目录号P4957)任选地室温包被过夜，至少2小时。用室温1×PBS(无 Ca，Mg)，pH 7.4洗涤平皿2次。第三次洗涤由无菌蒸馏水或者DMEM/F12组 成。5μg/ml浓度的层粘连蛋白(Sigma，目录号L2020)溶解在冰冷的DMEM/F12 中。在从平皿中吸掉水或DMEM/F12后，使用冰冷的血清学移液管加入层粘连 蛋白溶液。对于单个6孔板孔使用1ml或者对于单个24孔板孔的孔使用500μl。 将平板置于37℃下任选地12小时，至少2.5小时。在平板接种细胞之前，丢掉 层粘连蛋白溶液并加入培养基。

实施例19：神经祖细胞向神经元的分化以及对它们的检测

通过从mTeSR1-F 270mOsm/kg培养基撤掉bFGF并加入因子例如但不 限于GDNF、cAMP启动神经祖细胞的分化。用该培养基孵育细胞最少5天。 培养基每2天更换一次。图18显示被成熟神经元标志物TUJ1染色(对于免疫细 胞化学染色方法，见实施例17)的神经元。神经元可以仅衍生自如实施例7、9 和11所述的使用mTeSR1-F 270mOsm/kg最初诱导成为Ebs的hESC(图18 左侧)，并不是衍生自如实施例7和13所述使用mTeSR1-F 340mOsm/kg最 初诱导成为Ebs的hESC(图18右侧)。

实施例20.人多能干细胞在BD Matrigel^TM包被上于成分确定的无血清培 养基中培养成为聚集体

人多能细胞维持在BD Matrigel^TM包被平皿上在成分确定的无血清培养基 中。详细的方案可以在STEMCELL TECHNOLOGIES INC公司的用于维持人多 能干细胞的手册#29106“Maintenance of hESCs AND hiPSCs in mTeSR1 and TeSR^TM2(hESC和hiPSC在mTeSR1和TeSR^TM2中维持)”中找到，其包括 用于BD Matrigel^TM包被的过程。在该实例中描述的用于细胞传代的过程应用于 人胚胎干细胞系H1和H9以及用于人诱导性多能干细胞系4D1中。当集落变 大、开始汇合和具有与其边界相比致密和相亮中心(见图1)时将细胞传代。取决 于所接种聚集体的大小和密度，在最初接种后5-7天将培养物传代。

从干细胞培养物中吸掉培养基并将细胞用DMEM/F-12(2mL/孔)洗涤。以 1mg/mL浓度，每孔加入1mL分散酶(STEMCELL TECHNOLOGIES INC.目 录号07923)。将平皿置于37℃下7分钟。

一旦集落边缘出现轻微的回折，则去除分散酶，并且每个孔用2mL DMEM/F-12/孔轻轻洗涤2-3次以去掉任何残留的分散酶。向孔中加入2mL/孔 DMEM/F-12或mTeSR1，并且用细胞刮(例如Corning目录号3010)或者血清 学移液管吸头刮下集落。

将脱落的细胞聚集体转移至15mL圆锥形管中并将孔用另外2mL DMEM/F-12洗涤以收集任何残留的聚集体。将包含残留细胞的洗涤培养基加入 到同一15mL管中。

将包含聚集体的15mL管于室温(15-25℃)以300×g离心5分钟。吸掉上 清液。对于在15mL管中收集的每孔的hESC聚集体，加入1-2mL的mTeS1。 通过使用P1000微量移液器轻轻地上下吹吸(1-2次)将沉淀物重悬。细胞保持为 聚集体。使用“团块计数”法估计团块的数量。为了计数合适大小(直径～50-60 μm)的可能附着且生长的团块，使用置于显微镜目镜中的测微尺。为了进行团 块计数，将30μL的DMEM/F-12等分入96-孔平底板的2个孔中。在这些孔底 部的中心画上“+”以充当计数栅。向每一孔中加入5μL新鲜混合的团块悬浮 液。对大约3500μm²或更大的团块一式两份计数。这相当于直径大约60μm的 团块。使用公式估计每μl的团块总数：

每μl的团块总数＝计数的团块x/5μL悬浮液总体积。

根据接种的孔或平皿的大小将确定数目的团块进行平板接种。为了确保合 适接种密度，使用表1中的指导计算用于接种新平皿的团块悬浮液体积(y)。例 如对于6孔板孔的(y)等于：350/每μl计数的团块数。

用BD Matrigel^TM包被的新的每6孔板孔2mL mTeSR1进行人多能干细胞 聚集体平板接种。将板数次快速、短暂、前后和左右移动以便将细胞均匀分散 在孔表面上。将板置于37℃培养箱中。上面的方案应用于H1、H9和4D1细胞 并且细胞用作本公开所述实施例的持续的细胞来源。

图19显示培养第5天未分化的H1hESC(A)和4D1iPSC(B)。

实施例21.人多能干细胞在BD Matrigel^TM包被的成分确定的无血清培养 基中作为单细胞的培养

人多能干细胞维持在BD Matrigel^TM包被6-孔平皿上在成分确定的无血清 培养基例如mTeSR1中。在该实例中，人胚胎干细胞系H9细胞作为单细胞 培养并且这些细胞用于实施例37中。基于细胞集落的汇合确定传代时间。在上 次传代后培养5-6天细胞集落达到大约70％汇合(图20A)。

为了将细胞传代，从干细胞培养物中吸掉培养基并将细胞用DMEM/F-12(2 mL/孔)洗涤。每孔加入1mL Accutase(STEMCELL TECHNOLOGIES INC.目 录号07920)。将平皿置于37℃下8-10分钟直到所有细胞脱离。

向Accutase中加入5ml DMEM/F-12并且使用5mL血清学移液管将细胞 聚集体解离成单细胞悬浮液。将细胞转移至15mL圆锥形管中并将孔用另外2 mL DMEM/F-12洗涤以收集任何残留的细胞。将包含残留细胞的洗涤培养基加 入到同一15mL管中。

将包含单细胞悬浮液的15mL管于室温(15-25℃)以300×g离心5分钟。 吸掉上清液。从每一孔收集然后转移至15mL管中的干细胞常规重悬于1-2mL mTeS1中。通过使用P1000微量移液器轻轻地上下吹吸(1-2次)将沉淀物重悬。 通过将10μL细胞悬浮液样品在90μL台盼蓝(Invitrogen，目录号15250061) 中以1∶10稀释并在血球计数器上计数未染色的细胞，使用标准技术计数活细 胞。根据每μl的细胞数计算用于向新鲜Matrigel^TM包被的6-孔平皿接种的细胞 体积。将细胞以3×10³-5×10³个细胞每cm²的密度进行平板接种，使用终浓度 10μg/mL的Y27632ROCK抑制剂(STEMCELL TECHNOLOGIES INC.目录号 07171/2)以提高平板接种后的细胞存活(Watanabe等，2007)，或者在不含Y27632 情况下细胞以2×10⁴-5×10⁴每cm²的密度进行平板接种。图20(C)显示以2 ×10⁴每cm²的密度平板接种的接种后1天的多能干细胞(H9)。

实施例22.在BD Matrigel^TM上在mTeSR1中作为聚集体或单细胞生长 的人多能干细胞系多能性的形态学评价

为了能成功诱导胚层，使用了高纯度的多能干细胞群体。对于以下实施例， 使用人胚胎干细胞系H1、H9和人诱导性多能细胞系4D1。采用下列标准以评 价细胞的形态学和质量(描述于STEMCELL TECHNOLOGIES INC.的技术手册 #29106中)：如图1和19中所示，未分化的人多能干细胞生长成为紧密的多细 胞集落。它们表现出高的核质比和突出的核仁。这些集落的特征在于具有清晰 的边界。健康的hPSC(和iPSC)集落在中心是多层的，导致当在相差下观察时为 相亮细胞的团块。分化的特征在于边界完整性的丧失、集落内具有肉眼可见上 不均匀细胞形态和明显交替细胞类型的出现。通过在显微镜下观察集落(使用4 ×和10×物镜)估计显示为未分化细胞类型的集落百分数。为了有效诱导胚层， 除实施例37外，下列实施例使用表现出小于15％的集落分化的培养物，在实施 例37中，使用具有40-50％分化的培养物。

评价多能性的标准用于作为聚集体培养的人多能干细胞(实施例20)以及作 为单细胞培养的细胞(实施例21)。

实施例23.具有不同重量克分子渗透压浓度范围的培养基配方：270 mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的无因子mTeSR1培养基

完全培养基配方和制备改良TeSR(mTeSR1，STEMCELL TECHNOLOGIES INC.，目录号05850)的方法公布于Ludwig等，Nature Methods 3(8)：637，2006中。其基于在Ludwig等，Nature Biotechnology 24(2)：185， 2006中公布的原始TeSR配方，具有下列修改：以牛血清白蛋白(BSA)替代人 血清白蛋白(HSA)。

为了制备无因子mTeSR1(mTeSR1-F)培养基，产生包含5倍浓度所有 mTeSR1试剂的5×补充物，除了下列5种因子之外：GABA、哌啶酸(pipecolic  acid)、bFGF、TGFβ1、氯化锂。培养基的成分示于表2中。

在将5×补充物的成分混合在一起后，通过加入10N NaOH将pH调至7.4。 使用标准的渗透压计测量溶液的重量克分子渗透压浓度。5×补充物的最初重量 克分子渗透压浓度通常大约100mOsm/kg，并且当考虑到为得到mTeSR1-F 而将5×补充物与400mL基础培养基DMEM/F12(Hyclone，目录号SH30004) 结合时则使用盐(NaCl)增加重量克分子渗透压浓度。必须向5×补充物加入的盐 的量使用下列公式计算：为了在将5×补充物和基础培养基混合后得到270的 重量克分子渗透压浓度：

[270-((0.8×300mOsm)+(0.2×100mOsm))]/2000×58.44×1.05＝ 0.30g/L NaCl

x量的NaCl加入到5×补充物中以得到mTeSR1-F 270mOsm/kg。

实施例24.为了在AggreWell^TM800中形成EB，产生人多能细胞的单细胞 悬液

从人多能干细胞集落产生单个细胞以及在AggreWell^TM800方案和装置中 使用它们的过程描述于技术手册29146(STEMCELL TECHNOLOGIES INC.) 中。解离成单细胞悬浮液并用于在下列实施例中中在AggreWell^TM800中建立 EBs的人多能干细胞系是人胚胎干细胞系H1、H9和诱导性多能干细胞系4D1。 如何从多能干细胞得到单细胞悬浮液的细节描述于实施例6中。在该实施例中， 用于重悬细胞的培养基是mTeSR1-F 270mOsm/kg(见实施例23)。在 AggreWell^TM800中建立EB描述于下列实施例中。

实施例25.使用微孔装置(AggreWell^TM800)在270mOsm/kg重量克分子渗 透压浓度的mTeSR1-F中从人多能干细胞形成EB并且随后在同一培养基中 悬浮培养

人多能干细胞的单细胞悬浮液(在该实施例中使用人诱导性多能干细胞系 4D1)如实施例24中所述得到。在这里，在AggreWell^TM800中产生每个EB有 2000个细胞大小的EBs。通常，范围从1000个细胞至20000个细胞大小的EBs 可以在AggreWell^TM800中产生。如实施例7中所述制备平板。与AggreWell^TM400 孔相比，AggreWell^TM800平板的单个孔包含大约300个微孔。如表3中所示， 需要向平板的每一孔中加入600,000个细胞以便在AggreWell^TM800中得到具有 2,000个细胞的EBs。在实施例22中产生的包含600,000个细胞的单细胞悬浮 液的体积基于所得到的细胞计数(对于细胞计数见实施例6)确定。向先前准备的 AggreWell^TM800平板的每一孔中加入该体积(见实施例7)。在该实施例中使用的 培养基是具有270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F。将细胞悬 浮液分配在AggreWell^TM800平板的～300个微孔中。加入培养基至每孔2mL 的终体积。将AggreWell^TM800平板以100×g离心3分钟以收集微孔内的细胞。 将平板于37℃、5％CO₂和95％湿度下孵育24小时。

24小时后，通过用1mL一次性移液管吸头轻轻上下吹吸AggreWell^TM800 微孔内的培养基2-3次以移出大部分的Ebs来收集Ebs。为了收集Ebs，将悬浮 液通过置于50mL圆锥形管顶部的反向40μm尼龙细胞滤网(Falcon)以去除单 个细胞和碎片。每次用1mL的DMEM/F-12进一步洗涤AggreWell^TM800表面 5-10次，吹吸整个表面以脱离所有聚集体。将所有洗涤物加到细胞滤网膜上。 将细胞滤网翻转，保持靠近低附着6孔板孔上方。使用mTeSR1-F 270 mOsm/kg培养基将Ebs从膜上洗下。使用大约5ml的培养基以从尼龙膜上移除 Ebs，将滤网置于6-孔超低附着平皿(STEMCELL TECHNOLOGIES INC.，目录 号27145)的单个孔上。将Ebs在标准组织培养箱中于37℃、5％CO₂和95％湿 度下孵育5天，每2-3天更换一次培养基。为此，将平皿向一侧倾斜并且使用 1000-μl移液管吸头去除大约一半体积的培养基，而不扰动Ebs。加入新鲜的培 养基至5ml。图21显示收集前24小时后从AggreWell^TM800板微孔内的4D1多 能干细胞产生的EBs(4×和10×放大倍数)和以2×和10×放大倍数显示悬浮培 养2天和4天后释放的EB。

实施例26.使用微孔装置(AggreWell^TM800)在270mOsm/kg重量克分子 渗透压浓度mTeSR1-F中从人多能干细胞形成EB，随后悬浮培养，接着平 板接种EBs以得到神经外胚层

如实施例24中所述从人诱导性多能干细胞系4D1得到单细胞悬浮液，并 且如实施例25中所述在AggreWell^TM800中在270mOsm/kg重量克分子渗透压 浓度的mTeSR1-F中建立EBs并悬浮培养。5天后将EBs平板接种于聚-L-鸟 氨酸/层粘连蛋白包被的6-孔板上(对于平板包被见实施例18并且对于EBs解离 和随后解离EBs的平板接种见实施例11)。平板接种后3天，使用实施例12的 方法评价外胚层的出现。图22显示贴壁的平板接种的EBs中的神经玫瑰花状 结构，所述EBs从人诱导性干细胞系4D1以为每EB 2000个细胞形成。

实施例27.在包含270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F 或者340mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的mTeSR1的微孔装置 (AggreWell^TM800)中从人多能干细胞诱导神经外胚层，然后在同一培养基中培 养并平板接种EBs

如实施例24所述从人诱导性多能干细胞系4D1和人胚胎干细胞系H9得到 单细胞悬浮液。除了使用两种不同的培养基：具有270mOsm/kg和340mOsm/kg 重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F之外，如实施例25中所述在 AggreWell^TM800中建立EBs。使用表3中的计算结果，在两种培养基中从4D1 细胞建立成每EB有2000个细胞大小的EBs。使用实施例24和25的方法和表 3中提供的用于EB大小的计算结果，在两种培养基：具有270mOsm/kg和340 mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F中从H9细胞建立5000个细胞 大小的EB。如实施例25中所述，24小时后从微孔装置收集EBs，与所述方案 不同的是对于每个EB包含5000个细胞的EBs使用不同技术来从微孔脱离EBs。 为了脱离大于3000个细胞的EBs，使用大孔的移液管吸头(例如Rainin目录号 HR-1000WS)或者移液管吸头已经在无菌条件下剪掉以增加孔大小的常规1000 μl一次性移液管吸头。此外，为了提高来自AggreWell^TM800孔的Ebs回收率， 使用常规1000μl一次性移液管吸头脱离EBs并且使用更宽(剪切)移液管吸头将 EBs收集在细胞滤网上(见实施例25)。

如实施例25中所述将EBs悬浮培养并在5天后平板接种于聚-L-鸟氨酸/层 粘连蛋白包被6-孔板上(对于平板包被见实施例18并且对于EBs的平板接种见 实施例11)。平板接种后4至5天，使用实施例12的方法评价外胚层的出现。 图23显示在两种培养基中从两种细胞系(H9A-D，4D1E-H)形成的贴壁平板接 种的EBs中的神经玫瑰花状结构。根据经验性目测，与具有340mOsm/kg重量 克分子渗透压浓度的mTeSR1-F相比，在具有270mOsm/kg重量克分子渗透 压浓度的mTeSR1-F培养基中存在明显更多的神经玫瑰花状结构。如实施例 12中所述对神经玫瑰花状结构评分(在第4天时对4D1贴壁EBs评分，在第5 天时对H9贴壁EBs评分)，并且显示与具有340mOsm/kg重量克分子渗透压浓 度的mTeSR1-F相比，在具有270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的 mTeSR1-F中更高百分比的含有神经玫瑰花状结构的集落(集落表现出神经玫 瑰花状结构覆盖面积超过50％)。图23中还指明了评分结果。

实施例28.在微孔装置(AggreWell^TM400)中在具有270mOsm/kg重量克 分子渗透压浓度的mTeSR1-F中连续培养不同大小的EBs 5天以诱导外胚层 如实施例6种所述从人胚胎干细胞系H9得到单细胞悬浮液。除了仅使用 270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F之外，如实施例7中所述 建立EBs。形成了不同大小的EBs：500个细胞、1000个细胞和2000个细胞。 根据细胞计数和表3中给出的数目计算加入至AggreWell^TM400孔的单细胞悬浮 液体积。在该实施例中，将Ebs留在微孔中最长达11天，而不是24小时后从 AggreWell^TM400板收集Ebs(见实施例9)。通过使用配备一次性1mL移液管吸 头的微量移液器从各个AggreWell^TM400孔移除大约1.5mL培养基而每天更换 培养基。将预温的(37℃)新鲜mTeSR1-F 270mOsm/kg培养基缓慢加入到孔 中，由此保证不扰动微孔内的EBs。

实施例29.使用微孔装置(AggreWell^TM400)在270mOsm/kg重量克分子 渗透压浓度的mTeSR1-F中从人多能干细胞诱导神经外胚层以产生不同大小 的EB，在相同装置中培养EBs并将EBs平板接种

如实施例27中所述，从人胚胎干细胞系H9建立不同大小的EBs(500、1000 和2000个细胞每EB)。将EBs在微孔装置AggreWell^TM400中在mTeSR1-F 270mOsm/kg中培养5天。为了释放EB以便将其进行平板接种，使用实施例9 中描述的一些方法，除了EBs没有平板接种于超低附着平板上而是直接接种在 以聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的6-孔板上(见实施例18)之外。使用2mL培养 基将EBs从细胞滤网(Falcon)上洗下(见实施例9)。将6-孔板以向后和向前的方 式摇动以在表面上均匀分布EBs。在形态学评价之前，将板置于培养箱中37℃、 5％CO₂和95％湿度下至少2天。如实施例12中所述对代表外胚层的神经玫瑰 花状结构进行形态学评价。图24显示平板接种后1天不同大小的贴壁EBs(500 个细胞每EB(A、B)、1000个细胞每EB(C、D)、2000个细胞每EB(E、F))。 对于本领域技术人员来说，在所有贴壁EBs中以几乎100％的程度出现神经玫 瑰花状结构。

实施例30.利用在微孔装置(AggreWell^TM400)中EB的形成和连续培养以 及随后将EBs进行平板接种以诱导外胚层，与340mOsm/kg重量克分子渗透 压浓度的mTeSR1-F相比，在270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的 mTeSR1-F中，从人多能干细胞高效率地诱导神经外胚层

如实施例7中所述，在AggreWell^TM400中从人胚胎干细胞系H9形成和培 养EBs。在该实施例中使用的培养基是具有270和340mOsm/kg重量克分子渗 透压浓度的mTeSR1-F。建立了两种不同大小的EBs：500个细胞每EB和2000 个细胞每EB。在微孔装置中培养EBs 5天，然后如实施例29中所述进行平板 接种。图25显示以两种不同大小在两种培养基中平板接种第2天的EB的形态 以及评分结果(包含玫瑰花状结构的面积＞50％的集落)。结果表明，在270 mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F中从人多能干细胞诱导神经外 胚层比在340mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F中更有效。

实施例31.在微孔装置(AggreWell^TM800)内在具有270mOsm/kg重量克 分子渗透压浓度的mTeSR1-F中连续培养不同大小的EBs 5天以诱导外胚层

如实施例24中所述从人胚胎干细胞系H9得到单细胞悬浮液。除了仅使用 270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F之外，如实施例25中所述 建立EBs。在AggreWell^TM800中形成不同大小的EBs：2000个细胞、5000个 细胞、10000个细胞、15000个细胞和20000个细胞。加入到AggreWell^TM800 孔内的单细胞悬浮液体积是根据细胞计数和表3中给出的数目计算的。在该实 施例中，将EBs留在微孔中最长达11天，而不是24小时后从AggreWell^TM800 板收集EBs。通过使用配备一次性1mL移液管吸头的微量移液器从各个 AggreWell^TM800孔移除大约1.5mL培养基而每天更换培养基。将预温的(37℃) 新鲜mTeSR1-F 270mOsm/kg培养基缓慢加入到孔中，由此保证不扰动微孔 内的EBs。

实施例32.使用微孔装置(AggreWell^TM800)在具有270mOsm/kg重量克 分子渗透压浓度的mTeSR1-F中从人多能干细胞诱导神经外胚层以形成EB， 在相同装置中培养EB，随后将EB平板接种

如实施例31中所述，从人胚胎干细胞系H9建立不同大小的EBs。将EBs 在微孔装置AggreWell^TM800中在mTeSR1-F 270mOsm/kg中培养5天。为了 释放EB以便将其进行平板接种，使用实施例27中描述的一些方法用于大于每 EB 3000个细胞的EBs，除了EBs没有平板接种于超低附着平板上而是直接接 种在以聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的6-孔板上(见实施例18)之外。使用2mL 培养基将EBs从细胞滤网(Falcon)上洗下。将6-孔板以向后和向前的方式摇动 以在表面上均匀分布EBs。在形态学评价培养物之前，将板置于培养箱中37℃、 5％CO₂和95％湿度下至少2天。如实施例12中所述对代表外胚层的神经玫瑰 花状结构进行形态学评价。图26显示释放和平板接种EB前第5天时 AggreWell^TM800微孔内不同大小的贴壁EBs。图27显示平板接种后1天的EBs。 根据经验性目测，以几乎100％的程度出现神经玫瑰花状结构，表明当使用不同 数量的人多能干细胞用于EB形成以及在微孔内连续培养时，mTeSR1-F 270 mOsm/kg可以非常高效地在AggreWell^TM800中诱导神经外胚层。

实施例33.利用在微孔装置(AggreWell^TM800)中EB的形成和培养，与具 有340mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F相比，在具有270 mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F中从人多能干细胞高效率地 诱导神经外胚层

如实施例31中所述，在AggreWell^TM800中从人胚胎干细胞系H9形成和 培养EBs。在该实施例中使用的培养基是具有270和340mOsm/kg重量克分子 渗透压浓度的mTeSR1-F。建立了两种不同大小的EBs：2000个细胞每EB 和5000个细胞每EB。在微孔装置中培养EBs 5天，然后如实施例31中所述进 行平板接种。图28显示平板接种第2天的EBs的形态。结果表明，在具有270 mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F中从人多能干细胞诱导神经外 胚层比在具有340mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F中更有效。

实施例34.具有不同重量克分子渗透压浓度范围的培养基配方：具有400 mOsm/kg和450mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的无因子mTeSR1培养基 完全培养基配方和制备改良TeSR(mTeSR1，STEMCELL TECHNOLOGIES INC.，目录号05850)的方法公布于Ludwig等，Nature Methods 3(8)：637，2006中。其基于在Ludwig等，Nature Biotechnology 24(2)：185， 2006中公布的原始TeSR配方，具有下列修改：以牛血清白蛋白(BSA)替代人 血清白蛋白(HSA)。

为了制备无因子mTeSR1(mTeSR1-F)培养基，产生包含5倍浓度所有 mTeSR1试剂的5×补充物，除了下列5种因子之外：GABA、哌啶酸(pipecolic  acid)、bFGF、TGFβ1、氯化锂。培养基的成分示于表2中。

在将5×补充物的成分混合在一起后，通过加入10N NaOH将pH调至7.4。 使用标准的渗透压计测量溶液的重量克分子渗透压浓度。5×补充物的最初重量 克分子渗透压浓度通常大约100mOsm/kg，并且当考虑到为得到mTeSR1-F 而将5×补充物与400mL基础培养基DMEM/F12(Hyclone，目录号SH30004) 混合时则使用盐(NaCl)增加重量克分子渗透压浓度。必须向5×补充物加入的盐 的量使用下列公式计算：例如为了在将5×补充物和基础培养基混合后得到400 的重量克分子渗透压浓度：

[400-((0.8×300mOsm)+(0.2×100mOsm))]/2000×58.44×1.05＝4.3g/L of NaCl

x量的NaCl加入到5×补充物中。

制备两种具有不同重量克分子渗透压浓度的培养基：400mOsm/kg和450 mOsm/kg。

实施例35.在AggreWell^TM400中，与具有320、340、400和450mOsm/kg 重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F相比，在具有270mOsm/kg重量克分子 渗透压浓度的mTeSR1-F中从人多能干细胞高效率地诱导神经外胚层

在实施例6说明从H9hESC得到单细胞悬浮液。如实施例7中所述在 AggreWell^TM400中形成EBs。所使用的用于建立EB的培养基是具有270(实施 例23)、320、340(实施例5)、400和450mOsm/kg(实施例34)重量克分子渗透 压浓度的mTeSR1-F。还向培养基中加入Y27632ROCK抑制剂至终浓度10 μg/mL以在EB形成过程中提高细胞存活。建立具有每一EB有2000个细胞大 小的EBs，并且在24小时后解离(见实施例9)并悬浮培养直到通过研磨进行平 板接种(见实施例11)或者留在AggreWell^TM平板中5天然后进行平板接种(见实 施例29)。

图29显示除了在mTeSR1-F 450mOsm/kg培养基中之外，在不同培养基 中2天后的EB附着。在第1天时显示在该培养基中形成的EBs。在具有270 重量克分子渗透压浓度的培养基中玫瑰花状结构百分数最高(100％)，在320和 340重量克分子渗透压浓度的培养基中玫瑰花状结构百分数降低并且在400和 450mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的培养基中没有观察到玫瑰花状结构形 成。注意在高于340的重量克分子渗透压浓度时，在平板接种后观察到细胞脱 落和细胞死亡并且没有鉴定出形态学上不同的细胞类型。图30显示这两个实验 的评分结果。计数包含玫瑰花状结构的面积＞50％的集落以及所有的集落。显 示比率以及所得到的包含玫瑰花状结构的集落的百分数。在第1天目检450 mOsm/kg条件没有显示出任何玫瑰花状结构。

实施例36.利用在微孔装置(AggreWell^TM800)中的EB形成和培养，与具 有340mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F相比，在具有270 mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F中，作为单细胞培养物维持的 人多能干细胞的高效率的神经外胚层诱导

如实施例21中所述，将人胚胎干细胞系H9在培养中作为单细胞在第51 代和第55代之间(p51至p55)传代4次。如实施例24中所述在第55代时得到 的H9单细胞悬浮液用于在AggreWell^TM800中形成EB。如实施例31和32中 所述形成并收集EBs。图31显示与mTeSR1-F 340mOsm/kg(B)相比，在 mTeSR1-F 270mOsm/kg(A)中更有效地形成神经玫瑰花状结构。这表明具有 270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的培养基可以在作为聚集体或者单细胞培 养的人多能干细胞中有效地诱导神经外胚层。

实施例37.与mTeSR1-F 340mOsm/kg相比，使用包含mTeSR1-F 270mOsm/kg的微孔装置(AggreWell^TM800)从表现出高分化百分比的人多能 干细胞培养物有效诱导神经外胚层

从表现出40和50％之间分化的H9细胞培养物形成EBs。如实施例22中 所述，通过形态学评价细胞的分化。图32显示传代后培养第5天时第52代和 EB建立之前的H9细胞(H9p52)(A-D)。分化的区域用圈圈出。用于EB形成的 单细胞如实施例24中所述得到并且如实施例25中所述在AggreWell^TM800中形 成EB。如实施例31和32中所述培养EBs和平板接种。如实施例12中所述， 平板接种后2天对神经玫瑰花状结构进行形态学评价。图32还显示平板接种后 第2天时EBs形态以及评分结果(包含玫瑰花状结构的区域＞50％的集落)(E-H， 在mTeSR1-F 270mOsm/kg建立的EBs(E，F)；在mTeSR1-F 340mOsm/kg 中建立的EBs(G，H))。结果表明，在具有270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度 的mTeSR1-F中从人多能干细胞诱导神经外胚层比在具有340mOsm/kg重量 克分子渗透压浓度的mTeSR1-F中更有效，即使在开始群体中多能细胞百分 数小于85％时，这是对于本公开中所述所有其它实施例来说作为截断值使用的 包含未分化细胞的集落百分数。

实施例38.与mTeSR1-F 340mOsm/kg相比，使用包含mTeSR1-F 270 mOsm/kg的微孔装置(AggreWell^TM800)从人胚胎干细胞系H7有效诱导神经外 胚层

如实施例20中所述培养hESC系H7并传代。除了使用每个EB 5000个细 胞之外，如实施例30中所述，使用mTeSR1-F 270mOsm/kg或者mTeSR1-F 340mOsm/kg在AggreWell^TM800中从p38细胞形成EBs并培养。如实施例31 中所述，将EB从微孔释放并平板接种。图33显示平板接种后1天贴壁的EB。 如实施例12中所述，进行针对神经外胚层的存在的形态学评价。当与 mTeSR1-F 340mOsm/kg相比，EBs在mTeSR1-F 270mOsm/kg中形成和培 养时，出现更多的神经玫瑰花状结构。

实施例39.与Knockout^TM D-MEM 340mOsm/kg相比，使用微孔装置 AggreWell^TM400用于EB形成和培养，在Knockout^TM D-MEM 270mOsm/kg 中从人多能干细胞培养物有效诱导神经外胚层

如实施例28中所述，在AggreWell^TM400中从人胚胎干细胞系H9(p44)形 成EBs并培养。在该实施例中使用的培养基是如实施例5和22中所述使用氯 化钠调节的具有270或340mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的 Knockout^TM-D-MEM(Invitrogen批次10829-018)(Knockout^TM-D-MEM的标准 重量克分子渗透压浓度大约265mOsm/kg)。包含2000个细胞每EB的EBs在 Knockout^TM-D-MEM 270mOsm/kg和Knockout^TM-D-MEM 340mOsm/kg中形 成。EBs在AggreWell^TM400中培养5天，然后如实施例29中所述收集和平板 接种。图34显示平板接种EBs第2天的形态。通过鉴定玫瑰花状结构对平板 接种的EBs进行形态学评价显示，与具有340mOsm/kg重量克分子渗透压浓度 的Knockout^TM-D-MEM相比，在270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的 Knockout^TM-D-MEM中更有效地从培养的人多能干细胞诱导神经外胚层。在第 6天如实施例12中所述对神经玫瑰花状结构评分并将百分数示于图34中。结 果表明，与具有340mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的Knockout^TM-D-MEM相 比，具有270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的Knockout^TM-D-MEM在诱导神 经玫瑰花状结构方面更有效。因此，甚至在可选的培养基配方例如 Knockout^TM-D-MEM中采用270mOsm/kg的重量克分子渗透压浓度支持了来自 人多能干细胞的有效神经外胚层诱导。

实施例40.与340mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的Neurobasal^TM培养 基相比，使用微孔装置AggreWell^TM400用于EB形成和培养，从培养在270 mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的Neurobasal^TM培养基中的人多能干细胞培 养物有戏诱导神经外胚层

如实施例28中所述，在AggreWell^TM400中从人胚胎干细胞系H9(p44)形 成EBs并培养。在该实施例中使用的培养基是如实施例5和22中所述使用氯 化钠调节的具有270或340mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的Neurobasal^TM培 养基(Invitrogen Cat.No.21103049)(Neurobasal^TM培养基的标准重量克分子渗 透压浓度大约是220mOsm/kg)。2000个细胞每EB的EBs在Neurobasal^TM培养 基270mOsm/kg和Neurobasal^TM培养基340mOsm/kg中形成。EBs在微孔装置 中培养5天，然后如实施例29中所述平板接种。图35显示在第5天时 AggreWell^TM400板微孔内EBs形态和在其已收集和平板接种后2天EBs的形 态。在微孔中以及在贴壁EBs中，在Neurobasal^TM培养基270mOsm/kg中比在 Neurobasal^TM培养基340mOsm/kg中可见更多的玫瑰花状结构。结果显示在具 有270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的Neurobasal^TM中比在具有340 mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的Neurobasal^TM中更有效地从人多能干细胞诱 导神经外胚层。如实施例12中所述，在平板接种后第6天对玫瑰花状结构评分， 并且显示对于具有270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的Neurobasal^TM，更高 百分数的神经玫瑰花状结构。因此，具有270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度 的其它培养基配方也可用于有效诱导神经外胚层。

实施例41.与具有340mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F 相比，在具有270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F中从人多能 干细胞诱导神经外胚层更优，所述mTeSR1-F由两种不同批次的牛血清白蛋 白(BSA)制备

获得不同批次的BSA并用于制备用于诱导神经外胚层的培养基配方 mTeSR1-F 270mOsm/kg和340mOsm/kg。如实施例28和30中所述，使用 AggreWell^TM400或AggreWell^TM800，从人胚胎干细胞系H9(分别为p41、p45 和p44)产生每EB包含500、2000和5000个细胞的EBs。EB在AggreWell^TM400 (500个细胞/EB)或AggreWell^TM800(2000和5000个细胞/EB)中在mTeSR1-F (BSA批次2或批次3)270mOsm/kg或mTeSR1-F(BSA批次2或批次3)340 mOsm/kg中培养5天。使用在实施例29和31中所述的相同的方法释放EB并 平板接种。如实施例12中所述，通过鉴定神经玫瑰花状结构进行形态学评价。 图36显示平板接种后3天贴壁的EB。对于本领域技术人员显而易见的是，与 mTeSR1-F(BSA批次2或批次3)340mOsm/kg相比，在mTeSR1-F(BSA 批次2或批次3)270mOsm/kg中形成的玫瑰花状结构的数量更多，并且在该低 重量克分子渗透压浓度培养基中玫瑰花状结构在形态上更易辨别。此外，与包 含BSA批次3的mTeSR1-F 340mOsm/kg相比，在包含BSA批次3的 mTeSR1-F 270mOsm/kg中培养第3天的贴壁EB的评分显示神经玫瑰花状结 构百分数更高。因此，具有270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的培养基引起 有效的神经诱导和玫瑰花状结构形成。

实施例42.使用产生并培养不同大小EBs的AggreWell^TM400或800，在 包含BSA批次2的具有270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F 中从人多能干细胞有效且一致性地诱导神经外胚层

如实施例30中所述，在AggreWell^TM800中从人胚胎干细胞系H9(p44和 p53)形成不同大小(2000、5000和10000个细胞/EB)的EB。同样，如实施例28 中所述，在AggreWell^TM400中从人ESC系H1p59形成包含2000个细胞的EBs。 在这些AggreWell^TM微孔装置中在具有270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的 mTeSR1-F(包含BSA批次2)中培养EBs 5天。根据实施例29和31中所述的 方法释放EB进行随后的平板接种。如实施例12中所述，通过代表外胚层的神 经玫瑰花状结构的存在进行形态学评价。实际上100％的玫瑰花状结构存在于贴 壁EB培养物中。图37显示平板接种后2天不同大小的贴壁EB。这些结果清 楚地表明，在包含含有BSA批次2、具有270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度 的mTeSR1-F的AggreWell^TM800或AggreWell^TM400中形成和培养的EBs中 诱导神经外胚层高度有效和一致的(n＝20次实验)。

实施例43.使用产生和培养EBs的AggreWell^TM400，与mTeSR1-F 340 mOsm/kg相比，从在使用mTeSR1-F 270mOsm/kg的TeSR^TM2中培养的人 多能干细胞更佳有效地诱导神经外胚层

如实施例28中所述，2000个细胞每EB的EBs在AggreWell^TM400中从先 前培养并维持于TeSR^TM2(STEMCELL TECHNNOLOGIES INC.目录号05860) 的人胚胎干细胞系H9(p52)形成。EBs在包含具有270mOsm/kg或340mOsm/kg 重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F的AggreWell^TM400中形成并在微孔内培 养5天。释放EBs并将EBs平板接种的方法如实施例29中的方法。如实施例 12中所述通过代表外胚层的神经玫瑰花状结构的存在进行形态学评价。图38 显示附着后2天的贴壁EB。在较低重量克分子渗透压浓度(270mOsm/kg)的培 养基中培养的细胞比在高重量克分子渗透压浓度(340mOsm/kg)培养基中培养 的细胞产生更多的玫瑰花状结构。还在第2天将神经玫瑰花状结构评分并且百 分数在图38中给出。在270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的培养基中平板 接种的EBs包含90％的玫瑰花状结构，相比之下，在340mOsm/kg重量克分子 渗透压浓度的培养基中平板接种的EBs中包含18％的玫瑰花状结构。

实施例44.使用产生和培养EBs的AggreWell^TM400和AggreWell^TM800， 与340mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F相比，在具有270 mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F中，从TeSR^TM2培养的人多 能干细胞诱导神经外胚层(两种培养基包含BSA批次2)

在该实施例中，先前培养并维持于TeSR^TM2(STEMCELL  TECHNNOLOGIES INC.目录号05860)的人胚胎干细胞系H9(p64)用于产生 EB。如实施例28中所述，2000个细胞每EB的EBs在AggreWell^TM400中在具 有270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F(BSA批次2)或者 mTeSR1-F(BSA批次2)340mOsm/kg中形成并且在装置中培养5天。如实施 例30中所述，具有2000个细胞每EB大小的EBs也在AggreWell^TM800中在上 述两种培养基中形成并在装置中培养5天。释放并平板接种EB的方法如实施 例29和31中所述。如实施例12中所述通过代表外胚层的神经玫瑰花状结构的 存在进行形态学评价。图39显示从AggreWell^TM400或AggreWell^TM800释放并 平板接种2天的贴壁EBs。还在第2天针对神经玫瑰花状结构对EBs评分并且 百分数在图39中给出。在AggreWell^TM400或AggreWell^TM800中在270mOsm/kg 培养基中形成的EBs包含82-89％范围的玫瑰花状结构，在AggreWell^TM400或 AggreWell^TM800中在340mOsm/kg培养基中形成的EBs包含41-46％范围的玫 瑰花状结构。该结果证实，270mOsm/kg的重量克分子渗透压浓度有效地支持 神经外胚层诱导。

实施例45.与具有340mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的TeSR^TM2-F(包 含HSA)相比，使用产生并培养EBs的AggreWell^TM400，在具有270mOsm/kg 重量克分子渗透压浓度的TeSR^TM2-F(包含HSA)中从TeSR^TM2培养的人多能 干细胞高效率诱导神经外胚层

在该实施例中，先前已经培养并维持于TeSR^TM2(STEMCELL  TECHNOLOGIES INC.目录号05860)中的人胚胎干细胞系H9(p52)用于形成 Ebs。2000个细胞每EB的EBs在AggreWell^TM400中在具有270mOsm/kg或340 mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的TeSR^TM2-F(包含HSA)中形成并且在微孔中 培养5天，如实施例28中所述。释放并平板接种EB的方法如实施例29中所 述。如实施例12中所述通过代表外胚层的神经玫瑰花状结构的存在进行形态学 评价。图40显示附着后2天的贴壁EBs。较低重量克分子渗透压浓度培养基 (TeSR^TM2-F(包含HSA)270mOsm/kg)比高重量克分子渗透压浓度培养基 (TeSR^TM2-F(包含HSA)340mOsm/kg)包含更多的玫瑰花状结构。还在第2天对 EBs评分并且百分数在图40中给出。在较低重量克分子渗透压浓度(270 mOsm/kg)培养基中形成的EBs包含23％的玫瑰花状结构，在较高重量克分子渗 透压浓度(340mOsm/kg)培养基中形成的EBs包含5％的玫瑰花状结构。 总之，结果表明，当在270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F 或者270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的TeSR^TM2-F中培养时，先前培养和 维持于五动物蛋白培养基(包含HSA)中的人多能干细胞也可以产生神经玫瑰花 状结构。

实施例46.与包含额外补充物的340mOsm/kg重量克分子渗透压浓度 mTeSR1-F相比，在mTeSR1-F重量克分子渗透压浓度270mOsm/kg中 诱导神经外胚层的评价

使用实施例9中所述的方案，EBs在AggreWell^TM400或AggreWell^TM800 平板中在mTeSR1-F重量克分子渗透压浓度270mOsm/kg中从hESC系H9 形成，并且如实施例11中所述24小时后释放。可选地，如实施例30中所述， 它们在AggreWell^TM800平板微孔中在270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的 mTeSR1-F中形成和培养，并且如实施例31中所述释放。补充物在EB形成 过程中形成最初24小时内加入培养基，以及加入到ULA培养物中5天，或者 当细胞在AggreWell^TM800平板微孔内培养5天时添加到更换的培养基中。图 41显示在具有270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度和20ng/ml bFGF或20 ng/ml bFGF和1％B27(Invitrogen，目录号0080085SA)、1％N2A(STEMCELL  TECHNOLOGIES INC.目录号07152)的mTeSR1-F中附着、形成并培养后6 天来自ULA培养物的EBs。同一图显示在mTeSR1-F重量克分子渗透压浓度 270mOsm/kg中形成和在补充有1％N2A、100ng/ml Fgf8/200ng/ml shh或者1％ B27的AggreWell^TM800微孔内培养5天的、贴壁后4天的EBs。在该实验中使 用的其它补充物(数据未显示)是2％和5％BSA、1％非必需氨基酸 (NEAA)(Invitrogen目录号11140050)、Fgf8(100ng/ml)和shh(200ng/ml)或300 ng/ml Noggin(STEMCELL TECHNOLOGIES INC.目录号02525)。另外的补充 物包括但不限于：SM1(STEMCELL TECHNOLOGIES INC.目录号05711)、抗 坏血酸、视黄酸、cAMP、BDNF、毛喉素(forskolin)、NeuroCult增殖补充 物(STEMCELL TECHNOLOGIES INC.目录号05701)、N2B(STEMCELL  TECHNOLOGIES INC.目录号07156)、胰岛素铁硒传递蛋白(ITS)和适合神经祖 细胞扩增和分化的其它添加剂。

实施例47.在EB中神经外胚层的有效诱导，所述EBs使用 AggreWell^TM800在mTeSR1-F重量克分子渗透压浓度270mOsm/kg中产生 并在不同时间点平板接种

如实施例30中所述，包含2000个细胞/EB的EB在AggreWell^TM800中从 人胚胎干细胞系H9(p36和p42)形成。EB培养于这些AggreWell^TM微孔装置中 在具有270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F中。根据实施例31 中所述方法释放EB用于随后进行平板接种，除了在不同时间点(第2、3、4、5、 7、8、9和11天)从微孔收集EB之外。如实施例12中所述通过代表外胚层的 神经玫瑰花状结构的存在进行形态学评价。图42和43显示释放的和在不同时 间点平板接种的和平板接种后1至5天的贴壁EB。当早在AggreWell^TM800中 最初形成后第1天平板接种、接种后3天(在总共4天中)或者在第2天平板接 种、接种后1天(在于mTeSR1-F 270mOsm/kg中诱导的总共3天中)时，贴 壁EBs显示高含量的神经玫瑰花状结构。在晚至第11天平板接种和平板接种 后5天分析的EBs(EB形成后总共16天中)中仍可以鉴定不同大小玫瑰花状结 构(图43中的圆圈)、单细胞层神经祖细胞(图43中的细箭头)和成熟神经元(图 43中的粗箭头)的混合物。该实施例显示，神经玫瑰花状结构早在 AggreWell^TM800平板中2天内诱导，并且早在平板接种后1天变得明显。当EBs 在AggreWell^TM800平板中维持24小时然后平板接种时，则平板接种的EBs在 EBs平板接种后3天内显示玫瑰花状结构。EBs在AggreWell^TM800中培养最长 达11天，收集然后培养5天(在mTeSR1-F 270mOsm/kg中总共培养16天)， 产生包含神经细胞的玫瑰花状结构，所述神经细胞具有可以由本领域技术人员 鉴定的预示着定型至神经命运的不同阶段的形态(即早期神经祖细胞存在于玫 瑰花状结构，具有从玫瑰花状结构生长出双极形态的单细胞神经祖细胞和具有 轴突突起的神经元)。还开展实验在包含mTeSR1-F 270mOsm/kg的 AggreWell^TM800装置中培养EBs总共6、7、9、10和12天。此外，通过流式 细胞分析分析贴壁EB培养物以确定在AggreWell^TM800微孔内培养1或5天后 平板接种的贴壁EBs中Sox1阳性神经祖细胞(NPCs)百分数。图42中的FACS 图显示在5天时贴壁EBs中检测到35.21％的Sox1阳性细胞，与之相比贴壁1 天的EBs中有0.77％的Sox1阳性细胞。

实施例48.在EBs中有效诱导神经外胚层，所述EBs在AggreWell^TM中在 270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F中形成和培养并且平板接 种于不同表面上

如实施例30中所述在AggreWell^TM800中从的hESC系H9p38形成包含 2000个细胞每EB的EBs。如实施例31中所述将EBs从AggreWell^TM释放并平 板接种于聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被平板上。除了使用1、10和20μg/mL的 不同浓度的层粘连蛋白之外，如实施例18中所述包被平板。图44显示贴壁后 3天的EBs。在所有条件下出现100％的神经玫瑰花状结构形成。因此，不同浓 度的层粘连蛋白可以以相当的效率使EB粘附。

实施例49.先前在260mOsm/kg或270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度 mTeSR1-F中形成的EBs，在随后的神经球悬浮培养中培养导致高效率地诱 导神经玫瑰花状结构和平板接种后的神经元外生长

根据实施例9在AggreWell^TM400中在具有260mOsm/kg或270mOsm/kg 重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F中从H9p51hESC形成EBs，并且根据 实施例11从微孔释放EBs。如实施例51中所述，贴壁EB用1mg/ml分散酶解 离并再次平板接种。第二天出现许多细胞团块，其聚集成为聚集体或者“神经 球”。使用血清学5-mL移液管将这些神经球转移进入超低附着(ULA)平板中 并且在与先前培养它们的培养基相同的培养基(即具有260mOsm/kg or 270 mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F)中培养5天。然后收集神经球 并平板接种于聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的平板上(见实施例18)。图45显示 平板接种后第1天时的神经球，显示出在单独的270mOsm/kg重量克分子渗透 压浓度的mTeSR1-F中或者包含1％B27(Invitrogen，目录号0080085SA)和/ 或1％N2A(STEMCELL TECHNOLOGIES INC.目录号07152)的270mOsm/kg 重量克分子渗透压浓度mTeSR1-F中形成的贴壁神经球。在所有3种培养基 中观察到伸出突出的神经元(箭头)。其它补充物(如实施例46中所述)也已用于 神经球培养基。可选地，在260mOsm/kg或270mOsm/kg重量克分子渗透压浓 度的mTeSR1-F中在ULA培养中保持13天，收获并平板接种6天的EBs， 产生神经玫瑰花状结构(粗箭头)和神经元(细箭头)，如图46中所示。

该实施例显示，在260mOsm/kg或270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度 mTeSR1-F的低重量克分子渗透压浓度培养基中作为神经球(在最初传代然后 转移至ULA平皿之后)形成的EBs培养物，或者在ULA平皿中延长培养时间 的EBs培养物产生包含玫瑰花状结构和神经元的神经元群体。

实施例50.在于微孔装置中形成EB之前，用270mOsm/kg重量克分子渗 透压浓度的mTeSR1-F预处理hPSC培养物，增加在320mOsm重量克分子 渗透压浓度mTeSR1-F中神经诱导的效率

在该实施例中，如所述hPSC系培养于mTeSR中。在此，使用第47代的 hESC系H9。在EB形成之前，将培养基换成具有320mOsm/kg重量克分子渗 透压浓度的mTeSR1-F，并将细胞培养24小时。开展该步骤以增加特别是实 施例9中所述方案中神经外胚层形成的效率。所有EBs在具有270mOsm/kg重 量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F中形成。如实施例12中所述，通过神经玫 瑰花状结构形成评价神经诱导。如实施例9中所述，EBs在AggreWell^TM400中 从预处理的H9细胞形成，并且24小时后释放以在ULA平板中培养5天(如实 施例11中所述)。图47显示平板接种并附着至聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白后4天 的EBs。神经玫瑰花状结构百分数从非条件培养基(mTESR1)中的49％(左图) 增加至当hESC在320mOsm/kg重量克分子渗透压浓度mTeSR1-F中预处理 时的72％(右图)。

实施例51.解离贴壁的EBs和得到神经祖细胞(NPCs)的方法

如实施例9中所述，在AggreWell^TM400中在270mOsm/kg重量克分子渗 透压浓度mTeSR1-F中从人胚胎干细胞系H9p47形成包含2000个细胞每EB 的EBs。24小时后释放EB，在ULA平皿中培养并在培养5天后在聚-L-鸟氨酸 /层粘连蛋白上平板接种，如实施例11中所述。平板接种后7至8天，使用不 同解离试剂将贴壁EBs解离：无酶基于PBS的细胞解离缓冲液(Gibco，目录号 13151-014)、EDTA(0.02％)、分散酶1mg/ml(STEMCELL TECHNOLOGIES  INC.，目录号07923)、Accutase(STEMCELL TECHNOLOGIES INC.，目录号 07920)、Neurocult化学解离试剂盒(小鼠)(STEMCELL TECHNOLOGIES  INC.，目录号05707)和胰蛋白酶(0.05％)(Sigma，目录)。贴壁EBs在无酶基于 PBS的细胞解离缓冲液(Gibco，目录号13151-014)中室温解离0.5至1小时。使 用0.02％EDTA溶液进行相同的孵育过程。孵育后，通过在溶液中研磨(使用 P-1000移液管吸头大约10次)将细胞解离。用1mL含15mM HEPES的 DMEM/F-12(STEMCELL TECHNOLOGIES INC.，目录号36254)洗涤培养皿一 次并将细胞如实施例14中所述离心。丢弃上清液并用2mL具有270mOsm/kg 重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F将细胞沉淀分离并平板接种于聚-L-鸟氨 酸/层粘连蛋白或者matrigel(或其它)包被的6-孔板上。以不同密度将细胞平板 接种，并且在该实施例中，进行1比1的分离。对于使用分散酶的解离，在从 培养物去除诱导培养基(具有270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的 mTeSR1-F)之后，向贴壁EB培养物中加入1mL 1mg/ml分散酶溶液。将平板 置于37℃培养箱中并且观察培养物直到贴壁EBs集落开始从平板上脱落。该步 骤通常需要10至40分钟。去除分散酶并且将细胞用DMEM-F12洗涤3次。研 磨和离心步骤如上面和实施例14中所述。在丢弃诱导培养基之后向细胞中加入 Accutase并按照标准方案孵育细胞直到所有细胞脱离平板(通常5-10分钟)。向 细胞中加入5mL DMEM-F12以灭活Accutase并且使用P-1000移液管吸头轻 轻分离细胞1-2次。离心和沉淀的解离以及平板接种在上面描述。Neurocult化 学解离试剂盒(小鼠)如 http://www.stemcell.com/en/Products/All-Products/NeuroCult-Chemical-Dissociatio n-Kit-Mouse.aspx(手册：Chemical Dissociation of Neurospheres Derived from  Adult and Embryonic Mouse CNS using the NeuroCultChemical Dissociation Kit (使用NeuroCult化学解离试剂盒化学将衍生自成体和胚胎小鼠CNS的神经 球解离)-2009)中描述使用。如上面以及实施例14中所述，将解离的细胞离心、 将细胞沉淀解离以及将细胞平板接种。对于胰蛋白酶解离，使用0.05％浓度的 胰蛋白酶将贴壁EB培养物解离。在吸掉培养基之后，将细胞与预温(至37℃) 的胰蛋白酶于37℃孵育1-2分钟或者直到它们开始脱离平皿。通过加入1-2mL 无Ca++和Mg++的D-PBS(STEMCELL TECHNOLOGIES INC.，目录号37350) 中的用于神经分化的10％ES-Cult胎牛血清(STEMCELL TECHNOLOGIES  INC.，目录号06955)使胰蛋白酶失活。研磨、离心和平板接种步骤在上面描述。 图48显示在平板接种后4-6天使用不同的所描述试剂解离的NPCs。图49显示 再次平板接种后3天的NPCs，其已经使用Accutase(本实施例)、HBSS(实施例 52)或PBS(实施例14)解离，并对NPC标志物巢蛋白和Sox1进行了染色。请注 意，还以不同密度将NPCs平板接种。本实施例显示贴壁EB可以用不同的试 剂解离并且所得到的包含NPCs的悬浮液在形态和标志物染色方面彼此具有可 比性。

实施例52.在不同时间点平板接种的不同大小贴壁EBs内，从神经玫瑰花 状结构有效分离神经祖细胞

如实施例30中所述，在AggreWell^TM800中从人胚胎干细胞系H7和H9(分 别第38或35、36、41、45代)形成包含2000、5000和10000个细胞/EB的EBs。 EBs在AggreWell^TM微孔装置内在具有270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的 mTeSR1-F中培养5天。根据实施例31中所述方法释放EBs用于随后的平板 接种，除了在不同时间点(第5、6、7、9和11天)从微孔收集EB之外。图50 显示从AggreWell^TM800平板释放后在不同时间点(在第5、6和11天)的贴壁 EBs(不同大小)，在贴壁EBs被解离以得到NPCs的当天显示(仅显示代表性的 实例)。在所有条件中均出现神经玫瑰花状结构。使用实施例14中所述的方法， 除了在本实施例中使用无钙和镁(Ca²⁺和Mg²⁺)的Hanks平衡盐溶液 (HBSS)(Sigma目录号C1419)之外，从贴壁EBs选择性地分离NPCs。在清除诱 导培养基(具有270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F)之后，将细 胞于室温孵育0.5-2小时。如实施例14所述将细胞解离并离心。去除上清液并 且将细胞沉淀用2mL具有270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F 解离。以不同密度将NPCs再次平板接种于聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白上(对于包 被过程见实施例18)。图51显示在培养第5或6天时分离的经再次平板接种的 NPCs，其从在不同时间点平板接种并且还在不同时间点解离的EBs分离。图 52显示再次平板接种后4天的NPCs并且还包括对NPCs标志物(PSA-NCAM、 SOX1和巢蛋白，以及ZO-1，紧密连接蛋白和玫瑰花状结构内腔标志物)进行免 疫细胞化学染色(对于方法见实施例17)的细胞图片。为了清楚，图53中的表总 结了各个实验：第一列表示从EBs从AggreWell^TM800板释放的日期。第二列表 示贴壁EBs解离的日期，第三列表示自在AggreWell^TM和mTeSR1-F 270 mOsm/kg中EBs形成开始的总天数，第四列表示EB大小，并且第五列表示拍 摄图片的日期，带有NPCs培养的总天数。

实施例53.从贴壁EBs内神经玫瑰花状结构有效分离神经祖细胞以及在不 同浓度层粘连蛋白上培养这些细胞

如实施例30中所述，在AggreWell^TM800中从人胚胎干细胞系H9(p65)形 成包含2000个细胞/EB的EBs。EBs在这些AggreWell^TM微孔装置中在具有270 mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F中培养12天。释放EB用于随 后根据实施例31的方法进行平板接种，修改之处在于EBs在第12天进行平板 接种。在根据实施例51中所述方法平板接种后第4天时从贴壁EBs分离神经 祖细胞。在该实施例中，使用0.05％浓度的胰蛋白酶。细胞再次平板接种于以 聚-L-鸟氨酸或4种不同浓度层粘连蛋白包被的6-cm孔中。包被如实施例18中 所述进行，修改之处为层粘连蛋白浓度。图54显示平板接种后第4天时的贴壁 EBs(上行)。中行显示从平板接种于1、5、10和20μg/ml层粘连蛋白(从左至右) 上的贴壁EBs分离后3天的NPCs。下行显示平板接种后7天的相同细胞。图 55显示在10和20μg/ml层粘连蛋白上第3天时和在1和5μg/ml层粘连蛋白 上第7天时的NPCs的免疫细胞化学染色。如实施例17中所述开展染色并且将 细胞对神经元标志物TUJ-1染色以确定层粘连蛋白浓度对神经元数量的影响。 该实施例显示，NPCs可以再次平板接种到不同浓度的层粘连蛋白上而不影响贴 壁的神经/神经元细胞的形态或者标志物表达。

实施例54.从在270mOsm/kg或340mOsm/kg重量克分子渗透压浓度 mTeSR1-F中产生和培养22天的EBs有效解离和分离神经元和神经祖细胞

如实施例30中所述，使用270mOsm/kg或340mOsm/kg重量克分子渗透 压浓度的mTeSR1-F在AggreWell^TM800中从人胚胎干细胞系H9形成包含 2000个细胞/EB的EBs。如实施例31中所述，在培养第11天时从微孔板释放 EBs并且平板接种于聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被平板上。根据实施例53中所 述方法在平板接种后第11天时从贴壁EBs分离神经祖细胞。图56和57显示 平板接种后第11天时的贴壁EBs。在培养物中不但出现NPCs，而且还出现从 在270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度mTeSR1-F中形成和培养的贴壁EBs 结构生长出的成熟神经元。在于340mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的 mTeSR1-F中形成和生长的EBs中仅观察到少数NPCs和神经元。NPCs仅能 够从解离在270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F中生长的解离 EBs产生，而不能够从具有340mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F 产生。在第3天时的再次平板接种的细胞的免疫细胞化学(见实施例17)显示 NPCs和神经元的混合物，如分别通过巢蛋白和Sox1或TUJ-1表达所确定。

实施例55.将神经祖细胞增殖数代，测试不同解离试剂和表面包被

如实施例30中所述，使用具有270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的 mTeSR1-F，在AggreWell^TM800中从人胚胎干细胞系H9(p 36和41)形成包含 2000或10000个细胞/EB的EBs。如实施例31中所述，EBs从微孔板释放并平 板接种于聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被平皿上。包含2000个细胞的EBs在第7 天时从AggreWell释放并且包含5000或10000个细胞的EBs在于AggreWell 中培养第5天时释放。根据实施例52中所述的方法，在平板接种后第11天(对 于2000个细胞/EB)或者第7天(5000和10000个细胞/EB)从贴壁EBs分离神经 祖细胞。图58显示在聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被平皿上(第1代＝P1)培养第 4天(2000个细胞/EB)或第6天(10000个细胞/EB)的NPCs。这些NPCs使用HBSS 或者TryplE(Sigma，目录号)解离并将所得到的细胞作为二次培养物再次平板接 种在聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白或者matrigel包被平皿上(分别对于2000或者 10000个细胞每EB)。通过室温孵育NPCs 0.5至1小时进行HBSS解离并且观 察到细胞脱落。使用P-1000移液管吸头在HBSS溶液中轻轻研磨细胞5-10次。 如实施例52中所述离心细胞并将细胞沉淀解离。对于使用TryplE将NPCs脱 落，使用实施例51和53中的方法。图58显示以1.3×10⁵个细胞/cm²的密度平 板接种的、在第3天(2000个细胞/EB)或者第1天(10000个细胞/EB)的第2代＝ P2的细胞。分别在第3或2天时用胰蛋白酶(2000个细胞/EB)(见实施例51和 53)或者TryplE(10000个细胞/EB)在第3代时(P3)处理细胞。图58显示分别在 第3或4天时P3细胞，其为诱导后总共29或者24天。图59中的表总结了对 来源于包含2000或者10000个细胞的EBs的细胞进行分离的不同时间点。对 神经祖细胞标志物开展免疫细胞化学染色(对于方法见实施例17)，显示 Musashi，一神经元前体细胞标志物和ZO-1表达，其是玫瑰花状结构内腔标志 物(图59)。在对Musashi和ZO-1染色的p1d5细胞(来源于2000个细胞/EB)上 显示NPC。如通过DAPI细胞染色所示，还可在来源于10000个细胞/EB的p1d6 细胞中看到玫瑰花状结构。成熟神经元与NPCs(在此处以标志物TUJ-1显示) 混合。从在具有270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F中培养的 细胞得到结果，但是NPCs也可在补充有bFGF(10-20ng/mL)、EGF(10-20 ng/mL)、B27(1-2×)或N2A(1×)的270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的 mTeSR1-F中培养。

该实施例显示，不同解离试剂可以用于解离NPCs，用于超过3次传代的传 代培养，并且这些NPCs可以再次平板接种于不同基质上。

因此，通过机械分离得到的神经玫瑰花状结构，以及如在实施例15中所述 或者通过实施例51和55中任何所述的解离方法所得到的再次平板接种的NPCs 解离解离，可用于解离NPCs用于多代内的进一步增殖。总之，前面5个实施 例显示，NPC可以从在不同时间从AggreWell^TM800中收获的EBs、在不同时间 点表现出玫瑰花状结构和当贴壁EBs培养不同天数时的贴壁EBs分离。EBs可 以在AggreWell^TM微孔中培养24小时，或者释放以在ULA平板上培养，或者 将它们留在微孔内最长达12天。同样，可以形成不同大小的EBs并且NPCs 可以以相似的效率从这些EBs分离。此外，不同解离试剂可以用于分离NPCs 并且NPCs可以再次平板接种在不同浓度的层粘连蛋白以及不同表面上。NPCs 可以在平板接种EBs后3至11天的时间范围内(这等于总共11至22天)分离， 并且可以传代数次而不丧失作为NPCs繁殖以及自发分化成神经元和星形细胞 的能力，见实施例57和图66。

实施例56.在具有270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F 中产生的神经玫瑰花状结构内的细胞以及在具有340mOsm/kg重量克分子渗 透压浓度的mTeSR1-F中产生的非神经细胞的表型和分子表征

在该实施例中使用第63代的hESC系H9。如实施例28中所述在 AggreWell^TM400中形成包含500个细胞每EB的EBs，并且在微孔中培养5天 后释放EB并附着于聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被平板上，如实施例29中所述。 使用两种培养基：具有270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F和 具有340mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F。为了表征在贴壁EBs 的神经玫瑰花状结构中存在的神经祖细胞，如实施例17中所述开展免疫细胞化 学。使用在文献中描述的用于NPCs的标志物。使用的最早的神经标志物是 Pax6，然后是后来的标志物Sox1和巢蛋白。Pax6和Sox1在于270mOsm/kg 重量克分子渗透压浓度mTeSR1-F中形成的贴壁EBs的玫瑰花状结构内表达， 并且在于340mOsm/kg重量克分子渗透压浓度mTeSR1-F中形成的EBs中弱 表达或者缺乏，如图60中所示。图61显示Pax6、Sox1和巢蛋白标志物在来 自多个实验的在270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F中形成的 贴壁EBs中共表达。图62显示Pax6和Sox1与ZO-1共表达。图62还显示在 玫瑰花状结构内对放射状神经胶质细胞的标志物BLBP的染色。图63显示主要 在于340mOsm/kg重量克分子渗透压浓度mTeSR1-F中形成和培养的EBs中 出现的非神经细胞，其没有玫瑰花状结构并且具有“扁平的”形态(在该实施例 中使用H9 p52 hES细胞)。有可能这些扁平细胞和非玫瑰花状结构衍生自中胚 层或内胚层谱系。通过将200P移液管吸头在贴壁EB集落之间轻轻地前后移 动刮下这些细胞以得到细胞用于qPCR。作为对照，人工选择玫瑰花状结构。 将两种细胞类型转移至1.5mL Eppendorf管中并且以最大转速离心1-2分钟。 使用Trizol(Invitrogen，目录号15596-018)和标准方法提取RNA。开展单轮逆 转录酶PCR以产生cDNA拷贝(剩余的RNA使用RNA酶消化)，并且使用基 于特异性引物和SybrGreen^TM(GE Healthcare)按照生产商的方案扩增cDNA。 使用7900-HT机器(Applied Biosystems)监测根据SybrGreen整合的所希望产物 的扩增并且使用标准程序(RQ Manager 1.2)开展数据分析。qPCR结果示于图64 中，并且表明，巢蛋白和Sox1转录物在“神经玫瑰花状结构细胞”中比“非 神经(扁平)细胞”中高。

总之，形态学、免疫细胞化学表征以及对神经标志物的FACS和qPCR显 示，在具有270重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F中神经外胚层的诱导是 有效的，并且NPCs可以分离和增殖以及分化成神经元和星形细胞。相比之下， 在具有340mOsm/kg重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F中形成的EBs不富 集神经玫瑰花状结构并且不能够分离NPCs。有可能高于280和340mOsm/kg 的重量克分子渗透压浓度使具有与神经来源细胞不同形态和衍生自中胚层或内 胚层谱系的非外胚层细胞丰富。

实施例57.神经祖细胞(NPCs)向神经元和星形细胞的自发分化

如实施例55中所述将神经祖细胞数次传代，包含NPCs、神经元和星形细 胞的混合物。在该实施例中，在AggreWell^TM800中从hESC系H9p36形成包 含2000个细胞每EB的EBs，如实施例30中所述。释放EB并且如实施例31 中所述平板接种5天。接着，如实施例52中所述将贴壁细胞用HBSS解离并且 传代。细胞培养8天(第1代)，如实施例55中所述使用HBSS解离并传代进 入第二代。进一步培养细胞5天，然后用TryplE解离(第3代)。图65显示在第 一代第8天(p1d8)、p2d2和p3d3的NPCs。在第1代和第2代中，观察到大多 数的NPCs，而在第3代中自发出现神经元亚群体。例如，图66显示表达GABA 能神经元标志物的细胞。在NPCs的自发分化中还鉴定出指示星形细胞存在的 GFAP阳性细胞。

实施例58.在于包含和不包含补充物的270mOsm/kg重量克分子渗透压 浓度mTeSR1-F中贴壁培养的hPSCs中有效诱导神经外胚层

如实施例21中所述，人胚胎干细胞系H9传代作为单细胞培养4代，从第 51代至第55代(p51至p55)。将1.7×10⁵个细胞平板接种于6-孔平皿中于单独 的270mOsm/kg重量克分子渗透压浓度mTeSR1-F中或者补充有2％B27、1％ N2A或1％B27(Invitrogen，目录号17504-044)的270mOsm/kg重量克分子渗透 压浓度mTeSR1-F中。在神经诱导之前和过程中，使用Matrigel和聚-L-鸟氨 酸用于hPSCs贴壁培养。对本领域技术人员而言，早在平板接种和诱导后3天， 神经玫瑰花状结构明显。图67显示平板接种于诱导培养基(具有270mOsm/kg 重量克分子渗透压浓度的mTeSR1-F)中matrigel上后7天诱导的玫瑰花状结 构。

虽然本公开已经参照当前认为是优选实施例的实例进行了描述，但是应当 理解，本公开不限于所公开的实施例。恰恰相反，本公开旨在涵盖由后附权利 要求书的精神和范围所内含的多种修改和等效的设置。

所有公布、专利和专利申请以似乎各个单独的公布、专利或专利中请明确 且各自标明整体通过引用并入本文的相同程度，整体通过引用并入本文。

表1

表2

 成分   1x时的浓度(mg/ml)  碳酸氢钠   0.544  L-谷氨酰胺   0.142  人全铁转铁蛋白   0.0106  BSA   13.1  盐酸噻胺(Thiamine HCl)   0.0064  还原型谷胱甘肽   1.942  L-抗坏血酸   0.32  L-丙氨酸   0.0086  L-天冬酰胺H₂O   1.456E-03  L-天冬氨酸   1.292E-03  L-谷氨酸   1.428E-03  甘氨酸   7.28E-03  L-脯氨酸   1.116E-03  L-丝氨酸   1.02E-03  1000x微量元素B   1.94x  1000x微量元素C   0.97x  亚硒酸钠(Sodium Selenium)   1.36E-06  人胰岛素   1.94E-03  化学成分确定的脂类   1.942E-03mL/mL  2β巯基乙醇   9.718E-06  对于260mOsm/kg的NaCl   0.027  对于270mOsm/kg的NaCl   0.33  对于290mOsm/kg的NaCl   0.95  对于320mOsm/kg的NaCl   1.87  对于340mOsm/kg的NaCl   2.48

表3

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