一种紫胶桐酸含量的测定方法

摘要

本发明公开了一种紫胶桐酸含量的测定方法，包括采用高效液相色谱法进行测定，以含有甲醇的水溶液为流动相，采用示差折光检测器进行测定，按照外标法以峰面积分别计算紫胶桐酸样品中的紫胶桐酸的含量。本发明方法提高了含量测定的精确性，缩短了测定时间，重复性好，适应性高，而且本发明方法的选择性强，灵敏度高，最低检测限小，克服了紫胶桐酸没有共轭结构，不能利用紫外(UV)检测器来检测的缺陷，降低了紫胶桐酸的生产、检测成本，适宜于紫胶桐酸的检测应用。

说明书

技术领域

本发明属于检测分析技术领域，涉及一种色谱检测方法，特别涉及一种采用高效色 谱检测分析方法测定紫胶桐酸含量的方法。

背景技术

紫胶树脂是食品添加剂的重要原材料，由多羟基脂肪酸和倍半萜烯酸组成的聚酯混 合物，其中多羟基脂肪酸为紫胶桐酸，是一种白色晶体，是紫胶树脂结构单体中的长链 脂肪酸部分，分子式为C₁₆H₃₂O₅，含有三个游离的羟基和一个游离的羧基，也称作9， 10，16-三羟基棕榈酸。紫胶桐酸用途广泛，不仅可以作为大环麝香类香料化合物、营 养能量剂、前列腺素、昆虫信息素、环酰脲等的前体合成原料，也可应用于防紫外线、 防辐射、耐高温等航空航天材料的制备。

皂化处理是紫胶桐酸制备过程中的重要步骤，目前国内已有常温皂化法、普通加热 皂化法、超声波辅助皂化法和微波皂化法，其中微波皂化法制备紫胶桐酸的方法具有操 作简单，时间短，效率高，安全无污染等特点。

虽然紫胶桐酸的制备方法得到了改进，但是目前国内外尚无公认的紫胶桐酸快速、 准确检测方法。对紫胶桐酸含量测定方法的研究主要有如下3种：(1)廖亚龙等用酸碱 滴定法检测紫胶桐酸含量，简便快速，但酸碱滴定结果反映的是被测样品中总有机酸的 含量，并不能有效甄别样品中的紫胶桐酸和其它有机酸；(2)一般含有长碳链脂肪酸结 构的有机物多是通过甲酯化后用气相色谱来检测，哈成勇等采用核磁共振法测定紫胶桐 酸优势构象时制备了紫胶桐酸甲酯，但制备时间长，且紫胶桐酸分子结构中由于同时含 有羧基和羟基，较易发生分子间或分子内酯化，故此法用于气相色谱检测时较难实现； (3)液相色谱法可以分离紫胶桐酸，但因紫胶桐酸中没有共轭结构，在200nm～800nm 并无特征吸收峰，故不能利用紫外(UV)检测器来检测。Nagappayya等报道了采用高 效液相色谱(HPLC)蒸发光散射(ELSD)法检测紫胶桐酸，流动相为乙腈和水，因未 明确色谱条件且无谱图佐证，难以判断其检测效果；虽然ELSD检测器灵敏度高，稳定 性好，但价格比较昂贵，难以推广应用。

发明内容

本发明的目的是针对现有紫胶桐酸含量测定方法中存在的技术缺陷，提供一种能够 快速，准确地测定样品中紫胶桐酸含量的方法，本发明方法测定过程中色谱图峰型完整、 美观，无拖尾现象；测定结果准确、快速、选择性强而且灵敏度高。

为实现本发明的上述目的，本发明一方面提供一种测定紫胶桐酸含量的方法，包括 分别制备紫胶桐酸的对照品溶液和供试品溶液，采用高效液相色谱法测定对照品溶液和 供试品溶液的峰面积，按照外标法以峰面积计算供试品中紫胶桐酸的含量。

其中，所述对照品溶液的制备包括，称取紫胶桐酸标准品作为对照品，将对照品加 入对照品溶剂，溶解，制成对照品溶液，其中，所述对照品溶剂为水或甲醇的水溶液； 所述供试品溶液的制备包括，称取含有紫胶桐酸的样品，将样品加入样品溶剂，溶解， 制成供试品溶液，其中，所述样品溶剂为水或甲醇的水溶液；所述测定包括，分别吸取 对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪进行液相色谱测定，采用示差折光检测器检 测、记录对照品溶液和供试品溶液的峰面积。

特别是，所述对照品溶剂甲醇的水溶液中甲醇与水的体积之比为60∶40。

其中，所述甲醇的水溶液中还含有三氟乙酸。

特别是，所述甲醇的水溶液的总体积与三氟乙酸的体积之比为100∶0.1。

尤其是，所述对照品溶剂中甲醇、水、三氟乙酸的体积之比为60∶40∶0.1。

特别是，所述样品溶剂甲醇的水溶液中甲醇与水的体积之比为60∶40。

其中，所述甲醇的水溶液中还含有三氟乙酸。

特别是，所述甲醇的水溶液的总体积与三氟乙酸的体积之比为100∶0.1。

尤其是，所述样品溶剂中甲醇、水、三氟乙酸的体积之比为60∶40∶0.1。

其中，所述的高效液相色谱采用的色谱柱为氨基色谱柱(即氨基柱)或C18反相色 谱柱；所述高效液相色谱的流动相为含有甲醇的水溶液。

特别是，所述氨基色谱柱选择YWG-NH₂、Ultimate XB-NH₂、Inertsil-NH₂或Hypersil APS2(NH₂)色谱柱；所述C18反相色谱柱选择Sepax GP-C18、Sepax HP-C18或ZORBAX SB-C18反相柱。

尤其是，所述C18反相色谱柱为ZORBAX SB-C18反相柱。

特别是，所述流动相中甲醇与水的体积之比为50-70∶30-50，优选为50-60∶40-50， 进一步优选为60∶40。

特别是，所述流动相中还含有三氟乙酸。

尤其是，所述甲醇、水、三氟乙酸的体积之比为50-70∶30-50∶0.05-0.2，优选为 60∶40∶0.05-0.2，进一步优选为60∶40∶0.05-0.1更进一步优选为60∶40∶0.1。

其中，所述高效液相色谱分析条件为流速为0.7-1.5ml/min，优选为1ml/min；柱温 为25-35℃，优选为30℃。

其中，所述示差折光检测器检测过程中检测温度为25-35℃，优选为30℃。

本发明方法测定紫胶桐酸含量的测定方法具有如下优点：

1、本发明方法测定紫胶桐酸含量准确，测定速度快、方法简便，测定效率高，测 定时间短，紫胶桐酸的出峰时间快，即紫胶桐酸的保留时间(RT)为7.6-8.0min。

2、本发明测定方法采用高效液相色谱法进行测定，采用本发明的流动相能够将紫 胶桐酸与杂质完全分离，液相色谱法分离效果好，紫胶桐酸的色谱图峰型完整、美观， 流动相中添加三氟乙酸，使得紫胶桐酸的色谱法没有拖尾现象，测定结果准确。

3、本发明方法测定结果重现性好，系统精密度高，相对标准偏差平均值(RSD) 为0.86％；稳定性好，稳定性试验的RSD平均值为0.75％；本方法的可信度高，在线 性范围0.01～1.00mg/mL(r＝0.9994)实用性好。

4、本发明检测方法选择性强，灵敏度高，本发明的检测最小量即最低检测限为 0.008mg/ml。

5、本发明方法克服了因紫胶桐桐酸中没有共轭结构，在200nm～800nm并无特征吸 收峰，不能利用紫外(UV)检测器来检测的缺陷，采用示差折光检测器，利用样品组 分与流动相的折光系数的不同，精确地检测紫胶桐酸，测定紫胶桐酸的含量。

6、本发明方法操作简单，处理时间短，快速而且测定结果准确，降低了紫胶桐酸 的生产、检测成本，适宜工业化大规模推广应用。

附图说明

图1是流动相为含有甲醇的水溶液的紫胶桐酸HPLC色谱条件选择试验的色谱图；

图2是流动相为含有甲醇、水和三氟乙酸混合溶液的紫胶桐酸HPLC色谱条件选择 试验的色谱图；

图3是紫胶桐酸HPLC色谱条件流速选择试验的色谱图；

图4是紫胶桐酸HPLC色谱条件柱温选择试验的色谱图；

图5是紫胶桐酸HPLC色谱分析的标准曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更 为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形 式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中使用的试验材料、试剂和仪器如下：

紫胶桐酸标准样品(纯度95％)：美国BE公司；

甲醇(色谱纯)：Fisher Scientific公司；

三氟乙酸(化学纯)、邻苯二甲酸氢钾(分析纯)：国药集团化学试剂有限公司；

氢氧化钾(分析纯)：西陇化工股份有限公司；

实验用水为超纯水；

紫胶桐酸样品：中国林业科学研究院资源昆虫研究所特种生物资源工程技术研究中 心制备。

Agilent1200高效液相色谱仪：美国安捷伦公司，配有型号为RID-G1362A示差折光 检测器和ZORBAX SB-C18反相色谱柱；

Purelab Ultra超纯水仪：英国ELGA公司；

KQ-300VDE型双频数控超声波清洗机：昆山市超声仪器有限公司。

实施例1高效液相色谱分析色谱条件的选择

11紫胶桐酸标准溶液的配置

准确称取0.1000g紫胶桐酸标准样品(含量95％)，加入甲醇、水和三氟乙酸的混 合溶液，搅拌溶解，其中甲醇与水的体积之比为60∶40，甲醇与水的总体积与三氟乙酸 的体积之比为100∶0.1，在超声波辅助下溶解混匀，然后定容至100mL容量瓶中，摇匀 配制成母液。

分别吸取0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、8、10mL母液于10mL容量瓶中，用V(甲 醇)∶V(水)＝60∶40(0.1％三氟乙酸)的溶液定容至刻度。配置的紫胶桐酸标准样品溶 液的浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0mg/mL。

1.2流动相的选择

色谱柱：选择ZORBAX SB-C18反相色谱柱(5μm，Φ4.6×150mm)

检测器：RID-G1362A示差折光检测器；

温度：柱温30℃，检测器温度30℃；

流速：1mL/min；

分别精确吸取浓度为0.5mg/mL的紫胶桐酸标准品溶液10μL，采用如表1中所述体 积之比的流动相进行高效液相色谱(HPLC)分析，采用示差折光检测器检测，记录色 谱图。高效液相色谱分析色谱条件选择条件和结果如表1所示。

表1HPLC色谱分析流动性与色谱行为

  流动相(体积之比)   色谱行为   甲醇∶水＝90∶10   极性过强，目标峰不保留，直接随溶剂峰一起出来   甲醇∶水＝80∶20   极性强，目标峰不保留，与溶剂峰不能有效分离   甲醇∶水＝60∶40   色谱峰拖尾   甲醇∶水＝50∶50   出峰时间较长，时间效率不高   甲醇∶水∶三氟乙酸＝60∶40∶0.05   三氟乙酸加入量略低，峰型效果欠佳   甲醇∶水∶三氟乙酸＝60∶40∶0.1   峰型、柱效果好，分离度高，RT适中，RT为7.7min   甲醇∶水∶三氟乙酸＝60∶40∶0.2   三氟乙酸加入量偏高，对分离柱损害较大

流动相为甲醇∶水＝90∶10、80∶20、60∶40、50∶50的HPLC谱图见附图1；流动相为甲 醇∶水∶三氟乙酸＝60∶40∶0.05、60∶40∶0.1、60∶40∶0.2的HPLC谱图见附图2。

综合分析图1、2，选择流动相为甲醇水溶液或甲醇、水与三氟乙酸的混合溶液， 其中甲醇和水(60∶40(V/V))的总体积与三氟乙酸的体积之比为100∶0.05-0.2都可以 作为流动相，考虑到保留时间(RT)、色谱峰的峰型等的因素，优选甲醇-水(60∶40) 与三氟乙酸的体积之比为100∶0.1的混合溶液为流动相，即流动相为甲醇、水和三氟乙 酸的混合液，其中甲醇、水三氟乙酸的体积之比为60∶40∶0.1。

1.3流速的选择

以甲醇、水、三氟乙酸的体积之比为60∶40∶0.1的混合溶液为流动相，比较不同流 速下紫胶桐酸出峰及分离效果的影响。

精确吸取浓度为0.5mg/mL的紫胶桐酸标准品溶液10μL，采用甲醇、水、三氟乙酸 的体积之比为60∶40∶0.1的混合溶液为流动相，分别以流速为1.5mL/min、1mL/min、 0.5mL/min速度进行HPLC分析，采用示差折光检测器检测，记录色谱图。不同流速条 件下高效液相色谱分析色谱图如图3所示。

由图3的分析结果表明：流速为1.5mL/min，出峰时间提前，紫胶桐酸的RT为3min， 与溶剂峰相临近，分离度差，影响分析效果，而且色谱柱的柱压过大，对色谱柱不益， 影响色谱柱的分离效果；流速为0.5mL/min，虽然柱压降低，但出峰时间延长，紫胶桐 酸的RT为12min左右，延长了分析时间，分析效率低；流速为1mL/min，出峰时间适 中，紫胶桐酸的RT为7.7min，色谱柱的柱压合适，因此选择HPLC的测定流速为 1mL/min。

1.4柱温的选择

在确定流动相配比及流速后，考虑柱温对试验的影响。

分别精确吸取浓度为0.3mg/mL的紫胶桐酸标准品溶液10μL，采用甲醇、水、三 氟乙酸的体积之比为60∶40∶0.1的混合溶液为流动相，流速为1mL/min，分别在柱温 为25℃、30℃、35℃的色谱条件下进行HPLC分析，在检测器温度为25℃、30℃、35 ℃下进行示差折光检测器检测，记录色谱图。不同柱温和检测器温度条件下高效液相色 谱分析色谱图如图4所示。

图4的分析结果表明：柱温对出峰效果和分离效果的影响较小。鉴于较低温度下仪 器能耗较低、色谱柱寿命长、升温时间短，故采用30℃作为最佳温。

实施例2标准曲线的绘制

按照实施例1中色谱分析条件进行测定，色谱分析条件如下：

色谱柱：ZORBAX SB-C18反相色谱柱(5μm，Φ4.6×150mm)

流动相：甲醇∶水∶三氟乙酸＝60∶40∶0.1(V/V/V)；

流速：1mL/min；

柱温：30℃；

检测器：RID-G1362A示差折光检测器；

示差折光检测器温度：30℃。

2.1绘制标准曲线

取紫胶桐酸标准品进行高效液相色谱(HPLC)分析，将配置的不同浓度的标准溶 液分别精密吸取10μL，注入液相色谱仪，进行测定，每个样品测3次，取3次测定结 果的平均值，以标准样品峰面积为纵坐标，标准样品的浓度为横坐标，绘制标准溶液曲 线，如图5所示。得回归方程：Y＝74584X+2899.3，R²＝0.9994，结果表明，紫胶桐酸 浓度在0.01～1.0mg/mL的范围内具有良好的线性关系，因此，可以根据此方程进行定 量分析。在上述的色谱条件下，当信噪比S/N为3时，紫胶桐酸的最低检测限为 0.008mg/mL。

2.2精密度试验

精密吸取浓度为0.4mg/mL的紫胶桐酸标准品溶液10μL，连续进样9次，按照实施 例1中选择的色谱分析条件进行测定，计算平均峰面积和相对标准偏差，评估精密度， 测定结果见表2。

表2紫胶桐酸精密度试验结果(n＝9)

测定结果表明：9次测定数据的RSD平均值为0.86％，表明本研究方法确定的紫胶 桐酸分离检测条件精密度良好。

2.4稳定性试验

于紫胶桐酸标准样品溶液制备后0、1、2、3、4、5、6、7、8h，精密吸取浓度为 0.5mg/mL的紫胶桐酸标准品溶液10μL，连续进样9次，按照实施例1中选择的色谱分 析条件进行测定，计算平均峰面积和相对标准偏差，评估精密度，测定结果见表3。

表3紫胶桐酸稳定性试验结果(n＝9)

测定结果表明：9次测定数据的RSD平均值为0.75％，表明紫胶桐酸样品检测稳定 性良好。

2.5加标回收率试验

按照实施例1选定的色谱分析条件和回归方程：Y＝74584X+2899.3的定量分析，测 定紫胶桐酸样品含量为95.31％；

精密称取已测定的含量为95.31％的紫胶桐酸样品0.0500g溶于100mL实施例1中 选择的流动相中，其中流动相中甲醇、水、三氟乙酸的体积之别为60∶40∶0.1，制得 浓度为0.50mg/ml的紫胶桐酸样品溶液；接着分别精确吸取3.00、3.50、4.00、4.50、 5.00、5.50、6.00、6.50和7.00ml紫胶桐酸样品溶液置于10ml容量瓶中，即加入容量 瓶中的紫胶桐酸样品的质量分别为1.42965mg、1.66792mg、1.90620mg、2.14470mg、 2.38275mg、2.62102mg、2.62102mg、3.09757mg和3.33585mg；然后向每个瓶中加 入浓度为0.5mg/ml的紫胶桐酸标准品溶液2ml，即加入每个瓶中的紫胶桐酸标准品的 质量为0.95000mg，加流动相定容至10mL，摇匀，分别计算加标回收率，回收率计算 公式如下：

计算结果见表4。

表4紫胶桐酸加标回收率试验结果(n＝9)

从表4可以看出，添加不同剂量的紫胶桐酸平均加标回收率为100.23％，在可信范 围内，组间无明显差异，表明本测定方法可信度高，适用于测定紫胶桐酸含量。

实施例3HPLC法测定紫胶桐酸含量

精密称取紫胶桐酸样品0.1g溶于实施例1中选择的流动相中，其中流动相中甲醇、 水、三氟乙酸的体积之别为60∶40∶0.1，然后定容至100mL容量瓶中，摇匀，待测；

精密吸取紫胶桐酸样品溶液10μL，连续进样5次，按照实施例1中选择的色谱分 析条件进行HPLC-RID分析测定，测定紫胶桐酸组分峰面积，采用实施例2得到的回 归方程：Y＝74584X+2899.3，对其进行定量分析，得出样品中紫胶桐酸质量分数。测定 结果如表5所示。

表5高效液相色谱法测定紫胶桐酸含量

对照例1酸碱滴定法检测紫胶桐酸含量

1、配制氢氧化钾-乙醇标准溶液

按照国家标准GB601-2002《化学试剂标准滴定溶液的制备》方法进行配制和标定， 配制的氢氧化钾-乙醇标准溶液的浓度为0.128mol/L。

2、配制紫胶桐酸样品溶液

精密称取紫胶桐酸样品5份，每份约0.10g，分别溶于30mL 95％的乙醇溶液中， 滴加2滴酚酞指示剂(10g/L，酚酞的浓度)，配制成紫胶桐酸样品溶液；

3、滴定

用标定的浓度为0.128mol/L的氢氧化钾-乙醇标准溶液进行酸碱滴定测定紫胶桐酸 的含量，滴定至终点(即配制的紫胶桐酸样品溶液由无色转变成浅粉红色)，由消耗氢 氧化钾-乙醇标准溶液的体积，计算出紫胶桐酸的质量分数，测定结果如表6所示。

表6酸碱滴定法测定紫胶桐酸含量

从表5、6的测定结果可知，同一紫胶桐酸样品，采用两种方法进行含量的定量分 析结果分析，采用酸碱滴定法定量分析的结果比HPLC分析的结果偏高。HPLC与酸碱 滴定法的区别在于：HPLC检测过程中，样品通过色谱柱后，色谱柱对不同组分具有分 离作用，将紫胶桐酸与杂质已分离开，故HPLC测定结果更接近样品中紫胶桐酸组分的 真实含量。而酸碱滴定法则不能完全区分样品中的紫胶桐酸和其它有机酸，方法不够准 确，含量值偏高。因此对于同一紫胶桐酸样品，HPLC-RID定量分析结果比酸碱滴定 法定量分析结果低，测定结果更为准确。

综上所述，本发明方法R²＝0.9994，紫胶桐酸浓度在0.01～1.0mg/mL的范围内具有 良好的线性关系；精密度高，精密度的RSD平均值为0.86％，方法的检出限低，紫胶 桐酸的最低检测限为0.008mg/mL；方法的稳定性高、重复性好，回收率理想，样品前 处理简单，分析效率提高，有效的提高了紫胶桐酸的检测效率，适于快速、大量的分析 紫胶桐酸的含量。