法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2015-05-20
授权
授权
2013-01-30
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N15/00 申请日:20110112
实质审查的生效
2012-10-10
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种通过电穿孔技术转移外源基因的方法，更特别地，涉及一种通过电穿孔技术转移外源基因的方法，该方法在存活率和基因转移率方面得到显著提高，该方法包括在特定条件下向动物细胞连续地施加第一电脉冲(强电脉冲)和第二电脉冲(弱电脉冲)。
背景技术
基因转移方法被分为两种方法：病毒载体方法和非病毒载体方法。作为用于将外源基因转移至动物的受精卵、血球、皮肤、肌肉、内脏等的细胞内的非病毒载体方法，有多种方法，例如显微注射法、粒子枪法、流体动力法、声致穿孔法(sonoporation method)和电穿孔法。作为用于将外源基因转移至悬浮(培养)细胞(悬浮于溶液中的细胞)的方法，有脂转染法、声致穿孔法和电穿孔法。以外，作为用于将外源基因转移至贴壁细胞(附着于培养皿、孔板等的细胞)的方法，有脂转染法、磷酸法、DAEA葡聚糖法和显微注射法。
在上面的方法中，电穿孔法是一种通过应用高压电脉冲在细胞膜上暂时制造一个微孔，以使外源DNA(例如质粒)可通过该孔并被细胞所接纳的方法。从不同的观点来看，这种方法被高度评价为其中最有利且最多产的基因转移方法。该方法具有多种有利特点，例如对包括植物的多种生物的宽广适用性、高的基因转移率、优异的再现性、更简单的操作、不需要使用特别的试剂以及同时处理许多细胞的可能性。
尽管电穿孔技术的基因转移率仍然较低并且不足，但电穿孔技术与诸如磷酸法等方法相比是更有效的基因转移方法。依赖于细胞种类，电穿孔技术仅达到极低的转移率。
在传统的电穿孔技术中，将从指数输出装置发出的一次电脉冲或从矩形脉冲型电脉冲输出装置发出的一次或多次电脉冲(以固定的恒定较高电压)应用于基因转移。
在使用由指数输出装置发出的一次电脉冲的情况中，不可避免地需要用到如此强的电脉冲，以至于可杀死至少50%的细胞。其基因转移率依然很低，仅仅是存活细胞的1-10%，即使在最好情况中也仅有30%。另外，在使用矩形脉冲型电脉冲输出装置的情况中，需要应用到可杀死至少20%细胞的强电脉冲。其基因转移率依然很低，仅仅为存活细胞的1-15%，即使在最好情况中也仅有30%(见非专利文献1)。
有可能通过应用更强的电脉冲来提高基因转移率，但这影响了细胞的存活率并且严重降低了实际上获得的基因转移细胞的数量。
在使用传统的电脉冲输出装置的电穿孔中，用于电穿孔的专用缓冲液的使用是必需的，这导致高的运行成本。在没有专用缓冲液的情况下，由于极低的效率这些方法不适用。
引用列表
非专利文献
非专利文献1：Biotechniques 第17卷, 第6期 (1994) “Short Technical Report (短篇技术报告)”。
发明概述
技术问题
本发明的一个目的是提供一种通过电穿孔技术转移外源基因的方法，该方法解决了上面的问题，适用于广泛的动物细胞，并且在存活率和基因转移率方面得到非常显著提高。
本发明的另一个目的是提供一种通过电穿孔技术转移外源基因的方法，该方法即使在没有使用专用电穿孔缓冲液的情况下也具有高的存活率和基因转移率。
问题解决
本发明的发明人进行了广泛的研究。结果，发明人发现显著提高的存活率和基因转移率可通过一种通过电穿孔技术将外源基因转移至动物细胞内的方法来实现，该方法包括在特定的条件下连续地施加第一电脉冲(强电脉冲)和第二电脉冲(弱电脉冲)。
发明人还发现甚至在能够被用于培养所述动物细胞的液体培养基被用作电穿孔缓冲液的情况下(在不使用专用缓冲液的情况下)，该方法也允许以高的存活率和基因转移率转移外源基因。
注意到所述方法的可能的原理如下：首先施加第一电脉冲(较强的电脉冲)以在目标动物细胞的细胞膜上制造微孔，从而将核酸转移至该动物细胞内，然后施加第二电脉冲(较弱的电脉冲)，从而进一步地将核酸转移至该动物细胞内并同时积极地恢复细胞膜。
本发明基于上述发现而得以完成。
也就是说，按照第一个方面本发明涉及一种通过电穿孔技术将外源基因转移至动物细胞内的方法，该方法包括将具有电场强度为至少300 V/cm或更大的第一电脉冲施加于动物细胞，使得总热量强度为0.2-40 J/100μL；然后施加具有电场强度为至少15 V/cm或更大的第二电脉冲，使得每次脉冲的热量强度为0.01-5 J/100μL。
按照第二个方面本发明涉及一种按照第一个方面来转移外源基因的方法，其中第二电脉冲的施加进行2次或更多次。
按照第三个方面，本发明涉及一种按照第一或第二个方面来转移外源基因的方法，其中在施加第一电脉冲后，第二电脉冲的施加进行少于一分钟。
按照第四个方面，本发明涉及一种按照第一至第三个方面中的任一个来转移外源基因的方法，其中动物细胞包括哺乳动物细胞。
按照第五个方面，本发明涉及一种按照第一至第四个方面中的任一个来转移外源基因的方法，其中动物细胞包括悬浮在溶液中的动物细胞。
按照第六个方面，本发明涉及一种按照第一至第五个方面中的任一个来转移外源基因的方法，其中所述溶液包括能够用于培养动物细胞的液体培养基。
本发明的有益效果
本发明提供了通过电穿孔技术转移外源基因的方法，该方法适用于广泛的动物细胞(特别是脊椎动物和昆虫细胞)且在存活率和基因转移率方面得到非常显著提高。
因此，甚至在能够被用于培养上述细胞的液体培养基被用作电穿孔缓冲液的情况下(在没有使用昂贵的专用缓冲液的情况下)，本发明也允许以高的存活率和基因转移率转移外源基因。也就是说，本发明允许显著降低运行成本。
本发明还允许将外源基因有效地转移至初级细胞、ES细胞、某些细胞系和非贴壁细胞(例如淋巴谱系细胞和某些癌症细胞)内，在每一种所述细胞中，难以通过传统的电穿孔技术都很难实现基因转移。
本发明也允许以低成本有效地制备可用于广泛工业领域的动物基因转移细胞(例如iPS细胞)。
附图的简要说明
[图1]显示检测到的荧光标记的蛋白质的照片图像，该蛋白质源自实施例28中的被转移的DNA。
[图2]显示检测到的荧光标记的蛋白质的照片图像，该蛋白质源自实施例28中的被转移的DNA。
[图3]显示检测到的荧光标记的蛋白质的照片图像，该蛋白质源自实施例28中的被转移的DNA。
[图4]显示检测到的荧光标记的蛋白质的照片图像，该蛋白质源自实施例28中的被转移的DNA。
[图5]显示检测到的荧光标记的蛋白质的照片图像，该蛋白质源自实施例28中的被转移的DNA。
[图6]显示检测到的荧光标记的蛋白质的照片图像，该蛋白质源自实施例28中的被转移的DNA。
[图7]显示检测到的荧光标记的蛋白质的照片图像，该蛋白质源自实施例28中的被转移的DNA。
[图8]显示检测到的荧光标记的蛋白质的照片图像，该蛋白质源自实施例28中的被转移的DNA。
[图9]显示检测到的荧光标记的蛋白质的照片图像，该蛋白质源自实施例28中的被转移的DNA。
[图10]显示检测到的荧光标记的蛋白质的照片图像，该蛋白质源自实施例28中的被转移的DNA。
[图11]显示检测到的荧光标记的蛋白质的照片图像，该蛋白质源自实施例28中的被转移的DNA。
[图12]显示检测到的荧光标记的蛋白质的照片图像，该蛋白质源自实施例28中的被转移的DNA。
[图13]显示检测到的荧光标记的蛋白质的照片图像，该蛋白质源自实施例28中的被转移的DNA。
[图14]显示检测到的荧光标记的蛋白质的照片图像，该蛋白质源自实施例28中的被转移的DNA。
[图15]显示检测到的荧光标记的蛋白质的照片图像，该蛋白质源自实施例28中的被转移的DNA。
[图16]显示检测到的荧光标记的蛋白质的照片图像，该蛋白质源自实施例28中的被转移的DNA。
[图17]显示检测到的荧光标记的蛋白质的照片图像，该蛋白质源自实施例28中的被转移的DNA。
[图18]显示检测到的荧光标记的蛋白质的照片图像，该蛋白质源自实施例28中的被转移的DNA。
[图19]显示检测到的荧光标记的蛋白质的照片图像，该蛋白质源自实施例28中的被转移的DNA。
[图20]显示检测到的荧光标记的蛋白质的照片图像，该蛋白质源自实施例28中的被转移的DNA。
[图21]显示检测到的荧光标记的蛋白质的照片图像，该蛋白质源自实施例28中的被转移的DNA。
[图22]显示检测到的荧光标记的蛋白质的照片图像，该蛋白质源自实施例28中的被转移的DNA。
[图23]显示检测到的荧光标记的蛋白质的照片图像，该蛋白质源自实施例28中的被转移的DNA。
[图24]显示检测到的荧光标记的蛋白质的照片图像，该蛋白质源自实施例28中的被转移的DNA。
[图25]显示检测到的荧光标记的蛋白质的照片图像，该蛋白质源自实施例28中的被转移的DNA。
[图26]显示检测到的荧光标记的蛋白质的照片图像，该蛋白质源自实施例28中的被转移的DNA。
[图27]显示检测到的荧光标记的蛋白质的照片图像，该蛋白质源自实施例28中的被转移的DNA。
[图28]显示检测到的荧光标记的蛋白质的照片图像，该蛋白质源自实施例28中的被转移的DNA。
[图29]显示检测到的荧光标记的蛋白质的照片图像，该蛋白质源自实施例28中的被转移的DNA。
[图30]显示检测到的荧光标记的蛋白质的照片图像，该蛋白质源自实施例28中的被转移的DNA。
[图31]显示检测到的荧光标记的蛋白质的照片图像，该蛋白质源自实施例28中的被转移的DNA。
[图32]显示检测到的荧光标记的蛋白质的照片图像，该蛋白质源自实施例28中的被转移的DNA。
[图33]显示检测到的荧光标记的蛋白质的照片图像，该蛋白质源自实施例28中的被转移的DNA。
[图34]显示检测到的荧光标记的蛋白质的照片图像，该蛋白质源自实施例28中的被转移的DNA。
[图35]显示检测到的荧光标记的蛋白质的照片图像，该蛋白质源自实施例28中的被转移的DNA。
[图36]显示检测到的荧光标记的蛋白质的照片图像，该蛋白质源自实施例29中的被转移的DNA。
实施方式的描述
在以下文中，详细描述本发明。
本发明涉及一种通过电穿孔技术转移外源基因的方法，更特别地，涉及一种通过电穿孔转移外源基因的方法，该方法在存活率和基因转移率方面得到显著提高，该方法包括在特定条件下对动物细胞连续地施加第一电脉冲(强电脉冲)和第二电脉冲(弱电脉冲)。
<输出电脉冲的装置和方法>
在本发明中，任何传统矩形脉冲型电脉冲输出装置(电穿孔仪(electroporator))可通过设计它的用法被使用，只要该装置可在后述特定条件下输出第一电脉冲和第二电脉冲(在特定条件下的两阶段电脉冲)即可。
举例来说，给出了矩形脉冲型输出设备，例如Gene Pulser Xcell (BioRad)和ECM830 (BTX)。这些装置可连续地输出设定为具有相同电压和脉冲长度的电脉冲，但是不能连续地输出设定为具有不同电压和脉冲长度的电脉冲(在特定条件下的两阶段电脉冲)。因此，在特定条件下的两阶段电脉冲通过这样的方法来输出，该方法包括从并排排列的两个装置中的第一个装置输出第一电脉冲，改变比色皿电极夹(cuvette electrode holder)与第二个装置的连接，数秒以后，输出第二电脉冲。或者，在使用单一装置的情况下，可使用这样的方法，该方法包括输出第一电脉冲，为第二电脉冲设定新的条件，在数秒以后，输出第二电脉冲。
注意在本发明中，传统的矩形脉冲型电脉冲输出装置(例如，诸如Gene Pulser Xcell (BioRad)和ECM830 (BTX)等输出装置)可通过如上述设计它的用法而被使用，但优选地，需要使用专门装置，该装置可在后述的特定条件下输出第一电脉冲和第二电脉冲(在特定条件下的两阶段电脉冲)。
本发明中对细胞施加电脉冲的操作通过使用连接于电脉冲输出装置的比色皿电极夹以及用于容纳细胞/核酸混合溶液的电极容器(比色皿电极)来进行。
来自电脉冲输出装置的电脉冲输出通过用于容纳所述比色皿电极的容器输出到插入所述电极夹内的比色皿电极，并传递到电极容器内的细胞内。
作为比色皿电极，只要其具有用于通常应用的容量，任何比色皿电极均可使用。举例来说，给出1mm间隙(容量：20-70μm)、2mm间隙(容量：40-400μm)和4mm间隙(容量：80-800μm)。
本发明中，所述操作通过用含有目标动物细胞和待转移的外源基因(核酸)的溶液装填容器来进行。
在本文中，作为‘溶液’，可以使用传统的缓冲液以及目标动物细胞可在其中增殖的液体培养基(例如，MEM培养基、DMEM培养基、Opti-MEM培养基、α-MEM培养基、RPMI-1640培养基、DMEM/F-12培养基、Williams培养基或ES培养基)以及能够应用于传统电穿孔技术的缓冲液，例如PBS或HEPES。注意依据提高基因转移率，在任何这些液体培养基中优选较低的血清浓度，特别地，需要使用‘无血清培养基’。此外，优选使用不含抗生素的培养基。
注意在施加电脉冲之后，血清和抗生素可被自由地加入所述培养基中。
在本文中，‘外源基因’指的是待转移的广泛的外源核酸序列，举例来说，不仅指的是全长序列(cDNA序列和基因组序列)而且还指的是部分序列、调节区、间隔区、突变序列和基因构建体。具体而言，使用载体DNA、寡核苷酸(反义物，siRNA)或病毒载体的基因转移被广泛应用。
在溶液中的核酸(特别地，DNA)的含量可以是可应用传统电穿孔技术的含量。然而，该含量从提高存活率和基因转移率的观点来看，合适地为0.01-1μg/μL，特别合适地为约0.03-0.2μg/μL。
因为存活率降低，核酸含量太大的情况并不优选。另一方面，因为基因转移率降低，核酸含量太小的情况也不优选。
在目标动物细胞是贴壁细胞的情况中，需要用胰蛋白酶等处理处于附着状态的细胞以分离所述附着细胞，从而得到悬浮液，移去胰蛋白酶然后将细胞混合入无血清的培养基中用于电穿孔。
此外，在所述动物细胞通常处于悬浮状态如血细胞的情况中，需要用合适的溶液(例如，PBS缓冲液)来清洗该动物细胞，然后将该动物细胞混合入无血清的培养基中用于电穿孔。
从提高基因转移率的观点来看，需要将含有动物细胞和核酸的溶液进行如下操作，例如移液或用旋涡混合器搅动1-2秒，由此在溶液中将动物细胞和核酸充分混合。待悬浮的细胞数量约为104-108个细胞/100 μL，优选约105-107个细胞/100 μL。注意不优选通过过分地执行所述操作(例如搅动)使溶液产生泡沫。
施加电脉冲的操作可在室温(例如，约15-40℃)进行。注意优选避免用冰冷却，以防止水滴附着于电极容器的金属(铝)部分。
<电脉冲的条件>
在本发明中，与传统电穿孔技术相比，通过在特定条件下连续地对目标动物细胞施加第一电脉冲和第二电脉冲(在特定条件下的两阶段电脉冲)，存活率和基因转移率两者可得到显著提高。
本发明中的第一电脉冲和第二电脉冲指的是这样的电脉冲，其‘电场强度’和‘热量强度’均落入随后描述的特定范围内。
另一方面，当电场强度和热量强度中的任何一个没有落入该特定的范围内的时候，无法获得足够的效果。
这里，“电场强度”是一个表示在电极容器内每单位cm的电极间隙(例如，比色皿电极间隙)施加的电压V的值，如通过公式1所示。它的单位以(V/cm)表示。
举例来说，为了提供300 V/cm的电场强度，1 mm间隙比色皿(电极间隙:1 mm)只要施加30 V的电压，2 mm间隙比色皿(电极间隙:2 mm)只要施加60 V的电压，4 mm间隙比色皿(电极间隙:4 mm)只要施加120 V的电压。
[数学式1]
电场强度(V/cm)=电压(V)/电极间隙(cm)???(公式1)
此外，“热量强度”是一个表示每100μL溶液(电穿孔缓冲液)施加的热量J的值，如通过公式2所示。它的单位以(J/100μL)表示。注意热量(J)是一个通过电压、电流和时间的乘积所表示的值，如通过公式3所示。
举例来说，当将脉冲长度为5毫秒的150V的电压施加在电阻为50Ω的100μL的溶液(电穿孔缓冲液)时，产生3A的电流。结果，每100μL溶液施加的热量为2.25 (J/100μL)。
注意即使在改变电压、容量(电阻)、脉冲长度(时间)等的情况下，只要电场强度和热量强度保持恒定，就可获得相似的结果(存活率和基因转移率)。
[数学式2]
热量强度(J/100μL)=热量(J)/溶液体积(100μL)???(公式2)
[数学式3]
热量(J)=电压(V)×电流(A)×时间(秒)???(公式3)
本发明中的“第一电脉冲”是一种强电脉冲，将其施加以在动物细胞的细胞膜上制造微孔，从而将外源核酸(DNA、RNA)通过该微孔转移至所述细胞内。所述“第一电脉冲”允许大量的DNA通过细胞膜转移至细胞质内，但是引起细胞膜的重大损伤。
需要的是，第一电脉冲的‘电场强度’为至少300 V/cm或更多，优选375 V/cm或更高。注意当电场强度小于该水平时，不能获得足够的基因转移率。注意电场强度的上限只要是这样的值，其并不使得细胞的存活率显著地降低，并且需要该上限为例如15,000 V/cm或更低，优选7,500 V/cm或更低，更优选5,000 V/cm或更低，最优选4,500 V/cm或更低。
另外，需要的是，所述第一电脉冲的‘总热量强度’为0.2 J/100μL或更高，优选0.25 J/100μL或更高，更优选0.3 J/100μL或更高。此外，需要所施加的总热量强度的上限为40 J/100μL或更低，优选20 J/100μL或更低，特别优选17 J/100μL或更低，更特别优选7 J/100μL或更低(特别地，注意对于Hela细胞该上限为5.3 J/100μL或更低)。
另外，只要所述电脉冲的总热量强度落入上述的范围之内，所施加的第一电脉冲的频率可以是任意频率。举例来说，具有在上述范围内的热量强度的电脉冲可施加一次。或者，具有小于上述范围的热量强度的电脉冲可施加十次，使得总热量强度落入上述的热量强度的范围内。
本发明所述的第二电脉冲在施加第一电脉冲(第一电脉冲的最后脉冲输出)后施加。脉冲之间的间隔可以是非常长的间隔例如约10分钟。然而，从提高存活率的观点来看，该间隔优选少于1分钟。特别优选地该间隔少于100毫秒。
本发明中的“第二电脉冲”是一种弱电脉冲，将其施加以将剩余的DNA (其没有通过施加第一电脉冲经由细胞膜的微孔被转移)经由细胞膜转移至细胞质内，并且积极地恢复细胞膜以提高细胞的存活率(提供愈合作用)。
需要的是，第二电脉冲的‘电场强度’为至少15 V/cm或更高，优选25 V/cm或更高。注意电场强度的上限只要是这样的值，其并不使得细胞的存活率显著降低，并且需要该上限为例如300 V/cm或更低，优选150 V/cm或更低。
另外，需要的是，第二电脉冲的‘热量强度’为0.01 J/100μL或更高，优选0.02 J/100μL或更高，更优选0.09 J/100μL或更高。另外，需要的是，热量强度的上限为5 J/100μL或更低，优选4.5 J/100μL或更低，更优选3.6 J/100μL或更低。
另外，就第二电脉冲的频率来说，在上述范围内的电脉冲可被施加一次。然而，当施加被优选地进行两次或更多次，特别优选三次或更多次，更特别优选五次或更多次，最优选十次或更多次时，明显发现了存活率显著提高。注意甚至当施加被进行了多于十次时，没有发现存活率的特别显著改变。
具有高的存活率和基因转移率的基因转移细胞可通过在一般培养基中培养细胞来获得，所述细胞在施加上述特定范围内的电脉冲后获得。
注意在无血清培养基用作电穿孔缓冲液的情况中，在施加电脉冲后细胞可直接在含有血清和抗生素的培养基中收集。换句话说，可在没有由于液体交换而引起任何细胞损伤和损失的情况下收集细胞，然后进行培养。
<目标细胞>
本发明的电穿孔可被应用于广泛的动物细胞。
这里，术语“动物细胞”意指在分类学上被分为‘动物’的真核多细胞生物的细胞。实例为后口动物如脊椎动物(哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类等)、脊索动物(海鞘类等)、半索动物(柱头虫(balanoglossus)等)和棘皮动物(海星、海参等)；原口动物如节肢动物(昆虫、甲壳动物等)、软体动物(有壳的水生动物、鱿鱼等)、线虫(蛔虫等)、环节动物(蚯蚓等)和扁形动物(涡虫等)；双胚层动物如刺胞动物(水母、珊瑚等)以及无囊胚层动物如多孔动物(海绵等)。
本发明的电穿孔最为有效地应用于尤其是分类为脊椎动物以及节肢动物的任何动物，脊椎动物为例如哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类等，节肢动物为例如昆虫。预期它对所述动物的较高有效性具有广泛而多样的工业应用，因为它的较高有效性在哺乳动物(人、马、小鼠、大鼠和仓鼠)、昆虫(果蝇)和两栖动物(软壳海龟)中得到确认，如下述实施例所记载的。
本发明的电穿孔基本上可被应用于动物的任意器官和组织的“动物细胞”。举例来说，它可被有效地应用于干细胞、癌细胞或正常细胞的细胞系以及初级细胞，如下面所记载的。
举例来说，它可被应用于多种‘干细胞’，例如胚胎干细胞(ES细胞)、神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、肝干细胞、胰干细胞、皮肤干细胞、肌肉干细胞、生殖干细胞等。
它可被应用于‘癌细胞’，包括多种癌细胞和瘤细胞，例如乳腺癌细胞、子宫颈癌细胞、胰腺癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、上皮癌细胞、肺癌细胞、食道癌细胞、前列腺癌细胞、白血病细胞、肉瘤细胞、淋巴瘤细胞等。
另外，它可被应用于‘正常细胞’，例如初级细胞或正常分化的不同组织细胞。举例来说，它可被应用于血细胞、淋巴细胞(T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞等)、表皮细胞(表皮细胞、角质形成细胞、内皮细胞等)、结缔组织细胞(成纤维细胞等)、肌肉组织(成肌细胞、骨骼肌细胞、被膜肌细胞、心肌细胞等)、神经细胞(神经元、成神经细胞瘤、神经胶质细胞等)、不同器官细胞(肾细胞、肺细胞、胰细胞等)、骨组织(成骨细胞、骨细胞、软骨细胞等)以及生殖细胞(卵母细胞、精母细胞等)。
另外，本发明的电穿孔可被有效地应用于其中难以实现基因转移的初级细胞，例如人羊膜间充质细胞、小鼠神经元(胚胎14天的大脑皮质)、小鼠神经元(胚胎14天的海马)、小鼠神经干细胞、小鼠胚胎成纤维细胞、大鼠髓神经元、大鼠脑膜成纤维细胞和大鼠嗅鞘细胞；以及可被有效地应用于其中难以实现基因转移的ES细胞，例如小鼠TT2 ES细胞和ddy小鼠ES细胞；以及可被有效地应用于其中难以实现基因转移的细胞系，例如人胚胎肺成纤维细胞(TIG-7)、人永生化成纤维细胞(SUSM-1)、人纤维肉瘤细胞(HT1080)、人胰腺癌细胞(MIA-PaCa-2)、人肝细胞瘤细胞(HepG2)、人鳞癌细胞(HSC-2)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人食管癌细胞(TE-1)、人前列腺癌细胞(LNCaP)、人卵巢癌细胞(OVCAR-3)、人成神经细胞瘤细胞(SK-N-SH)、人B-细胞前体白血病细胞(Nalm-6)、人伯基特淋巴瘤(burkitt's lymphoma)细胞(Raji)、小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、小鼠巨噬细胞(RAW264.7)、小鼠胰腺β细胞(MIN6)、大鼠胚胎成纤维细胞(REF)和大鼠心室成肌细胞(H9c2)。
本发明最有效地应用于尤其是列在上面的细胞中的初级细胞、癌细胞、神经细胞和干细胞。
实施例
我们将通过在下面介绍许多的实施例来详细解释我们的发明。但是我们的发明的可应用领域绝不受下面实施例所介绍的应用的限制。
<实施例1>第一电脉冲和第二电脉冲的作用
(1)细胞的制备
将培养基从培养皿内移出，HeLa细胞(人子宫颈癌细胞系:贴壁细胞)在该培养皿中培养。然后将该细胞用0.02%的EDTA-PBS溶液洗涤两次或更多次以去除培养基中所含的血清的影响。然后用胰蛋白酶处理分离该处于附着状态的细胞。
在确认该细胞分离后，通过加入与用于胰蛋白酶处理酶液体相同的体积的电穿孔缓冲液(作为无血清/抗生素培养基的ES培养基(NISSUI PHARMACEUTICAL CO.，LTD.))，然后离心该混合物(约1,000rpm，5min)，来除去胰蛋白酶。
然后弃去上清液。分离的细胞分散于该电穿孔缓冲液中，取样50μL的分散液以用血细胞计数器检测细胞数量。再次进行离心(约1,000rpm，5min)以去除残留的上清液，然后再次向收集的细胞加入电穿孔缓冲液以制备1×107个细胞/900μL的悬浮液。
接下来，将100μL的DNA溶液(pCMV-EGFP载体，浓度1μg/μL)加入上述的悬浮液中，以使总体积为1,000μL。在不引起起泡的小心的足够搅动后，将100μL每种所得悬浮液(细胞：1×106个细胞，DNA：0.1μg/μL)置于2mm间隙的比色皿内。
注意在细胞数量少的情况下，在调整细胞数量期间，将电穿孔缓冲液加至细胞以制备2.5×106个细胞/450μL的悬浮液，然后加入50μL的DNA溶液(pCMV-EGFP载体，浓度：1μg/μL)以使总体积为500μL，然后将50μL每种所得悬浮液(细胞：2.5×105个细胞，DNA：0.1μg/μL)置于2mm间隙比色皿内。
(2)电脉冲处理
将放入了以上制备的细胞的比色皿插入NEPA21电穿孔仪(NEPA GENE Co., Ltd.)的比色皿电极腔内，电脉冲由NEPA21电穿孔仪输出。
如表1所示，然后在存在或缺少第一电脉冲和第二电脉冲以及第二电脉冲的不同频率(样品53-56，60)的不同组合的条件下，进行电穿孔。注意该处理在室温下进行，没有用冰来冷却以防止水滴附着在比色皿上。
注意在放入比色皿后没有经电脉冲处理的样品被用作对照(样品52)。
在电脉冲处理后，将含有血清和抗生素的MEM培养基放入比色皿内。然后将全部体积的液体(包括电脉冲处理后的细胞)用注射器收集，加在装填有含有血清和抗生素的MEM培养基的培养平板上，然后在通常条件(37℃，二氧化碳浓度：5％)下培养。计算存活率(用公式4计算)。此外，通过检测荧光蛋白EGFP来计算基因转移率(用公式5计算)。结果如表1所示。
注意在以下的结果中，对于Hela细胞，使得存活率和基因转移率两者都为40％或更高的条件可确定为合适的。此外，对于其中每一种都极难实现基因转移的一系列细胞，使得两个值都为约10％的条件也可确定为合适的。
[数学式4]
存活率=电脉冲处理后的存活细胞数/电脉冲处理前的细胞数×100???(公式4)
[数学式5]
基因转移率=基因转移细胞的数量/电脉冲处理后存活细胞的数量×100???(公式5)
结果显示了通过连续地施加合适的第一电脉冲和第二电脉冲，存活率和基因转移率两者都得到急剧提高。
注意在没有施加第一电脉冲的情况中，基因转移本身并不发生。该结果提示了施加第一电脉冲的过程是在细胞膜上制造微孔以通过该微孔将外源DNA转移入细胞内的必要过程。
结果还显示了通过施加第二电脉冲显著地提高存活率，并且通过增加第二电脉冲的频率(两次或更多次，最佳10次)额外地提高存活率。该结果提示了第二电脉冲具有加速恢复由施加第一电脉冲所形成的微孔的作用
[表1-A]
[表1-B]
。
<实施例2>第一电脉冲电压的检验(1)
如表2所示，通过改变它的电压来施加第一电脉冲。电穿孔的其它条件与实施例1相同(样品2-11)。
注意在放入比色皿后没有经电脉冲处理的样品被用作对照(样品1)。
存活率和基因转移率以与实施例1相同的方式计算。结果如表2所示。
结果显示了当调节第一电脉冲的电压以控制在电场强度=500-875 V/cm和总热量强度=1.39-4.37 J/100μL的范围内时，存活率和基因转移率两者均高达50%或更高。尤其在电场强度=500-750 V/cm和总热量强度=1.39-3.21 J/100μL的情况中，存活率和基因转移率高达80%或更高
[表2-A]
[表2-B]
。
<实施例3>第二电脉冲电压的检验(1)
如表3所示，通过改变它的电压来施加第二电脉冲。电穿孔的其它条件与实施例1相同(样品13-20)。
注意在放入比色皿后没有经电脉冲处理的样品被用作对照(样品12)。
存活率和基因转移率以与实施例1相同的方式计算。结果如表3所示。
结果显示了在合适条件下施加的第二电脉冲可大大地提高存活率。
特别地，当调节第二电脉冲的电压以控制在电场强度=50-250 V/cm和每次脉冲的热量强度=0.13-3.57 J/100μL的范围内时，存活率和基因转移率两者都高达50%或更高。尤其是在电场强度=75-125 V/cm和每次脉冲的热量强度=0.31-0.68 J/100μL的情况中，存活率和基因转移率高达80%或更高
[表3-A]
[表3-B]
。
<实施例4>第二电脉冲电压的检验(2)
如表4所示，通过改变它的电压来施加第二电脉冲。电穿孔的其它条件与实施例1相同(样品57-60)。
注意在放入比色皿后没有经电脉冲处理的样品被用作对照(样品52)。
存活率和基因转移率以与实施例1相同的方式计算。结果如表4所示。
结果显示了在合适条件下施加的第二电脉冲可大大提高存活率。特别地，当调节第二电脉冲的电压以控制在电场强度=15-100 V/cm和每次脉冲的热量强度=0.01-0.59 J/100μL的范围内时，存活率和基因转移率两者均高达60%或更高。尤其是在电场强度=35-100 V/cm和每次脉冲的热量强度=0.07-0.59 J/100μL的情况中，存活率和基因转移率为80%或更高
[表4-A]
[表4-B]
。
<实施例5>第一电脉冲电场强度的检验(1)
如表5所示，通过改变它的电压和脉冲长度使得保持热量强度恒定来施加第一电脉冲。电穿孔的其它条件与实施例1相同(样品28-36)。
注意在放入比色皿后没有经电脉冲处理的样品被用作对照(样品27)。
存活率和基因转移率以与实施例1相同的方式计算。结果如表5所示。
结果显示了即使第一电脉冲的总热量强度保持几乎恒定(1.69-2.35 J/100μL)，在250 V/cm或更低(小于357 V/cm)的电场强度下，基因转移从未实现。
该结果提示了等于或大于特定值的电场强度对使第一电脉冲的作用能够得以展现是必要的
[表5-A]
[表5-B]
。
<实施例6>第一电脉冲电场强度的检验(2)
如表6所示，通过改变它的电压和脉冲长度使得保持热量强度恒定来施加第一电脉冲。电穿孔的其它条件与实施例1相同(样品104-112)。
注意在放入比色皿后没有经电脉冲处理的样品被用作对照(样品103)。
存活率和基因转移率以与实施例1相同的方式计算。结果如表6所示。
结果显示了即使施加4,500 V/cm的高电场强度，通过保持第一电脉冲的热量强度几乎恒定(1.66-2.08 J/100μL)仍获得了高的存活率和基因转移率。
该结果提示了第一电脉冲的热量强度(不是电压本身)对存活率有影响
[表6-A]
[表6-B]
。
<实施例7>第一电脉冲脉冲长度的检验
如表7所示，通过在恒定的电场强度下改变它的脉冲长度来施加第一电脉冲。电穿孔的其它条件与实施例1相同(样品76-78)。
存活率和基因转移率以与实施例1相同的方式计算。结果如表7所示。
结果显示了在保持其电场强度=500 V/cm恒定下，通过施加短脉冲长度(=10-20毫秒)的第一电脉冲，获得了极高的存活率和基因转移率(两个率=90%或更高)。
但是在脉冲长度长达30毫秒的情况中，观察到存活率下降。认为热量强度的增大导致存活率下降
[表7-A]
[表7-B]
。
<实施例8>第一电脉冲脉冲频率的检验(1)
如表8所示，通过改变它的脉冲频率和脉冲长度来施加第一电脉冲。电穿孔的其它条件与实施例1相同(样品71-74)。
注意在放入比色皿后没有经电脉冲处理的样品被用作对照(样品70)。
存活率和基因转移率以与实施例1相同的方式计算。结果如表8所示。
结果显示了当施加第一电脉冲使得总热量强度保持恒定时，获得了相似的存活率和基因转移率的结果(样品71-73)。
但是结果显示了在通过仅增加频率使总热量强度变得过分高的情况中，获得了降低的存活率(样品71和74)。
这些结果提示了第一电脉冲的总热量强度(不是每次脉冲的热量强度)对存活率和基因转移率有影响
[表8-A]
[表8-B]
。
<实施例9>第一电脉冲脉冲频率的检验(2)
如表9所示，通过改变它的脉冲频率和脉冲长度来施加第一电脉冲。电穿孔的其它条件与实施例1相同(样品179-190)。
注意在放入比色皿后没有经电脉冲处理的样品被用作对照(样品178)。
存活率和基因转移率以与实施例1相同的方式计算。结果如表9所示。
结果显示了即使每次脉冲的热量强度较低(举例来说，在样品182、184-188中，小于0.2 J/100μL)，通过增加频率以增加总热量强度，来提高基因转移率。
但是结果提示了在总热量强度为0.286 J/100μL或更低的情况下，即使频率增加(样品189和190)，基因转移从未实现
[表9-A]
[表9-B]
。
<实施例10>第一电脉冲的热量(V2I√T)的检验
如表10所示，通过改变它的电压和脉冲长度使得保持V2I√T(热量值)恒定来施加第一电脉冲。电穿孔的其它条件与实施例1相同(样品62-67)。
注意在放入比色皿后没有经电脉冲处理的样品被用作对照(样品61)。
存活率和基因转移率以与实施例1相同的方式计算。结果如表10所示。
结果显示了存活率和基因转移率与第一电脉冲的V2I√T(热量值)没有相关性，而是取决于它的热量强度(J/100μL)和电场强度(V/cm)
[表10-A]
[表10-B]
。
<实施例11>第一电脉冲的热量(V2IT)的检验
如表11所示，通过改变它的电压和脉冲长度使得保持V2IT值(热量值)恒定来施加第一电脉冲。电穿孔的其它条件与实施例1相同(样品113-122)。
注意在放入比色皿后没有经电脉冲处理的样品被用作对照(样品113)。
存活率和基因转移率以与实施例1相同的方式计算。结果如表11所示。
结果显示了存活率和基因转移率与第一电脉冲的V2IT(热量值)没有相关性而是取决于它的热量强度(J/100μL)。
结果还显示了当热量强度下降至低于约0.28 J/100μL时，基因转移率会大大降低
[表11-A]
[表11-B]
。
<实施例12>第一电脉冲的热量(VI√T)的检验
如表12所示，通过改变它的电压和脉冲长度使得保持它的热量强度恒定来施加第一电脉冲。电穿孔的其它条件与实施例1相同(样品124-131)。
注意在放入比色皿后没有经电脉冲处理的样品被用作对照(样品123)。
存活率和基因转移率以与实施例1相同的方式计算。结果如表12所示。
结果显示了存活率和基因转移率与第一电脉冲的VI√T(热量值)没有相关性，而是取决于热量强度(J/100μL)。
结果还显示了当热量强度下降至低于约0.34 J/100μL时，基因转移率会大大降低
[表12-A]
[表12-B]
。
<实施例13>第二电脉冲脉冲频率的检验
如表13所示，通过改变它的脉冲频率来施加第二电脉冲。电穿孔的其它条件与实施例1相同(样品22-26)。
注意在放入比色皿后没有经电脉冲处理的样品被用作对照(样品21)。
存活率和基因转移率以与实施例1相同的方式计算。结果如表13所示。
结果显示了重复施加第二电脉冲(多于3次，最佳10次)能够进一步提高存活率
[表13-A]
[表13-B]
。
<实施例14>第一电脉冲和第二电脉冲之间的脉冲间隔的检验(1)
如表14所示，通过改变第一电脉冲和第二电脉冲之间的脉冲间隔来施加电脉冲。电穿孔的其它条件与实施例1相同(样品38-44)。
注意在放入比色皿后没有经电脉冲处理的样品被用作对照(样品37)。
存活率和基因转移率以与实施例1相同的方式计算。结果如表14所示。
结果显示了较短的脉冲间隔倾向于引起较高的存活率，而较长的脉冲间隔倾向于引起较低的存活率，尤其是通过将脉冲间隔设置为99.9毫秒(约0.1秒)或更短，大大提高存活率。
但是结果提示了甚至在脉冲间隔长达1分钟下，获得了比较高的存活率
[表14-A]
[表14-B]
。
<实施例15>第一电脉冲和第二电脉冲之间的脉冲间隔的检验(2)
如表15所示，通过改变第一电脉冲和第二电脉冲之间的脉冲间隔来施加电脉冲。电穿孔的其它条件与实施例1相同(样品46-51)。
注意在放入比色皿后没有经电脉冲处理的样品被用作对照(样品45)。
存活率和基因转移率以与实施例1相同的方式计算。结果如表15所示。
结果显示了较短的脉冲间隔倾向于引起较高的存活率，而较长的脉冲间隔倾向于引起较低的存活率，尤其是通过将脉冲间隔设置为99.9毫秒(约0.1秒)或更短，大大提高存活率。
但是结果提示了甚至在脉冲间隔长达1分钟下，获得了比较高的存活率
[表15-A]
[表15-B]
。
<实施例16>缓冲液体积的检验(1)
如表16所示，通过改变缓冲液的体积来进行电穿孔。电穿孔的其它条件与实施例1相同(样品85-92)。
注意在放入比色皿后没有经电脉冲处理的样品被用作对照(样品84)。
存活率和基因转移率以与实施例1相同的方式计算。结果如表16所示。
结果显示了在100μL的电穿孔条件(电场强度和热量强度)也可适用于缓冲液体积=100-400μL的情况
[表16-A]
[表16-B]
。
<实施例17>缓冲液体积的检验(2)
如表17所示，通过改变缓冲液的体积来进行电穿孔。电穿孔的其它条件与实施例1相同(样品147-151)。
注意在放入比色皿后没有经电脉冲处理的样品被用作对照(样品146)。
存活率和基因转移率以与实施例1相同的方式计算。结果如表17所示。
结果显示了在100μL的电穿孔条件(电场强度和热量强度)也可适用于缓冲液体积=50-400μL的情况
[表17-A]
[表17-B]
。
<实施例18>通过使用1mm间隙比色皿的检验(1)
如表18所示，通过经由使用1mm间隙的比色皿改变电压来进行电穿孔。电穿孔的其它条件与实施例1相同(样品80-83)。
注意在放入比色皿后没有经电脉冲处理的样品被用作对照(样品79)。
存活率和基因转移率以与实施例1相同的方式计算。结果如表18所示。
结果显示了在使用2mm间隙比色皿的情况中的电场强度和热量强度的条件也可适用于使用1mm间隙比色皿的情况
[表18-A]
[表18-B]
。
<实施例19>通过使用1mm间隙比色皿的检验(2)
如表19所示，通过经由使用1mm间隙的比色皿改变电压来进行电穿孔。电穿孔的其它条件与实施例1相同(样品133-143)。
注意在放入比色皿后没有经电脉冲处理的样品被用作对照(样品132)。
存活率和基因转移率以与实施例1相同的方式计算。结果如表19所示。
结果显示了在使用2mm间隙比色皿的情况中的电场强度和热量强度的条件也可适用于使用1mm间隙比色皿的情况
[表19-A]
[表19-B]
。
<实施例20>通过使用4mm间隙比色皿的检验(1)
如表20所示，通过经由使用4mm间隙的比色皿改变电压来进行电穿孔。电穿孔的其它条件与实施例1相同(样品154-159)。
注意在放入比色皿后没有经电脉冲处理的样品被用作对照(样品153)。
存活率和基因转移率以与实施例1相同的方式计算。结果如表20所示。
结果显示了在使用2mm间隙比色皿的情况中的电场强度和热量强度的条件也可适用于通过改变电压使用4mm间隙比色皿的情况
[表20-A]
[表20-B]
。
<实施例21>通过使用4mm间隙比色皿的检验(2)
如表21所示，通过经由使用4mm间隙的比色皿改变电压来进行电穿孔。电穿孔的其它条件与实施例1相同(样品161-168)。
注意在放入比色皿后没有经电脉冲处理的样品被用作对照(样品160)。
存活率和基因转移率以与实施例1相同的方式计算。结果如表21所示。
结果显示了在使用2mm间隙比色皿的情况中的电场强度和热量强度的条件也可适用于通过改变电压使用4mm间隙比色皿的情况
[表21-A]
[表21-B]
。
<实施例22>通过使用4mm间隙比色皿的检验(3)
如表22所示，通过经由使用4mm间隙的比色皿改变缓冲液体积来进行电穿孔。电穿孔的其它条件与实施例1相同(样品94-102)。
注意在放入比色皿后没有经电脉冲处理的样品被用作对照(样品93)。
存活率和基因转移率以与实施例1相同的方式计算。结果如表22所示。
结果显示了在使用2mm间隙比色皿的情况中的在100μL的电场强度和热量强度的电穿孔条件也可适用于使用4mm间隙比色皿以及缓冲液体积是200-800μL的情况
[表22-A]
[表22-B]
。
<实施例23>通过使用4mm间隙比色皿的检验(4)
如表23所示，通过经由使用4mm间隙的比色皿改变缓冲液体积来进行电穿孔。电穿孔的其它条件与实施例1相同(样品170-177)。
注意在放入比色皿后没有经电脉冲处理的样品被用作对照(样品169)。
存活率和基因转移率以与实施例1相同的方式计算。结果如表23所示。
结果显示了在使用2mm间隙比色皿的情况中的在100μL的电场强度和热量强度的电穿孔条件也可适用于使用4mm间隙比色皿以及缓冲液体积是200-800μL的情况
[表23-A]
[表23-B]
。
<实施例24>DNA浓度的检验
如表24所示，通过改变DNA浓度来实施电脉冲。电穿孔的其它条件与实施例1相同(样品193-202)。
注意在放入比色皿后没有经电脉冲处理的样品被用作对照(样品192)。
存活率和基因转移率以与实施例1相同的方式计算。结果如表24所示。
结果显示了随着DNA浓度升高，基因转移率升高但存活率降低，但是随着DNA浓度降低，存活率升高但基因转移率降低。
特别地，结果提示了高于0.01μg/μL，尤其是高于0.03-0.5μg/μL的DNA浓度是合适的
[表24-A]
[表24-B]
。
<实施例25>血清浓度的检验
如表25所示，将TIG-7细胞(人胚胎肺细胞)用作靶细胞，通过改变血清浓度将无抗生素的ES培养基用作电穿孔缓冲液。电穿孔的其它条件与实施例1相同(样品204-207)。
注意在放入比色皿后没有经电脉冲处理的样品被用作对照(样品203)。
存活率和基因转移率以与实施例1相同的方式计算。结果如表25所示。
结果显示了当培养基中含有血清时，基因转移率降低。该结果提示了在培养基被用作电穿孔缓冲液的情况中，优选使用通过去除血清获得的无血清培养基。
该结果还提示了与作为癌细胞的Hela细胞(人子宫颈癌细胞)的情况中的条件相同的条件可适用于作为正常细胞的TIG-7细胞(人胚胎肺细胞)
[表25-A]
[表25-B]
。
<实施例26>大鼠胚胎成纤维细胞的检验
如表26所示，将REF细胞(大鼠胚胎成纤维细胞)用作靶细胞，不含有任何血清/抗生素的Opti-MEM培养基(无血清和抗生素的缓冲液)用作电穿孔缓冲液，通过改变脉冲长度和DNA浓度来施加电脉冲。电穿孔的其它条件与实施例1相同(样品215-219)。
注意在放入比色皿后没有经电脉冲处理的样品被用作对照(样品208)。
除了通过采用DMEM培养基进行培养外，存活率和基因转移率以与实施例1相同的方式计算。结果如表26所示。
结果显示了与在人Hela细胞(人子宫颈癌细胞)的情况中的条件相同的条件可适用于大鼠REF细胞(大鼠胚胎成纤维细胞)。
结果还显示了第一电脉冲的稍微较高的总热量强度对REF细胞比对Hela细胞的情况更好
[表26-A]
[表26-B]
。
<实施例27>人肝细胞瘤细胞的检验
如表27所示，将HepG2细胞(人肝细胞瘤细胞)用作靶细胞，不含有任何血清/抗生素的DMEM培养基(无血清和抗生素的缓冲液)用作电穿孔缓冲液，通过改变电压、脉冲长度和DNA浓度来施加电脉冲。电穿孔的其它条件与实施例1相同(样品221-228)。
注意在放入比色皿后没有经电脉冲处理的样品被用作对照(样品220)。
除了通过通过采用DMEM培养基进行培养外，存活率和基因转移率以与实施例1相同的方式计算。结果如表27所示。
结果显示了与在作为子宫颈癌的Hela细胞(人子宫颈癌细胞)的情况中的条件相同的条件可适用于作为肝细胞瘤的HepG2细胞(人肝细胞瘤细胞)。
结果还显示了第一电脉冲的稍微较低的电场强度和较高的热量强度(较长的脉冲长度)对HepG2细胞比对Hela细胞的情况更好
[表27-A]
[表27-B]
。
<实施例28>应用于多种动物细胞
使用表28-32所示的多种细胞(细胞系和初级细胞)，将多种无血清/抗生素的生长培养基用作电穿孔缓冲液，施加适合于多种细胞的电脉冲。电穿孔的其它条件与实施例1相同。多种细胞的典型电脉冲条件如表28-32所示。
除了通过采用多种生长培养基进行培养外，存活率和基因转移率以与实施例1相同的方式计算。结果如表33-36所示。
此外，细胞的照片图像如图1-35所示。在照片图像中，左侧的照片图像各自显示培养后的细胞，右侧的照片图像各自显示检测到的转移基因的荧光标记蛋白(图18、22、26、28、29和31各自仅显示检测到的荧光标记蛋白)。
[表28]
[表29]
[表30]
[表31]
[表32]
这些结果显示了包括在以上条件下施加第一电脉冲和第二电脉冲的电穿孔技术可适用于细胞系以及来源于不同组织的初级细胞。举例来说，结果显示了在神经细胞(图18、19、28和33)和ES细胞(图34和35)中能够以高的存活率和基因转移率进行电穿孔。
此外，结果显示了电穿孔技术不仅可适用于哺乳动物，例如人、小鼠、大鼠、狗和马，而且还可适用于作为昆虫的果蝇(图33)，表明对普遍动物的适用性
[表33]
[表34]
[表35]
[表36]
。
<实施例29>应用于贴壁细胞
首先，将在12孔板中培养的SH-SY5Y细胞(人成神经细胞瘤细胞:贴壁细胞)用PBS洗涤两次。接下来，将含有1μg/μL的DNA(pCMV-EGFP载体)的240-350μL的电穿孔缓冲液加入孔中，将具有腿的贴壁细胞电极(CUC513-5电极)设置在细胞上。
然后将处于附着状态的细胞在表37所示的条件下通过进行电脉冲处理来进行电穿孔。
于是，除了在液体被交换至DMEM培养基之后连续培养外，存活率和基因转移率以与实施例1相同的方式计算。结果如表38所示。
此外，细胞的照片图像如图36所示。在该图中，左侧的照片图像显示培养后的细胞，右侧的照片图像显示检测到的荧光标记蛋白。
[表37]
根据这些结果，表明包括在以上条件下施加第一电脉冲和第二电脉冲的电穿孔技术可直接适用于处于附着状态的细胞
[表38]
。
工业可应用性
预期本发明有用地应用于广泛的工业领域中的试验和研究，所述领域为例如医学、食品、农业和其它领域。
此外，本发明允许以低成本有效地制备有用的动物基因转移细胞(例如iPS细胞、活干细胞)，并且允许将该细胞应用于广泛的工业领域。
机译： 电镀技术的外源基因转移方法
机译： 电镀技术的外源基因转移方法
机译： 电镀技术的外源基因转移方法
