利用骨髓间充质干细胞和/或多能干细胞的血中动员的组织再生促进剂

摘要

通过本发明可知，当静脉内投予HMGB-1及S100A8时，骨髓源性细胞被动员至皮肤溃疡部位促进皮肤溃疡的治愈。另外，在脑梗塞模型小鼠脑中，在脑梗塞制作后静脉投予了HMGB-1的小鼠中，在脑内可见表达神经细胞标记物的骨髓源性细胞。对于脑梗塞灶的缩小效果，与对照相比，在HMGB-1静脉投予小鼠中确认到了显著的改善效果。对于脑梗塞后的存活率，HMGB-1静脉投予例中存活率提高。使用小鼠确认骨折治愈过程中骨髓多能干细胞的参与，结果显示，损伤部位远处的骨髓源性细胞移动至骨折部分进行损伤组织的修复。

说明书

技术领域

本发明涉及投予至与需要再生的组织不同的组织中的组织再生促进 剂。

背景技术

再生医疗是以损伤器官的功能性、器质性再生为目的的医疗，其利用 在体外进行了培养和加工的细胞或组织。例如，皮肤培养片等是将在体外 对从本人或他人采集的皮肤细胞进行培养并加工成片状的制品移植到损伤 皮肤上。再生医疗中，为了确保治疗所使用的细胞，需要在体外对细胞进 行培养增殖。通过培养操作，有可能会发生细胞的劣化（老化、肿瘤化、 细菌和病毒等的污染），因此为了维持安全性需要在保证GMP标准的设施 内进行制造，从而可预想到治疗费用的高额化将成为课题。

另一方面，已知生物体在器官损伤时具备损伤部位的修复再生机制， 但损伤部位很大时，非功能性的疤痕组织会占据损伤部位。带有这种疤痕 组织的损伤治愈在脑梗塞或脊髄损伤中成为神经再生的抑制因子、在心肌 梗塞中成为心脏破裂的要因、在大面积烧伤或手术创伤中变为疤痕疙瘩等、 在生命预后、美容方面成为明显损害QOL的原因。如果能够活化生物体所 具有的损伤组织的修复再生机制，则可以期待在不发生疤痕治愈的情况下 诱导利用功能性组织的损伤组织（器官）的再生。

已知在骨髄内除了分化成白细胞或红细胞等的造血干细胞之外，还存 在能够分化成骨、软骨、脂肪等的间充质干细胞，近年来还得知存在能够 分化成上皮系或神经系细胞的多能干细胞。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2008/053892

发明内容

发明要解决的技术问题

在现有的治疗方法中，对于治愈困难的大面积皮肤溃疡、难治性骨折、 脑梗塞等难治性疾病，开发通过生理性修复再生机制的活化来诱导损伤组 织的治愈的新型治疗方法成为课题。

用于解决技术问题的方法

在使用小鼠确认皮肤溃疡部位治愈过程中HMGB-1及S100A8的将骨 髓源性细胞向皮肤溃疡部的动员效果时可知：通过向相对于皮肤溃疡部远 且不同位置的静脉血内投予HMGB-1或S100A8，骨髓源性细胞被动员到皮 肤溃疡部位。接着，在确认HMGB-1及S100A8的静脉内投予所产生的皮 肤溃疡治愈促进效果时显示：通过将它们投予至距离溃疡部位远且不同位 置的血管内，成功地促进了皮肤溃疡的治愈。进而，在确认皮肤溃疡的非 疤痕性治愈促进效果时显示：通过将HMGB-1进行静脉内投予，可以促进 已被动员至血液中的骨髓源性细胞向溃疡部分的进一步动员，从而可以促 进皮肤溃疡的早期闭合和非疤痕性治愈。

另外，在确认脑梗塞模型小鼠脑中的骨髓源性细胞的存在时显示：对 于制作脑梗塞后静脉投予了HMGB-1的小鼠，在脑内确认到了表达神经细 胞标记物的骨髓源性细胞。接着，在确认脑梗塞灶的缩小效果时显示：与 对照小鼠相比，HMGB-1静脉投予小鼠中，对于脑梗塞灶确认到了显著的 改善效果。另外，在确认脑梗塞后的存活率改善时显示：在HMGB-1静脉 投予例中小鼠的存活率提高。

进而，在使用小鼠确认在骨折治愈过程中骨折部以外部位的骨髓多能 干细胞的相关性时可知：损伤部位远处的骨髓源性细胞移动至骨折部分进 行损伤组织的修复。

进而，使用骨折模型小鼠评价HMGB1静脉投予所产生的骨髓间充质 干细胞向损伤部位的动员活性时可知：通过HMGB1的静脉内投予，已被 动员至血中的骨髓间充质干细胞聚集至骨折部分。

本申请基于上述所知而提供以下的发明。

（1）一种药剂，其为含有以下（a）~（q）中任一项所述的物质的组 织再生促进剂，且其被投予至与需要再生的组织不同的组织；

（a）HMGB1蛋白质

（b）分泌HMGB1蛋白质的细胞

（c）插入有编码HMGB1蛋白质的DNA的载体

（d）HMGB2蛋白质

（e）分泌HMGB2蛋白质的细胞

（f）插入有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体

（g）HMGB3蛋白质

（h）分泌HMGB3蛋白质的细胞

（i）插入有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体

（j）S100A8蛋白质

（k）分泌S100A8蛋白质的细胞

（l）插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体

（m）S100A9蛋白质

（n）分泌S100A9蛋白质的细胞

（o）插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体

（p）细胞或组织的提取液

（q）细胞或组织的提取液的肝素结合级分。

（2）上述（1）所述的药剂，其被非经口投予。

（3）上述（2）所述的药剂，其为注射投予。

（4）上述（1）所述的药剂，其被投予至血管内、肌肉内、皮下、皮 内或腹腔内。

（5）上述（1）~（4）任一项所述的药剂，其中，细胞或组织的提取 液是通过包含将细胞或组织浸渍在溶剂中的工序的方法来制造。

（6）上述（1）~（4）任一项所述的药剂，其中，细胞或组织的提取 液的肝素结合级分是通过包含以下工序的方法来制造：

（a）将细胞或组织浸渍在溶剂中的工序、

（b）使工序（a）中获得的提取液与固定化肝素接触的工序、和

（c）从固定化肝素中洗脱肝素结合级分的工序。

（7）上述（1）~（6）任一项所述的药剂，其被用于神经组织、骨组 织或皮肤组织的再生促进。

（8）一种组织再生促进试剂盒，其包含含有以下（a）~（q）中任一 项所述的物质的组合物，该组合物被投予至与需要再生的组织不同的组织；

（a）HMGB1蛋白质

（b）分泌HMGB1蛋白质的细胞

（c）插入有编码HMGB1蛋白质的DNA的载体

（d）HMGB2蛋白质

（e）分泌HMGB2蛋白质的细胞

（f）插入有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体

（g）HMGB3蛋白质

（h）分泌HMGB3蛋白质的细胞

（i）插入有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体

（j）S100A8蛋白质

（k）分泌S100A8蛋白质的细胞

（l）插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体

（m）S100A9蛋白质

（n）分泌S100A9蛋白质的细胞

（o）插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体

（p）细胞或组织的提取液

（q）细胞或组织的提取液的肝素结合级分。

（9）上述（8）所述的试剂盒，其被非经口投予。

（10）上述（9）所述的试剂盒，其为注射投予。

（11）上述（8）所述的试剂盒，其被投予至血管内、肌肉内、皮下、 皮内或腹腔内。

（12）上述（8）～（11）任一项所述的试剂盒，其被用于神经组织、 骨组织或皮肤组织的再生促进。

（13）一种促进组织再生的方法，其包含：将有效量的含有以下（a） ~（q）中任一项所述的物质的组合物投予至与需要再生的组织不同的组织 的工序；

（a）HMGB1蛋白质

（b）分泌HMGB1蛋白质的细胞

（c）插入有编码HMGB1蛋白质的DNA的载体

（d）HMGB2蛋白质

（e）分泌HMGB2蛋白质的细胞

（f）插入有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体

（g）HMGB3蛋白质

（h）分泌HMGB3蛋白质的细胞

（i）插入有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体

（j）S100A8蛋白质

（k）分泌S100A8蛋白质的细胞

（l）插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体

（m）S100A9蛋白质

（n）分泌S100A9蛋白质的细胞

（o）插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体

（p）细胞或组织的提取液

（q）细胞或组织的提取液的肝素结合级分。

（14）上述（13）所述的方法，其中，为非经口投予。

（15）上述（14）所述的方法，其中，为注射投予。

（16）上述（13）所述的方法，其中，向血管内、肌肉内、皮下、皮 内或腹腔内进行投予。

（17）上述（13）～（16）任一项所述的方法，其促进神经组织、骨 组织或皮肤组织的再生。

（18）一种含有以下（a）~（q）中任一项所述的物质的组合物在组织 再生促进剂的制造中的用途，其中，该组织再生促进剂被投予至与需要再 生的组织不同的组织；

（a）HMGB1蛋白质

（b）分泌HMGB1蛋白质的细胞

（c）插入有编码HMGB1蛋白质的DNA的载体

（d）HMGB2蛋白质

（e）分泌HMGB2蛋白质的细胞

（f）插入有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体

（g）HMGB3蛋白质

（h）分泌HMGB3蛋白质的细胞

（i）插入有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体

（j）S100A8蛋白质

（k）分泌S100A8蛋白质的细胞

（l）插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体

（m）S100A9蛋白质

（n）分泌S100A9蛋白质的细胞

（o）插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体

（p）细胞或组织的提取液

（q）细胞或组织的提取液的肝素结合级分。

（19）上述（18）所述的用途，其中，所述组织再生促进剂被非经口 投予。

（20）上述（19）所述的用途，其中，为注射投予。

（21）上述（18）所述的用途，其中，所述组织再生促进剂被投予至 血管内、肌肉内、皮下、皮内或腹腔内。

（22）上述（18）～（21）任一项所述的用途，其中，所述组织再生 促进剂为神经组织、骨组织或皮肤组织的再生促进剂。

（23）一种组合物，其为用于在促进组织再生的方法中使用的、含有 以下（a）~（q）中任一项所述的物质的组合物，其被投予至与需要再生的 组织不同的组织；

（a）HMGB1蛋白质

（b）分泌HMGB1蛋白质的细胞

（c）插入有编码HMGB1蛋白质的DNA的载体

（d）HMGB2蛋白质

（e）分泌HMGB2蛋白质的细胞

（f）插入有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体

（g）HMGB3蛋白质

（h）分泌HMGB3蛋白质的细胞

（i）插入有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体

（j）S100A8蛋白质

（k）分泌S100A8蛋白质的细胞

（l）插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体

（m）S100A9蛋白质

（n）分泌S100A9蛋白质的细胞

（o）插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体

（p）细胞或组织的提取液

（q）细胞或组织的提取液的肝素结合级分。

（24）上述（23）所述的组合物，其被非经口投予。

（25）上述（24）所述的组合物，其中，为注射投予。

（26）上述（23）所述的组合物，其被投予至血管内、肌肉内、皮下、 皮内或腹腔内。

（27）上述（23）~（26）任一项所述的组合物，其中，促进组织再生 的方法是促进神经组织、骨组织或皮肤组织的再生的方法。

发明效果

作为损伤组织再生药品，已知HGF、EGF、VEGF、FGF等细胞增殖因 子，但这些物质是被直接投予至损伤部位及其附近组织以期待促进细胞增 殖来进行使用的。

HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8、S100A9具有动员骨髓多能干 细胞的活性。骨髓多能干细胞除了能分化成间充质细胞之外，还可分化成 上皮系或神经系的细胞。在大面积的组织损伤时，只要能够介由血流将骨 髓多能干细胞动员至损伤部位，则可期待促进骨髓多能干细胞所带来的生 理性损伤组织的修复再生。

通过本发明，提供了下述方法：通过利用静脉内投予等方法将作为骨 髓多能干细胞动员因子的HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8、S100A9 投予至远离损伤部位的远处部位，从而将骨髓多能干细胞动员至末梢血中， 由此促进损伤组织修复。例如，在治疗如脑梗塞那样的体内深部器官的疾 病时，很难将治疗药直接投予至损伤部位（脑）。而本发明中，由于使在 通常诊疗中广泛实施的静脉投予的治疗成为可能，因而可以以任意的次数、 浓度将治疗药安全且简便地投予，这是比现有的治疗方法更优异的效果。

另外，作为最近开发出的使用了骨髄细胞的脑梗塞的治疗方法，已知 从患者本人的骨髄采集细胞并再次投予到血液循环中的方法是有效的，但 在采集骨髄细胞时由于需要将很粗的针刺入体内深部的骨髄进行抽吸，因 而不可避免地伴有严重的侵袭。与此相对，在本发明中，通过将药剂进行 静脉内投予，可以将骨髄细胞直接动员至血液循环中，因而即便多次向脑 梗塞患者投予，也不会伴有严重的侵袭。

骨髄来源的多能干细胞具有分化成间充质细胞、上皮系细胞、神经系 细胞等多种细胞的潜在能力，认为在移动至损伤部位后根据周围的微环境 进行分化并诱导组织修复。在再生医疗或细胞治疗中，是在生物体外将稀 少的骨髓多能干细胞进行培养并使其增殖后用于治疗，但与以往的药品不 同，由于具有在培养过程中可能发生的细胞的劣化（癌化或细菌、病毒等 的污染）的危险，因而需要充分的安全管理。本发明中，通过投予HMGB1、 HMGB2、HMGB3、S100A8、S100A9而将骨髓多能干细胞动员至末梢循环 血内，但由于不需要将细胞取出至体外以施加人工操作，因而是安全性高 的治疗方法。

附图说明

图1为表示HMGB1的纯化过程的照片。将在HMGB1的N末端侧含 有利用GST-标签6XHis-标签HRV3C获得的剪切序列的表达载体转染至 HEK293。使培养上清结合于镍柱，用咪唑对结合级分进行洗脱。进而，将 镍柱结合级分利用HRV3C从HMGB1中剪切GST-标签6XHis标签后，使 其结合在肝素亲和柱上，利用氯化钠进行洗脱。使肝素结合级分结合在Q 柱上，利用氯化钠进行洗脱。为了检测各个纯化过程的纯化度，对结合在 柱上的级分进行SDS-PAGE后，进行考马斯染色。

图2为表示溃疡闭合后的皮肤和皮肤的薄切片的GFP信号的照片。在 GFP骨髄移植小鼠的背中制作皮肤溃疡，经静脉投予HMGB1或S100A8。 经静脉投予了HMGB1和S100A8的小鼠的皮肤上与对照相比，检测到更多 量的为GFP阳性的骨髓源性细胞。

图3为表示经时测定的皮肤溃疡面积的曲线。在小鼠的背中制作皮肤 溃疡，经静脉投予HMGB1或S100A8。制作溃疡后第3天，与对照组相比， 在HMGB1投予组中可见皮肤溃疡的缩小效果。在制作溃疡后第7天，与 对照组相比，在S100A8投予组中可见皮肤溃疡的缩小效果（纵轴：溃疡面 积÷皮肤溃疡制作时的面积×100，横轴：皮肤溃疡制作后的天数）。

图4为表示皮肤溃疡闭合后对皮肤的薄切片进行了苏木精伊红染色 （HE）、Masson三色染色（MT）后的结果的照片。在小鼠的背中制作皮 肤溃疡，经静脉投予HMGB1。在对照小鼠中可见胶原纤维异常增加，而经 静脉投予了HMGB1的小鼠中抑制了胶原纤维的异常增加。

图5为表示巢蛋白（神经干细胞标记物）和βIII微管蛋白（神经元标 记物）表达细胞的检测结果的照片。在GFP骨髄移植小鼠中制作脑梗塞， 经静脉投予HMGB1来进行治疗。治疗结束后，制作脑的薄切片进行免疫 组织化学。左侧照片的箭头所示的细胞为GFP阳性且巢蛋白阳性的细胞。 右侧照片的箭头所示的细胞为GFP阳性且βIII微管蛋白阳性的细胞。确认 了骨髄来源的细胞表达神经标记物。

图6为表示梗塞部位的检测结果的照片。制作脑梗塞疾病模型小鼠， 经静脉投予HMGB1。治疗结束后，制作脑的薄切片，进行尼氏染色。在 PBS投予例（对照）中皮质可见坏死的组织，在HMGB1治疗例中皮质未 见坏死的组织。

图7为表示脑梗塞制作后7天的存活率的曲线。制作脑梗塞疾病模型 小鼠（缺血45分钟、缺血60分钟）后，进行经静脉投予HMGB1所实施 的治疗。在缺血45分钟、缺血60分钟的任一情况下，都确认了通过利用 HMGB1的治疗所带来的存活率的改善。

图8为表示在通过皮肤结合的GFP骨髄移植小鼠和野生型小鼠中，GFP 骨髄嵌合体小鼠的骨髄细胞移动至野生型小鼠的右足骨折部位并分化成成 骨细胞的照片。通过皮肤将GFP骨髄移植小鼠和野生型小鼠结合、在野生 型小鼠中制作骨折。在骨折部位的治愈后，在表达骨钙素的成骨细胞中存 在GFP阳性细胞。教示了：在骨折的治愈过程中，距离损伤部位远的骨髓 源性细胞移动至骨折部位并分化成成骨细胞，从而进行生理性损伤治愈。

图9为表示在向GFP骨髄移植小鼠背部移植皮肤后所观察到的对移植 皮肤片的GFP荧光聚集的照片。上面左侧的照片表示皮肤移植部的肉眼图 像、上面中央的照片表示在移植皮肤与受体皮肤的边界部（用“↓”表示的部 分）附近处受体皮肤的HE组织图像、上面右侧照片表示植皮皮肤的HE组 织图像。另外，下面左侧照片表示对植皮皮肤的GFP荧光的聚集、下面中 央的照片表示植皮部的放大图像、下面右侧照片表示对该放大部皮肤的 GFP荧光的聚集。

图10为表示在GFP骨髄移植小鼠背部上的移植皮肤片中聚集的骨髄来 源的表皮细胞、骨髄来源的真皮成纤维细胞的照片。左侧开始第1列是DAPI 染色（核染色），上面的照片表示植皮部皮肤的弱放大图像（100倍）；中 间照片以其强放大图像（200倍）表示表皮/真皮边界部；下面以其强放大 图像（200倍）表示毛囊部。左侧开始第2列表示第1列的各个区域的GFP 荧光图像、左侧开始第3列表示其角蛋白5（K5）的免疫染色图像、左侧 开始第4列表示将各个荧光重叠后的图像（Merge）。观察到了多个GFP 阳性表皮细胞和真皮成纤维细胞。

图11为表示使用了Boyden小室的皮肤提取液的骨髄来源间充质干细 胞迁移能力活性测定结果的照片。上面左侧照片是使用蓝色色素对骨髓间 充质干细胞进行了染色的图像，所述骨髓间充质干细胞从Boyden小室的上 槽内通过硅膜上的微孔迁移至皮肤提取液侧（下槽侧）并附着在硅膜下槽 侧，从上开始表示刚开始培养后（0h）、12小时后（12h）、24小时后（24h） 的染色图像（各4个孔）。上面右侧照片表示0h的强放大图像、下面左侧 照片表示12h的强放大图像、下面右侧照片表示24h的强放大图像。

图12为表示皮肤提取液纯化级分标准品组的使用了Boyden小室的骨 髄来源间充质干细胞迁移能力活性测定结果与各个纯化级分标准品的 SDS-PAGE电泳结果的对应的照片。左侧开始第1泳道（M.W.）表示电泳 了分子量标记物后的银染色图像、第2泳道（C.E.）表示电泳了纯化前皮肤 提取液后的银染色图像、第3泳道（H.A.）表示电泳了肝素亲和柱结合级 分（中间纯化级分）后的银染色图像、第4～13泳道（A.E.）表示电泳了以 各种NaCl浓度洗脱出的阴离子交换柱结合级分（最终纯化级分）后的银染 色图像。进而，将骨髄来源间充质干细胞迁移活性最强的最终纯化级分序 号4的电泳凝胶银染色图像（泳道7）的各染色带切出，进行质谱分析和数 据库解析，结果明确了“←”所示的条带是HMGB1。

图13为表示使用了Boyden小室的HMGB1的骨髄来源间充质干细胞 迁移能力活性测定结果的照片。上面两个表示迁移至皮肤提取液中的骨髄 来源间充质干细胞的染色图像、中间两个表示迁移至HMGB1纯化标准品 的骨髄来源间充质干细胞的染色图像、下面表示迁移至在中间使用的 HMGB1纯化标准品中添加抗HMGB1多克隆抗体而进行了中和的溶液中的 骨髄来源间充质干细胞的染色图像（迁移活性基本消失）。

图14为表示HMGB1的生物体内骨髄来源间充质干细胞动员活性的照 片。HMGB1级分（最终纯化级分序号4）显示出了对照（最终纯化级分序 号1）的约3倍的动员活性。

图15为利用HMGB1级分（最终纯化级分序号4）在生物体内被动员 了的细胞的强放大照片。

图16为刚开始培养迁移到硅管内的细胞后的照片。左侧照片表示接种 于培养基内的迁移细胞的明视野图像、右侧照片表示其暗视野的GFP荧光 图像。

图17为开始培养迁移到硅管内的细胞24小时后的照片。左侧照片表 示附着在培养塑料培养皿上进行增殖的成纤维细胞样细胞和上皮细胞样细 胞的明视野图像、右侧照片表示其暗视野的GFP荧光图像。

图18为开始培养迁移到硅管内的细胞2周后的照片。左右侧照片为同 一视野、左侧照片是明视野、右侧照片通过荧光滤波器（B和D是检测GFP 的荧光、F是检测角蛋白5的荧光）的照片。在塑料培养皿上圆形地形成集 落的骨髄来源GFP阳性细胞团的左侧可见线状的毛发状形态<用△（箭头） 表示>。F表示骨髓源性细胞呈现毛发状的形态变化并进一步表达角蛋白5 （用△（箭头）表示）。

图19为使用Western blot法检测新生小鼠皮肤提取液中的HMGB家族 的照片。

图20为表示哺乳类细胞的HMGB家族的表达载体的MAP的图。大量 地合成带有巨细胞病毒增强子和鸡β-肌动蛋白启动子、处于启动子下游的 HMGB家族的cDNA（complementary DNA，互补DNA）所编码的mRNA。

图21为表示在HEK293细胞中表达的纯化重组Flag标签-HMGB家族 融合蛋白的Western blot结果的照片。

图22为表示使用了Boyden小室的重组HMGB1、HMGB2、HMGB3 的骨髓间充质干细胞迁移活性的图。任一重组蛋白与对照组相比均显示了 迁移活性。

图23为显示在小鼠的皮肤溃疡治疗模型中HMGB家族的治疗结果的 图。HMGB1、HMGB2、HMGB3与对照组相比均显示了显著地缩小溃疡面 积的效果。

图24为使用Boyden小室确认人HMGB1和人皮肤提取液的使人骨髓 来源的间充质干细胞迁移的活性的照片。

图25为利用肝素柱对小鼠心脏、小鼠脑及小鼠皮肤提取液中的骨髓间 充质干细胞诱导活性物质进行纯化、并使用Boyden小室确认活性的照片。

图26为使用Boyden小室法确认培养细胞株HEK293和HeLa提取液的 人骨髓间充质干细胞迁移活性的照片。任一种培养细胞株均显示了人骨髓 间充质干细胞迁移活性。

图27A为将小鼠固定在脑定位固定装置、用手术刀在头部正中切开并 使用钻进行头部穿孔的照片。B为使用注射器对脑施加负压以抽吸一部分 脑组织的照片。C为注入5μl的溶解于纤维蛋白糊制剂的纤维蛋白原的皮肤 提取液肝素柱纯化级分、接着注入5μl的纤维蛋白糊制剂的凝血酶后的照 片。D和E为脑损伤模型治疗2周后的照片。与对照的D相比，利用皮肤 提取液肝素柱纯化级分的治疗组的E中可见GFP阳性细胞的聚集。F和G 为脑损伤模型治疗6周后的照片。与对照的F相比，利用皮肤提取液肝素 柱纯化级分的治疗组的G中可见GFP阳性细胞的聚集。

图28为从小鼠尾静脉投予皮肤提取液（SE）并采集末梢血的图。

图29为从小鼠尾静脉投予HMGB1并采集末梢血的图。

图30为用抗小鼠PDGFRα抗体、抗小鼠CD44抗体对投予皮肤提取液 （SE）12小时后的小鼠末梢血单核细胞级分进行荧光标记并利用流式细胞 仪进行分级的图。上面3个为阴性对照的PBS投予组（n=3）、下面3个为 皮肤提取液（SE）投予组（n=3）。纵轴表示CD44的表达量、横轴表示 PDGFRα的表达量。蓝线围住的部分表示CD44阳性且PDGFRα阳性细胞 群，其在皮肤提取液投予组（SE）中与PBS组相比有所增加。

图31为用抗小鼠PDGFRα抗体、抗小鼠CD44抗体对HMGB1投予12 小时后的小鼠末梢血单核细胞级分进行荧光标记并利用流式细胞仪进行分 级的图。左侧为阴性对照的PBS投予小鼠的图、右侧为HMGB1投予小鼠 的图。纵轴表示CD44的表达量、横轴表示PDGFRα的表达量。蓝线围住 的部分表示CD44阳性且PDGFRα阳性细胞群，其在HMGB1投予小鼠中 与PBS投予小鼠相比有所增加。

图32A为表示显示了具有CD44和PDGFRα的细胞的存在频率的流式 细胞仪的结果的图。末梢血中的PDGFRα阳性且CD44阳性细胞和PDGFRα 阳性且CD44阴性细胞的任一细胞群均通过HMGB1投予而增加。B为表示 在PBS投予组和HMGB1投予组中对PDGFRα阳性且CD44阳性细胞的末 梢血中出现频率进行比较的结果的图、C为表示在PBS投予组和HMGB1 投予组中对PDGFRα阳性且CD44阴性细胞的末梢血中出现频率进行比较 的结果的图。对于任一细胞群均是在HMGB1投予组中发生了统计学上显 著的增加。

图33为表示在向GFP骨髄移植小鼠背部移植皮肤后观察到的对移植皮 肤片的GFP荧光聚集的照片。左侧照片（A）用DAPI对细胞核进行了染色。 中央的照片（B）用绿色荧光色表示聚集在植皮部的GFP阳性骨髓源性细 胞。右侧照片（C）是将照片（A）和照片（B）重叠后的图。骨髓源性细 胞将皮肤组织进行再构建。

图34为表示使用了Boyden小室的皮肤提取液的骨髄来源间充质干细 胞迁移能力活性测定结果的照片。是用蓝色色素对骨髓间充质干细胞进行 了染色的图像，所述骨髓间充质干细胞从Boyden小室的上槽内通过带有 8μm微孔的聚碳酸酯膜的微孔迁移至含有皮肤提取液的下槽侧并附着在膜 下槽侧。在下层中加入有从2日龄小鼠和6周龄小鼠采集的皮肤的提取液。

图35为利用Western blot法确认皮肤提取液中的S100A8、S100A9蛋 白的存在的照片。

图36为表示将皮肤提取液中的肝素结合蛋白质从肝素亲和柱利用 NaCl浓度梯度进行洗脱的结果的照片。各馏分的蛋白质利用SDS-PAGE进 行分级并用银染色进行检测。

图37为表示使用了Boyden小室的皮肤提取液对骨髓来源的间充质干 细胞的迁移能力活性的测定结果的照片。其是用蓝色色素对骨髓间充质干 细胞进行染色而得到的图像，所述骨髓间充质干细胞从Boyden小室的上槽 内通过膜上的微孔迁移到皮肤提取液的经肝素结合的各级分（下槽侧）中 并附着于膜下槽侧。

图38为使用Western blot法检测皮肤提取液的经肝素结合的各级分中 S100A8、S100A9蛋白的存在的结果的照片。

图39为S100A8、S100A9表达载体的图。

图40为表示使用了Boyden小室的皮肤提取液对骨髓来源的间充质干 细胞的迁移能力活性的测定结果的照片。其是用蓝色色素对骨髓间充质干 细胞进行染色而得到的图像，所述骨髓间充质干细胞从Boyden小室的上槽 内通过膜上的微孔迁移到分别含有重组GST-S100A8、GST-S100A9、皮肤 提取液的下层侧并附着于膜下槽侧。

图41A为从小鼠的尾静脉投予GST-S100A8、GST-S100A9并对12小 时后末梢血中的CD45阴性细胞的级分进行CD44、PDGFRα、PDGFRβ的 FACS的图。B是用棒状图进行表示，左图表示在CD45阴性细胞群中CD44 阳性、PDGFRα阳性的细胞群的比例；右图表示在CD45阴性细胞群中CD44 阳性、PDGFRβ阳性的细胞群的比例。

图42为表示使用抗CD11b MACS珠对PDGF受体α-GFP敲入小鼠骨 髄来源的附着细胞进行分选后的细胞的照片。CD11b阳性的细胞几乎未见 GFP的表达。CD11b阴性的几乎所有细胞中均可见GFP的表达。CD11b阳 性细胞表示PDGF受体α阴性、CD11b阴性细胞表示PDGF受体α阳性。

图43为表示HMGB1对作为CD11b阳性细胞的巨噬细胞几乎没有迁移 活性而对作为CD11b阴性细胞的间充质干细胞具有迁移活性的照片。

图44为表示在PDGF受体αGFP小鼠上制作骨折后通过GFP荧光（绿 色荧光）观察骨折部位处的骨髓间充质细胞的聚集的结果的照片。显示出： 与阴性对照投予小鼠相比，HMGB1静脉投予小鼠中骨髓间充质细胞更多地 聚集在骨折部位。

具体实施方式

本发明提供一种药剂，其为含有以下（a）~（q）中任一项所述的物质 的组织再生促进剂，其被投予至与需要再生的组织不同的组织，

（a）HMGB1蛋白质

（b）分泌HMGB1蛋白质的细胞

（c）插入有编码HMGB1蛋白质的DNA的载体

（d）HMGB2蛋白质

（e）分泌HMGB2蛋白质的细胞

（f）插入有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体

（g）HMGB3蛋白质

（h）分泌HMGB3蛋白质的细胞

（i）插入有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体

（j）S100A8蛋白质

（k）分泌S100A8蛋白质的细胞

（l）插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体

（m）S100A9蛋白质

（n）分泌S100A9蛋白质的细胞

（o）插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体

（p）细胞或组织的提取液

（q）细胞或组织的提取液的肝素结合级分。

该组织再生促进剂的特征在于，通过被投予至与需要再生的组织不同 的组织，介由末梢循环将骨髓细胞从骨髓动员（也可表述为诱导或局部诱 导）至需要再生的组织。这里，“末梢循环”还被称作“血液循环”、“末梢血 液循环”。

本发明的组织再生促进剂优选抑制疤痕治愈并诱导非疤痕性治愈。疤 痕治愈是指功能性组织被纤维性胶原置换的状态。而非疤痕性治愈是指损 伤部位将由细胞成分形成的功能性组织再生的状态，在功能性、审美性方 面而言比疤痕治愈更为优异。本发明的组织再生促进剂中含有这种非疤痕 性组织再生促进剂。

因此，本发明的药剂是一种组织再生促进剂，其特征在于，其被投予 至与需要再生的组织不同的组织，将骨髓细胞从骨髄动员至末梢血中，介 由末梢循环体系将骨髓源性细胞动员至需要再生的组织，从而促进组织的 再生。

还可表述为：一种药剂，其是非疤痕性组织再生促进剂，其被投予至 与需要再生的组织不同的组织；

一种药剂，其是非疤痕性组织再生促进剂，其特征在于，其被投予至 与需要再生的组织不同的组织，将骨髓细胞从骨髄动员至末梢血中，介由 末梢循环体系将骨髓源性细胞动员至需要再生的组织，从而促进组织的再 生。

作为需要再生的组织，可例示出损伤了的组织、坏死了的组织、术后 组织、功能降低了的组织、纤维化了的组织、老化了的组织、患病的组织 等，例如可例示出生物体皮肤组织、体内活检（手术）组织（脑、肺、心 脏、肝脏、胃、小肠、大肠、胰脏、肾脏、膀胱、脾脏、子宫、睾丸、血 液等）。

本发明中，向与需要再生的组织不同的组织的投予是指投予至除需要 再生的部位以外的部位（与需要再生的部位不同的部位）。因此，“与需要 再生的组织不同的组织”还可表述为与需要再生的组织不同的部位、与需要 再生的部位不同的部位、远离需要再生的组织的部位、远离需要再生的部 位的部位、位于距离需要再生的部位远的部位、位于距离需要再生的组织 远的组织、远处部、远处组织。

特别是，本发明的药剂可被有效用于对难以从体外直接投予药剂的组 织（脑、心脏等）进行再生。

被动员至需要再生的组织的骨髓源性细胞分化成各种细胞，从而有助 于需要再生的组织的功能性再生和功能维持、功能强化。本发明中，作为 需要再生的组织，可举出由缺血/灌注不足/低氧状态所引起的各种病态、外 伤、烧伤、炎症、自身免疫、基因异常等导致了损伤的组织，但并非限定 于这些原因。

作为本发明中的组织，只要是骨髓源性细胞能够分化的组织，则无特 别限定，例如可例示出皮肤组织、骨组织、软骨组织、肌肉组织、脂肪组 织、心肌组织、神经系统组织、肺组织、消化道组织、肝/胆/胰腺组织、泌 尿/生殖器等生物体内的所有组织。另外，通过使用上述组织再生促进剂， 不仅在难治性皮肤溃疡、皮肤创伤、水疱症、脱毛症等皮肤疾病中可进行 诱导功能性组织再生的治疗，而且在脑梗塞、心肌梗塞、骨折、肺梗塞、 胃溃疡、肠炎等需要再生的组织中也可进行诱导功能性组织再生的治疗。 作为被投予上述组织再生促进剂的动物种，并无特别限定，可举出哺乳类、 鸟类、鱼类等。作为哺乳类，可举出人或非人动物，例如可例示出人、小 鼠、大鼠、猴子、猪、狗、兔子、仓鼠、豚鼠、马、羊、鲸等，但并非限 定于这些。

另外，作为与需要再生的组织不同的组织，可例示出血液组织、肌肉 组织、皮下组织、皮内组织、腹腔等。

因此，本发明的药剂中包含用于促进上述组织的再生的药剂。

本发明的药剂中优选包含神经组织、骨组织、皮肤组织等的再生促进 剂，但并非限定于这些。作为神经组织的再生促进剂，可举出中枢神经组 织的再生促进剂，但并非限定于此。另外，神经组织的再生促进剂例如可 在脑梗塞、脑出血、脑挫伤等的治疗中使用，但并非限定于这些。另外， 骨组织的再生促进剂例如可在骨折的治疗中使用，但并非限定于此。另外， 皮肤组织的再生促进剂例如可在皮肤溃疡、手术伤口的缝合不全、烧伤、 割伤、挫伤、皮肤糜烂、擦伤等的治疗中使用，但并非限定于这些。

本说明书中，“骨髄细胞”、“骨髓源性细胞”是造血系干细胞及来源于其 的白细胞、红细胞、血小板以外的细胞，是以目前被称作骨髓间充质干细 胞或骨髄间质多能干细胞或骨髓多能干细胞的细胞为代表的干细胞。另外， “骨髄细胞”包含含有存在于骨髄中的组织祖细胞团的细胞。“骨髄细胞”、“骨 髓源性细胞”可以通过骨髄采集（骨髄细胞采集）或末梢血采血进行分离。 造血系干细胞是非附着性细胞，但“骨髄细胞”、“骨髓源性细胞”的一部分通 过由骨髄采集（骨髄细胞采集）、末梢血采血所获得的血液中的单核细胞 分级细胞培养，可以作为附着性细胞获得。另外，“骨髄细胞”、“骨髓源性 细胞”含有间充质干细胞，优选具有分化成成骨细胞（诱导分化可通过可见 钙的沉积来鉴别）、软骨细胞（可通过阿辛蓝染色阳性、番红-O染色阳性 等来鉴别）、脂肪细胞（可通过苏丹III染色阳性来鉴别）的能力、更优选 具有分化成成纤维细胞、平滑肌细胞、基质细胞、肌腱细胞等间充质细胞 的能力、进一步优选具有分化成神经细胞、上皮细胞（例如表皮角质形成 细胞、肠道上皮细胞表达细胞角蛋白家族）、血管内皮细胞的能力。分化 后的细胞并非限定于上述细胞，还包含分化为肝脏、肾脏、胰脏等实质器 官细胞的能力。

本说明书中，“骨髄细胞”是指存在于骨髄内的细胞，而“骨髓源性细胞” 是指被动员至骨髄外的“骨髄细胞”。

在本发明中，“骨髓间充质干细胞”、“骨髓间质多能细胞”或“骨髓多能 干细胞”是指存在于骨髓内的细胞，其能够从骨髓直接采集或者从其他组织 （血液、皮肤、脂肪或其他组织）间接地采集并作为附着于培养皿（塑料 或者玻璃制）的细胞进行培养和增殖，其为带有具有分化为骨、软骨、脂 肪等间充质组织（间充质干细胞）、或者分化为骨骼肌、心肌、进而分化 为神经组织、上皮组织（多能干细胞）的能力这样的特征的细胞；其是可 以通过骨髓细胞采集来获得的细胞。另外，从骨髄动员的“骨髓间充质干细 胞”、“骨髄间质多能细胞”或“骨髓多能干细胞”是能够通过末梢血采血、以 及通过从脂肪等间充质组织、皮肤等上皮组织、脑等神经组织采集来获得 的细胞。另外，骨髓间充质干细胞、骨髄间质多能干细胞、骨髓多能干细 胞、或由骨髓动员的这些细胞还具有下述特征：通过在采集后直接投予至 生物体的损伤部、或将一度附着于培养皿的细胞投予至生物体的损伤部， 从而还具有分化为例如构成皮肤的角质形成细胞等上皮组织、构成脑的神 经系统的组织的能力。另外，作为骨髓间充质干细胞、骨髄间质多能干细 胞、骨髓多能干细胞或从骨髓动员的这些细胞，可例示出具有CD11b阴性 的性质的细胞，但并非限定于此。

骨髓间充质干细胞、骨髓间质多能干细胞、骨髓多能干细胞或从骨髓 动员的这些细胞除了具有分化为成骨细胞（诱导分化可通过可见钙的沉积 等来鉴别）、软骨细胞（可通过阿辛蓝染色阳性、番红-O染色阳性等来鉴 别）、脂肪细胞（可通过苏丹III染色阳性等来鉴别）的能力外，优选还具 有分化为例如成纤维细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、基质细胞、肌腱细 胞等间充质细胞、神经细胞、色素细胞、表皮细胞、毛囊细胞（表达细胞 角蛋白家族、毛发角蛋白家族等）、上皮细胞（例如表皮角质形成细胞、 肠道上皮细胞表达细胞角蛋白家族等）、内皮细胞，进一步优选具有分化 为肝脏、肾脏、胰脏等实质器官细胞的能力，但分化后的细胞并不限定于 上述细胞。

另外，作为人骨髓间充质干细胞、骨髄间质多能干细胞、骨髓多能干 细胞或从骨髄动员的这些细胞，可例示出可通过骨髄采集（骨髄细胞采集）、 末梢血采血、脂肪采集获得、直接或者将单核细胞级分分离后进行培养以 作为附着性细胞获得的细胞，但并非限定于此。作为人骨髓间充质干细胞、 骨髄间质多能干细胞、骨髓多能干细胞或从骨髄动员的这些细胞的标记物， 可例示出Lin阴性、CD45阴性、CD44阳性、CD90阳性、CD29阳性的全 部或一部分，但并非限定于这些。

另外，作为小鼠骨髓间充质干细胞、骨髄间质多能干细胞、骨髓多能 干细胞或从骨髄动员的这些细胞，可例示出例如可通过实施例所记载的方 法获得的细胞，但并非限定于这些。作为小鼠骨髓间充质干细胞、骨髄间 质多能干细胞、骨髓多能干细胞或从骨髄动员的这些细胞的标记物，可例 示出CD44阳性、PDGFRα阳性、PDGFRβ阳性、CD45阴性、Lin阴性、 Sca-1阳性、c-kit阴性、CD90阳性、CD29阳性的全部或一部分，但并非限 定于这些。

组织祖细胞被定义为具有单方向性地分化为除血液系统以外的特定组 织细胞的能力的未分化细胞，包括具有分化为上述的间充质组织、上皮组 织、神经组织、实质器官、血管内皮的能力的未分化细胞。

本发明的组织再生促进剂中，作为上述（a）~（q）所记载的物质中的 至少1种物质以外的物质，只要不抑制骨髓源性细胞的诱导或组织再生促 进则无特别限定。例如，本发明的组织再生促进剂中除了上述（a）~（q） 所记载的物质中的至少1种物质之外，还可含有强化上述（a）~（q）所记 载的物质的功能性组织再生诱导功能的相关分子（群）、抑制上述（a）~ （q）所记载的物质的所期待效果以外的作用的分子（群）、抑制骨髓源性 细胞的增殖和分化的因子、强化/维持这些因子或细胞的功能的其他因子。

作为成为本发明的组织再生促进剂中的HMGB1、HMGB2、HMGB3、 S100A8或S100A9蛋白质、上述提取液或上述肝素结合级分的来源的动物 种，可以举出人或非人动物，例如可例示出人、小鼠、大鼠、猴子、猪、 狗、兔子、仓鼠、豚鼠等，优选是与投予上述物质的动物种相同的动物种。

作为本发明中的HMGB1蛋白质，可例示出包含序列号：1、3或5中 记载的氨基酸序列的蛋白质，但并不限定于这些。本发明的HMGB1蛋白 质还包括与包含序列号：1、3或5中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上 等同的蛋白质。作为这样的蛋白质，可列举出例如1）由在序列号：1、3 或5中记载的氨基酸序列中置换、缺失、插入和/或添加1个或多个氨基酸 而得到的氨基酸序列构成、且与包含序列号：1、3或5中记载的氨基酸序 列的蛋白质在功能上等同的经分离的蛋白质、和2）为由与包含序列号：2、 4或6中记载的碱基序列的DNA在严格的条件下杂交的DNA编码的蛋白 质、且与包含序列号：1、3或5中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等 同的经分离的蛋白质。

作为本发明中的HMGB2蛋白质，可例示出包含序列号：7、9或11中 记载的氨基酸序列的蛋白质，但并不限定于这些。本发明的HMGB2蛋白 质还包括与包含序列号：7、9或11中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上 等同的蛋白质。作为这样的蛋白质，可举出例如1）由在序列号：7、9或 11中记载的氨基酸序列中置换、缺失、插入和/或添加1个或多个氨基酸而 得到的氨基酸序列构成、且与包含序列号：7、9或11中记载的氨基酸序列 的蛋白质在功能上等同的经分离的蛋白质；和2）为由与包含序列号：8、 10或12中记载的碱基序列的DNA在严格的条件下杂交的DNA编码的蛋 白质、且与包含序列号：7、9或11中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上 等同的经分离的蛋白质。

作为本发明中的HMGB3蛋白质，可例示出包含序列号：13或15中记 载的氨基酸序列的蛋白质，但并不限定于这些。本发明的HMGB3蛋白质 还包括与包含序列号：13或15中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同 的蛋白质。作为这样的蛋白质，可举出例如1）由在序列号：13或15中记 载的氨基酸序列中置换、缺失、插入和/或添加1个或多个氨基酸而得到的 氨基酸序列构成、且与包含序列号：13或15中记载的氨基酸序列的蛋白质 在功能上等同的经分离的蛋白质；和2）为由与包含序列号：14或16中记 载的碱基序列的DNA在严格的条件下杂交的DNA编码的蛋白质、且与包 含序列号：13或15中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的经分离的 蛋白质。

作为本发明中的S100A8蛋白质，可例示出包含序列号：17、19或21 中记载的氨基酸序列的蛋白质，但并不限定于这些。本发明的S100A8蛋白 质还包括与包含序列号：17、19或21中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能 上等同的蛋白质。作为这样的蛋白质，可举出例如1）由在序列号：17、19 或21中记载的氨基酸序列中置换、缺失、插入和/或添加1个或多个氨基酸 而得到的氨基酸序列构成、且与包含序列号：17、19或21中记载的氨基酸 序列的蛋白质在功能上等同的经分离的蛋白质；和2）为由与包含序列号： 18、20或22中记载的碱基序列的DNA在严格的条件下杂交的DNA编码 的蛋白质、且与包含序列号：18、20或22中记载的氨基酸序列的蛋白质在 功能上等同的经分离的蛋白质。

作为本发明中的S100A9蛋白质，可例示出包含序列号：23、25或27 中记载的氨基酸序列的蛋白质，但并不限定于这些。本发明的S100A9蛋白 质还包括与包含序列号：23、25或27中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能 上等同的蛋白质。作为这样的蛋白质，可举出例如1）由在序列号：23、25 或27中记载的氨基酸序列中置换、缺失、插入和/或添加1个或多个氨基酸 而得到的氨基酸序列构成、且与包含序列号：23、25或27中记载的氨基酸 序列的蛋白质在功能上等同的经分离的蛋白质；和2）为由与包含序列号： 24、26或28中记载的碱基序列的DNA在严格的条件下杂交的DNA编码 的蛋白质、且与包含序列号：23、25或27中记载的氨基酸序列的蛋白质在 功能上等同的经分离的蛋白质。

与包含序列号：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或 27中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的经分离的蛋白质可以是包 含序列号：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中记 载的氨基酸序列的蛋白质的同源物或者旁系同源物。关于与包含序列号：1、 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中记载的氨基酸序列 的蛋白质在功能上等同的蛋白质，本领域技术人员可以通过公知的方法（实 验医学别册·基因工学手册（実験医学別冊·遺伝子工学ハンドブツク）， pp246-251、羊土社、1991年发行）来分离。

作为与包含序列号：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、 25或27中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质，可举出具有 将骨髓源性细胞动员至需要再生的组织的活性的蛋白质或者具有迁移骨髓 源性细胞的活性的蛋白质。

作为由在序列号：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25 或27中记载的氨基酸序列中置换、缺失、插入和/或添加1个或多个氨基酸 而得到的氨基酸序列构成、且与包含序列号：1、3、5、7、9、11、13、15、 17、19、21、23、25或27中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋 白质，包括天然存在的蛋白质。一般来说，如在干扰素基因等中所已知的 那样，真核生物的基因具有多态性（polymorphism）。由于该多态性所产生 的碱基序列的变化，有时1个或多个氨基酸被置换、缺失、插入和/或添加。 属于这样自然存在的蛋白质且具有在序列号：1、3、5、7、9、11、13、15、 17、19、21、23、25或27中记载的氨基酸序列中置换、缺失、插入和/或 添加1个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列、并且与由序列号：1、3、5、 7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中记载的氨基酸序列构成的 蛋白质在功能上等同的蛋白质也包括在本发明的HMGB1、HMGB2、 HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质中。

另外，只要是与由序列号：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、 23、25或27中记载的氨基酸序列构成的蛋白质在功能上等同的蛋白质，则 人工制作的突变蛋白质也包括在本发明中。作为对给定的碱基序列施加随 机突变的方法，已知例如利用DNA的亚硝酸处理的碱基对置换（Hirose,S. et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,79:7258-7260,1982）。该方法中，通过对 欲导入突变的片段进行亚硝酸处理，能够在特定的片段中随机地导入碱基 对置换。或者，作为在任意位点导入目标突变的技术，有gapped duplex法 等（Kramer W.and Fritz HJ.,Methods in Enzymol.,154:350-367,1987）。将 克隆要导入突变的基因而得到的环状双链载体分成单链，使其与在目标部 位具有突变的合成寡核苷酸杂交。使被限制性内切酶切断而形成线状的载 体来源的互补单链DNA与上述环状单链载体退火，用DNA聚合酶填充该 载体与上述合成核苷酸之间的间隙，进而通过连接形成完整的双链环状载 体。

所改变的氨基酸的数目典型地为50个氨基酸以内、优选为30个氨基 酸以内、进一步优选为5个氨基酸以内（例如1个氨基酸）。

在人为地置换氨基酸的情况下，如果置换为性质相似的氨基酸，则容 易维持原蛋白质的活性。本发明的蛋白质包括下述蛋白质：其为在上述氨 基酸置换中加以保存性置换而得到的蛋白质，且是与包含序列号：1、3、5、 7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中记载的氨基酸序列的蛋白 质在功能上等同的蛋白质。在置换对于蛋白质活性来说重要的区域的氨基 酸等情况下，保存性置换是重要的。这样的氨基酸的保存性置换对于本领 域技术人员来说是熟知的。

作为相当于保存性置换的氨基酸的组，可举出例如碱性氨基酸（例如 赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、酸性氨基酸（例如天冬氨酸、谷氨酸）、不 带电荷的极性氨基酸（例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨 酸、酪氨酸、半胱氨酸）、非极性氨基酸（例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、 异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸）、β支链氨基酸（例如苏 氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）和芳香族氨基酸（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色 氨酸、组氨酸）等。

另外，通过非保存性置换也会使蛋白质的活性等进一步提高（例如包 括恒定的活化型蛋白质（constitutively activated proteins）等）。

此外，作为获得与包含序列号：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、 21、23、25或27中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质的方 法，可举出利用杂交的方法。即，将如序列号：2、4、6、8、10、12、14、 16、18、20、22、24、26或28所示的编码本发明的HMGB1、HMGB2、 HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的DNA、或者其片段作为探针，分离 出能够与其杂交的DNA。若在严格的条件下实施杂交，可选择同源性高的 DNA作为碱基序列，其结果是被分离出的蛋白质中含有与HMGB1、 HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质在功能上等同的蛋白质的可 能性增加。同源性高的碱基序列是指能够显示例如70%以上、优选90%以 上的相同性。

另外，严格的条件具体地可以示出例如在6×SSC、40%甲酰胺、25℃ 下进行杂交、且在1×SSC、55℃下进行洗涤的条件。严格性会受盐浓度、 甲酰胺的浓度或温度等条件的影响，但只要是本领域技术人员，就能够设 定这些条件以获得所需的严格性。

通过利用杂交，能够将编码例如除包含序列号：1、3、5、7、9、11、 13、15、17、19、21、23、25或27中记载的氨基酸序列的蛋白质以外的 HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的同源物的DNA 分离。

与包含序列号：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或 27中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质通常与序列号：1、 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中记载的氨基酸序列 具有高的同源性。高的同源性是指至少30%以上、优选50%以上、进一步 优选80%以上（例如95%以上）的序列的相同性。关于碱基序列或氨基酸 序列的相同性，可以利用使用了网络的同源性检索网站来进行[例如在日本 DNA数据库（DDBJ）中，可以利用FASTA、BLAST、PSI-BLAST和SSE  ARCH等同源性检索[例如日本DNA数据库（DDBJ）网站上的同源性检索 （Search and Analysis）的网页：http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/homology- j.html]。另外，在National Center for Biotechnology Information（NCBI） 中，可以进行使用了BLAST的检索（例如NCBI主页的网站的BLAST网 页：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/；Altschul,S.F.et al.,J.Mol.Bio l.,1990,215(3):403-10；Altschul,S.F.&Gish,W.,Meth.Enzymol.,1996, 266:460-480；Altschul,S.F.et al.,Nucleic Acids Res.,1997,25:3389-340 2）]。

例如对于Advanced BLAST 2.1中的氨基酸序列的相同性的计算，通过 程序使用blastp、将Expect值设定为10、将Filter全部设定为OFF、Matrix 使用BLOSUM62、并将Gap existence cost、Per residue gap cost和Lambda  ratio分别设定为11、1、0.85（缺省值）来进行检索，可以获得相同性（identity， 同一性）的值（%）（Karlin,S.and S.F.Altschul（1990）Proc.Natl.Acad. Sci.USA 87：2264-68；Karlin,S.and S.F.Altschul（1993）Proc.Natl.Acad. Sci.USA 90：5873-7）。

与包含序列号：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或 27中记载的氨基酸序列的蛋白质在功能上等同的蛋白质还可以是序列号： 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中记载的氨基酸 序列的片段。

本发明的蛋白质或在功能上与其等同的蛋白质可以是施加了糖链等生 理性修饰、荧光或放射性物质等标记或者与其他蛋白质的融合等各种修饰 而得到的蛋白质。特别是在后文所述的基因重组体中，糖链的修饰有可能 根据使其表达的宿主的不同而产生差异。但是，即使糖链的修饰存在差异， 只要是显示与本说明书中公开的HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或 S100A9蛋白质相同性状的蛋白质，则均属于本发明的HMGB1、HMGB2、 HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质、或在功能上等同的蛋白质。

HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质不仅可以从生 物体材料获得，而且可以通过将对其进行编码的基因整合入适当的表达体 系而作为基因重组体来获得。为了通过基因工程技术获得HMGB1、 HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质，将上文所述的编码HMGB1、 HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的DNA整合入适当的表达 体系并使之表达即可。作为本发明中可应用的宿主/载体体系，例如可示出 表达载体pGEX和大肠杆菌。由于pGEX可以使外源基因作为与谷胱甘肽 S-转移酶（GST）的融合蛋白质来表达（Gene,67：31-40,1988），因此通 过热激将整合了编码HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋 白质的基因的pGEX导入BL21等大肠杆菌株中，在适当的培养时间后，添 加异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）以诱导GST融合HMGB1、GST融合 HMGB2、GST融合HMGB3、GST融合S100A8或GST融合S100A9蛋白 质的表达。本发明的GST由于吸附于谷胱甘肽琼脂糖4B，因此表达产物能 够容易地通过亲和柱层析法分离和纯化。

作为用于获得HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白 质的重组体的宿主/载体体系，还可以采用下述的体系。首先，当利用细菌 作为宿主时，市售有利用了组氨酸标签、HA标签、FLAG标签等的融合蛋 白质的表达用载体。另外，本发明的基因重组体还包括附加有标签或其一 部分肽的状态的基因重组体。

关于酵母，已公知Pichia属酵母对于具备糖链的蛋白质的表达是有效 的。从糖链的添加的角度出发，利用了以昆虫细胞为宿主的杆状病毒载体 的表达体系也是有用的（Bio/Technology,6：47-55,1988）。此外，还可利 用哺乳动物的细胞进行利用了CMV、RSV或SV40等启动子的载体的转染， 这些宿主/载体体系均能够用作HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或 S100A9蛋白质的表达体系。另外，还可以利用逆转录病毒载体、腺病毒载 体、腺相关病毒载体等病毒载体来导入基因。

所得到的本发明的蛋白质可以从宿主细胞内或细胞外（培养基等）分 离，并纯化成实质上纯且均一的蛋白质。蛋白质的分离、纯化使用在通常 的蛋白质纯化中使用的分离、纯化方法即可，没有任何限定。例如，可以 适当选择和组合色谱柱、过滤器、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸 馏、免疫沉降、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳法、透析、重结 晶等以对蛋白质进行分离、纯化。

作为色谱法，可举出例如亲和层析法、离子交换色谱法、疏水性色谱 法、凝胶过滤法、反相色谱法、吸附层析法等（Marshak et al.,Strategies for  Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual.Ed  Daniel R.Cold Spring Harbor Laboratory Press,1996）。这些色谱法可以使用 液相色谱法例如HPLC、FPLC等液相色谱法来进行。

另外，本发明的蛋白质优选是实质上经纯化的蛋白质。这里，“实质上 经纯化”是指本发明的蛋白质的纯化度（本发明的蛋白质在蛋白质成分总体 中的比例）为50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95% 以上、100%或者接近100%。接近100%的上限依赖于本领域技术人员的纯 化技术和分析技术，例如为99.999%、99.99%、99.9%、99%等。

另外，只要是具有上述纯化度的蛋白质，则可以是通过任何纯化方法 进行了纯化的蛋白质，都包括在实质上经纯化的蛋白质内。例如，可例示 出通过适当选择或组合上述色谱柱、过滤器、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶 剂提取、蒸馏、免疫沉降、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、透 析、重结晶等方法而实质上经纯化得到的蛋白质，但并不限定于这些。

作为释放或分泌本发明的HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或 S100A9蛋白质的细胞，基本上生物体内所有组织来源的细胞均可以。作为 容易采集和培养的细胞，可例示出成纤维细胞（例如正常皮肤成纤维细胞 和来源于其的细胞株），但并不限定于此。另外，分泌HMGB1、HMGB2、 HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的细胞也可以通过将下述载体导入成纤 维细胞（例如正常皮肤成纤维细胞和来源于其的细胞株）等哺乳类细胞、 昆虫细胞或其他细胞中来制作，所述载体是通过将编码HMGB1、HMGB2、 HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的DNA、或者通过使编码分泌信号的 DNA（ATG CAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG CTG CTG  TGG GTT CCA GGT TCC ACT GGT GAC；序列号：29）结合到编码 HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的DNA上而得到 的DNA插入公知的表达载体或基因治疗用载体而制作的。作为编码分泌信 号的DNA，可例示出具有上述序列的DNA，但并不限定于此。另外，这些 细胞所来源的动物种没有特别限制，优选使用要投予载体的对象动物种的 细胞、对象自身的细胞、或者与要投予载体的对象具有血缘关系的动物来 源的细胞。

编码本发明的HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白 质的DNA只要编码HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白 质，则可以是cDNA、也可以是基因组DNA，另外，还可以是天然的DNA 或是人工合成的DNA。编码HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9 蛋白质的DNA通常以插入到载体中的状态被投予。

作为本发明中的载体，可例示出质粒载体、逆转录病毒载体、慢病毒 载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、仙台病毒载体、仙台病毒包膜载体、 乳头状瘤病毒载体等，但并不限定于这些。该载体中还可以包括有效地诱 导基因表达的启动子DNA序列、控制基因表达的因子、用于维持DNA稳 定性所需的分子。

另外，本发明中还可以利用属于HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8 或S100A9蛋白质的部分肽且具有动员骨髓来源细胞的活性的肽、分泌该部 分肽的细胞或插入有编码该部分肽的DNA的载体。

本发明中的细胞或组织的提取液可通过包含将细胞或组织浸渍到溶剂 中的工序的方法来制造。

作为浸渍到溶剂中的细胞或组织，并无特殊限定，可例示出组织来源 的细胞、由组织来源的细胞建立的细胞株（例如可例示出HeLa、HEK293， 但并非限定于这些）、经分离的细胞、未经分离的细胞（例如分离出的组 织中存在的细胞）、导入有编码HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或 S100A9蛋白质的DNA的细胞等。作为上述组织，可以是任意组织，例如 可例示出活体皮肤组织、体内活检（手术）组织（脑、肺、心脏、肝脏、 胃、小肠、大肠、胰脏、肾脏、膀胱、脾脏、子宫、睾丸或血液等），但 并不限定于这些。

作为上述溶剂，可例示出生理盐水、PBS（磷酸盐缓冲液）、TBS（Tris （三羟甲基氨基甲烷）缓冲盐），但并非限定于这些。另外，作为将细胞 或组织浸渍到溶剂中的时间，为用于诱导细胞坏死所需的足够的时间，即1 小时～48小时（例如6小时～48小时），优选为12小时～24小时，但并 不限定于该时间。因此，“将细胞浸渍到溶剂中的工序”也可以换言之为“将 细胞在溶剂中浸渍用于诱导坏死所需的足够的时间的工序”或“使细胞坏死 的工序”。另外，作为将细胞或组织浸渍到溶剂中的温度，可例示出4℃～ 25℃（例如4℃～8℃）、优选例示出4℃，但并非限定于此。另外，作为 将细胞或组织浸渍到溶剂中的pH，可例示出pH为7～8、优选例示出pH 为7.5，但并非限定于此。另外，作为缓冲液的成分，可举出10mM~50mM、 优选10~20mM浓度的磷酸缓冲液，但并非限定于此。

另外，本发明中，在将细胞或组织浸渍到溶剂中后，还可以从含有细 胞或组织的溶剂中除去该细胞或该组织。从溶剂中除去细胞或组织的方法 可以是本领域技术人员公知的方法，并无特殊限定。例如可以通过在 4℃~25℃（例如4℃）、且重力加速度为10G~100000G（例如440G）下进 行离心并分取出上清，从而从溶剂中除去细胞或组织，但并非限定于此。 可以将该上清用作细胞或组织的提取液。

作为本发明中的细胞或组织的提取液，例如可举出皮肤提取液或末梢 血单核细胞提取液（末梢血提取液），但并非限定于这些。

末梢血提取液的制备方法为：在使用注射器等采血后，用冰箱、液氮 或干冰等将细胞冷冻，然后在0℃以上的温度下使其再融解。此外，为了除 去细胞的不溶成分，例如可以通过在4℃~25℃（例如4℃）、且重力加速 度为10G~100000G（例如440G）下进行离心并分取出上清，从而从溶剂中 除去细胞的不溶成分，但并非限定于此。可以将该上清液用作细胞或组织 的提取液。为了除去细胞的不溶成分，可以代替离心操作，使其通过具有 0.45μm的微孔的硝化纤维素滤器等来将不溶成分除去。另外，可以通过将 采集的末梢血在4℃的状态下放置3小时～48小时来诱发细胞坏死，以使 从末梢血中的细胞释放细胞内成分。可以通过在这之后在重力加速度为 10G~100000G（例如440G）下进行离心并分取出上清，从而从溶剂中将细 胞的不溶成分除去，但并非限定于此。可以将该上清用作细胞或组织的提 取液。为了除去细胞的不溶成分，可以代替离心操作，使其通过具有0.45μm 的微孔的硝化纤维素滤器等来将不溶成分除去。

另外，由末梢血单核细胞制备细胞提取液的方法为：在使用注射器等 采集末梢血全血后，利用PBS将总量稀释至4mL，在离心管中插入 Ficoll-Paque Plus（GE）液3mL后，在其上叠置稀释血液。在400G（18℃） 下离心40分钟，将含有单核细胞的中间层回收至新的离心管，添加45mL 的PBS，在800Ｇ（18℃）下离心5分钟，将上清除去。进而再次添加45mL 的PBS，在800Ｇ（18℃）下离心5分钟，将上清除去。在沉淀的细胞中添 加200μL的PBS进行悬浮。细胞悬浮液在-80℃的冰箱内冷冻30分钟，从 冰箱中拿出在冰上融解。重复该冷冻融解操作3次。进而，在800Ｇ（4℃） 下离心15分钟，将上清回收。可以代替对细胞进行冷冻，通过在4℃的冰 箱中放置3小时~48小时来诱发细胞坏死、使细胞内成分分泌。另外，还可 一边在冰上进行冷却一边进行超声波处理，从而将细胞破坏，使细胞内成 分释放到细胞外。任一情况下都进行如下操作：在将细胞内成分释放到细 胞外后，在重力加速度为440G~1000000G、优选100000G~20000G下进行 离心操作，将其上清回收而制成细胞提取液。另外，还可代替离心操作， 通过使其通过具有0.45μm微孔的硝化纤维素滤器或醋酸纤维素滤器等，从 而将不溶成分除去，制成细胞提取液。

本发明中的细胞或组织的提取液的肝素结合级分可以通过包含以下工 序的方法来制造。

（a）将细胞或组织浸渍到溶剂中的工序、

（b）使工序（a）中得到的提取液与固定化肝素接触的工序、和

（c）从固定化肝素中洗脱肝素结合级分（也可表述为肝素纯化级分、 肝素柱纯化级分）的工序

固定化肝素是使肝素共价键合到不溶性载体上而得到的。作为上述不 溶性载体，可举出Sepharose珠粒（Sepharose 4B、Sepharose 6B等：GE Healthcare），但并非限定于此。本发明中还可以使用市售的固定化肝素 （Hitrap肝素HP柱：GE Healthcare）。

作为细胞或组织的提取液与固定化肝素的接触条件，可例示出pH为 7~8左右（优选pH为7.5）、盐浓度为0~200mM、优选为100~200mM左 右，但并非限定于这些。提取液与固定化肝素接触的时间没有特殊限定， 但从使肝素结合级分充分地吸附于固定化肝素的观点出发，优选保持5分 钟以上。另外，作为温度，可举出4~8℃、优选举出4℃，但并非限定于这 些。此外，作为吸附于固定化肝素的肝素结合级分的洗脱条件，可例示出 pH为7~8左右、盐浓度为200~1000mM（优选为1000mM左右），但并非 限定于这些。

本发明的组织再生促进剂的投予方法可举出非经口投予，作为这样的 投予方法，具体地可举出注射投予等，但并非限定于该方法。另外，作为 本发明的组织再生促进剂的投予方法，只要是组织再生促进剂不会滞留在 投予部位、而是进入血液循环的投予方法，则无特别限定。作为本发明的 组织再生促进剂的投予方法，例如可例示出血管内投予（动脉内投予、静 脉内投予等）、血液内投予、肌肉内投予、皮下投予、皮内投予、腹腔内 投予，但并非限定于这些。

另外，还可根据患者的年龄、症状选择适当的投予方法。投予HMGB1、 HMGB2、HMGB3、S100A8、或S100A9蛋白质时，例如在每次投予中， 每1kg体重可以在0.0000001mg~1000mg的范围内选择投予量。或者，例如 每位患者可以在0.00001~100000mg/body的范围内选择投予量。在投予分泌 HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的细胞或插入有编 码HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8、或S100A9蛋白质的DNA的基 因治疗用载体时，也可按照在需要再生的组织中HMGB1、HMGB2、 HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的量达到上述范围内的方式进行投予。 但是，本发明的组织再生促进剂并非限定于这些投予量。

本发明的组织再生促进剂可根据常规方法制成制剂（例如Remington's  Pharmaceutical Science,latest edition,Mark Publishing Company,Easton, U.S.A），还可同时含有医药学上可允许的载体或添加物。可举出例如表面 活性剂、赋形剂、着色剂、香料、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等 渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等，但并非限定 于这些，还可以适当使用其他常用的载体。具体而言，可举出轻质硅酸酐、 乳糖、结晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、 羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯乙缩醛二乙氨基乙酸酯、聚乙 烯吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸甘油三酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、白糖、 羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等。

本发明还提供一种试剂盒，其为含有包含以下（a）~（q）中任一项所 述的物质的组合物的组织再生促进试剂盒，该组合物被投予至与需要再生 的组织不同的组织。

（a）HMGB1蛋白质

（b）分泌HMGB1蛋白质的细胞

（c）插入有编码HMGB1蛋白质的DNA的载体

（d）HMGB2蛋白质

（e）分泌HMGB2蛋白质的细胞

（f）插入有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体

（g）HMGB3蛋白质

（h）分泌HMGB3蛋白质的细胞

（i）插入有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体

（j）S100A8蛋白质

（k）分泌S100A8蛋白质的细胞

（l）插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体

（m）S100A9蛋白质

（n）分泌S100A9蛋白质的细胞

（o）插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体

（p）细胞或组织的提取液

（q）细胞或组织的提取液的肝素结合级分。

该组织再生促进用试剂盒的特征在于，通过被投予至与需要再生的组 织不同的组织，介由末梢循环将骨髄细胞从骨髄动员至需要再生的组织中。

另外，本发明的试剂盒中包括用于对上述需要再生的组织进行治疗的 试剂盒。优选本发明的试剂盒中包括被非经口投予的试剂盒、更优选包括 被注射投予的试剂盒。另外，本发明的试剂盒中优选包括被投予至血管内、 肌肉内、皮下、皮内或腹腔内的试剂盒。

另外，优选本发明的试剂盒中包括用于神经组织、骨组织或皮肤组织 的再生促进的试剂盒。

作为组织再生促进用试剂盒，可例示出含有（1）溶解于纤维蛋白原的 上述物质和（2）凝血酶的组织再生促进用试剂盒；或者含有（1）上述物 质、（2）纤维蛋白原和（3）凝血酶的组织再生促进用试剂盒。本发明中， 可以使用市售的纤维蛋白原和凝血酶。例如可举出纤维蛋白原HT-Wf （Benesis-Mitsubishi Pharma）、Beriplast（ZLB Behring）、Tissel（Baxter）、 Bolheal（化血研）、TachoComb（ZLB Behring），但并非限定于这些。

另外，上述细胞或组织的提取液、细胞或组织的提取液的肝素结合级 分、HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质、分泌HMGB1、 HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的细胞、插入有编码HMGB1、 HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的DNA的载体、HMGB1、 HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白质的部分肽、分泌该部分肽的 细胞、插入有编码该部分肽的DNA的载体的用途还可以表现为以下（1）～ （3）。

（1）一种促进组织再生的方法，其包含将有效量的含有以下（a）~（q） 中任一项所述的物质的组合物投予至与需要再生的组织不同的组织的工 序；

（a）HMGB1蛋白质

（b）分泌HMGB1蛋白质的细胞

（c）插入有编码HMGB1蛋白质的DNA的载体

（d）HMGB2蛋白质

（e）分泌HMGB2蛋白质的细胞

（f）插入有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体

（g）HMGB3蛋白质

（h）分泌HMGB3蛋白质的细胞

（i）插入有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体

（j）S100A8蛋白质

（k）分泌S100A8蛋白质的细胞

（l）插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体

（m）S100A9蛋白质

（n）分泌S100A9蛋白质的细胞

（o）插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体

（p）细胞或组织的提取液

（q）细胞或组织的提取液的肝素结合级分。

（2）含有以下（a）~（q）中任一项所述的物质的组合物在组织再生 促进剂的制造中的用途，该组织再生促进剂被投予至与需要再生的组织不 同的组织；

（a）HMGB1蛋白质

（b）分泌HMGB1蛋白质的细胞

（c）插入有编码HMGB1蛋白质的DNA的载体

（d）HMGB2蛋白质

（e）分泌HMGB2蛋白质的细胞

（f）插入有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体

（g）HMGB3蛋白质

（h）分泌HMGB3蛋白质的细胞

（i）插入有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体

（j）S100A8蛋白质

（k）分泌S100A8蛋白质的细胞

（l）插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体

（m）S100A9蛋白质

（n）分泌S100A9蛋白质的细胞

（o）插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体

（p）细胞或组织的提取液

（q）细胞或组织的提取液的肝素结合级分。

（3）一种组合物，其为用于在促进组织再生的方法中使用的、含有以 下（a）~（q）中任一项所述的物质的组合物，其被投予至与需要再生的组 织不同的组织；

（a）HMGB1蛋白质

（b）分泌HMGB1蛋白质的细胞

（c）插入有编码HMGB1蛋白质的DNA的载体

（d）HMGB2蛋白质

（e）分泌HMGB2蛋白质的细胞

（f）插入有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体

（g）HMGB3蛋白质

（h）分泌HMGB3蛋白质的细胞

（i）插入有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体

（j）S100A8蛋白质

（k）分泌S100A8蛋白质的细胞

（l）插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体

（m）S100A9蛋白质

（n）分泌S100A9蛋白质的细胞

（o）插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体

（p）细胞或组织的提取液

（q）细胞或组织的提取液的肝素结合级分。

需要说明的是，本说明书中被引用的全部现有技术文献都作为参照编 入本说明书中。

实施例1

HMGB-1的纯化和S100A8的纯化

使用Trizol（invitrogen）从新生小鼠皮肤提取RNA，然后使用SuperScript  III cDNA合成试剂盒（Invitrogen）合成cDNA。以该cDNA为模板，使用 PCR（聚合酶链反应）法对HMGB1的cDNA进行扩增，为了纯化，将其 插入在哺乳类细胞中表达蛋白质的质粒载体pCAGGS中，以使得表达在氨 基酸序列的N末端添加了GST标签和6XHis标签的序列的蛋白质。

使用聚乙烯亚胺（PEI）将pCAGGS-GST-His-HMGB1转染到人胎儿肾 细胞来源的HEK293培养细胞株，48小时后回收细胞和培养上清。将细胞 和培养上清在4℃下以4400g离心5分钟，分离上清和细胞并分别回收。使 回收的上清进一步通过具有直径为0.8μm孔的醋酸纤维素滤器，然后使其 通过具有0.45μm的孔的硝化纤维素滤器，由此制备除去了不溶级分的样品。 将该样品加入用含50mM NaCl的50mM Tris HCl(pH8.0)（50mL）平衡后的 5mL HisTrap FF（GE）中，将吸附成分进一步用含有10mM咪唑的50mM NaCl 50mM Tris HCl(pH8.0)洗涤，以除去非特异性吸附成分。将特异性吸 附成分用含有100mM咪唑的50mM NaCl 50mM Tris HCl(pH8.0)从柱中洗 脱。将吸附级分分别每管500μL地分级到经硅涂覆的塑料管中，合并含有 蛋白质的馏分后，使用脱盐柱PD10（GE）除去咪唑，使用50mM Tris HCl(pH.7.5)、150mM NaCl进行洗脱。向洗脱的样品中添加HRV3C （Novagen），在4℃下使其反应8小时。切断后使样品结合于用50mM Tris  HCl(pH.7.5)、150mM NaCl平衡后的HiTrap肝素1mL柱（GE）上，用50mM Tris HCl(pH.7.5)、150mM NaCl对柱内部进行洗涤，然后用50mM Tris  HCl(pH.7.5)、1000mM NaCl对结合蛋白质进行洗脱。使用50mM Tris  HCl(pH.8.8)20mM NaCl将洗脱的样品稀释50倍，使其吸附于用同一缓冲 液平衡后的1mL HiTrap Q FF（GE）。使用50mM Tris HCl(pH.8.8)500mM  NaCl，使NaCl的浓度缓慢上升，由此洗脱出吸附蛋白质。将结合在镍柱、 肝素柱、Q柱上的蛋白质进行SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色，确认了蛋白 质的存在。

其结果如图1所示，纯化得到高纯度的HMGB-1。以下的实施例中使 用利用本纯化方法获得的HMGB-1。

使用Trizol（invitrogen）从新生小鼠皮肤提取RNA，然后使用SuperScript  III cDNA合成试剂盒（Invitrogen）合成cDNA。以该cDNA为模板，使用 PCR（聚合酶链反应）法对S100A8的cDNA进行扩增，将其插入在哺乳类 细胞中表达蛋白质的质粒载体pCAGGS中（图39），以使得表达在氨基酸 序列的N末端添加了GST标签的序列（序列号：31（氨基酸序列）、序列 号32（DNA序列））的蛋白质。

使用脂转染试剂（Invitrogen）将pCAGGS-GST-S100A8转染到人胎儿 肾细胞来源的HEK293培养细胞株，48小时后回收细胞和培养上清。将细 胞和培养上清在4℃下以4400g离心5分钟，分离上清（上清A）和细胞并 分别回收。细胞通过添加含0.1%Tween20的PBS并在冰冷下超声波30秒 钟而将细胞膜破坏。进而在4℃下以4400g离心5分钟，将上清回收（上清 B）。将上清A与上清B混合，添加至预先用30mL的PBS将缓冲液置换 的HiTrap GST FF柱（GE healthcare，5mL）中。添加后，用PBS 100mL 对柱进行洗涤，用含有还原型谷胱甘肽的20mM磷酸缓冲液（pH.8）将吸 附的蛋白质洗脱。为了除去谷胱甘肽，使用凝胶过滤柱PD-10（GE公司制） 将缓冲液置换成PBS。

实施例2

皮肤溃疡部位治愈过程中通过HMGB-1和S100A8的静脉内投予所带来的骨髓源性细胞向皮肤溃疡部的动员效果

对C57BL/6雄性小鼠（6周龄）照射致死量放射线（10Gy），之后立 即从尾静脉移植GFP（绿色荧光蛋白）转基因小鼠（Okabe M.et al,FEBS  Lett.407,313-319,1997）来源的骨髄细胞（5×10⁶个/0.1ml生理性磷酸缓冲 溶液，pH为7.4）。8周后，在背部制作直径为6mm的圆形皮肤溃疡。为 了防止小鼠的皮肤收缩，使用双面胶和医疗用粘接剂Aron alpha A（三共） 将硅制的外径为10mm、内径为6mm、厚为1mm的圆盘粘接在溃疡部上。 为了防止溃疡部分的干燥和细菌感染，用直径为10mm、厚为1mm的硅制 圆盘将溃疡部覆盖。为了保护溃疡部，用Tegaderm（3M）覆盖。

从皮肤溃疡制作当天开始，以24小时的间隔从尾静脉投予HMGB-1 （40μg）或S100A8（250ng）5次。在制作溃疡开始的2周后，使用异氟醚 对小鼠吸入麻醉后，使用荧光实体显微镜观察在背部制作的皮肤溃疡制作 部分的GFP荧光的聚集程度。进而，将皮肤溃疡制作部分的皮肤以圆形切 除，用含4%多聚甲醛的PBS（磷酸缓冲液，nacalai）固定，包埋在OCT 复合物中后，使用带冷却装置的切片机（Leica）制作8μm的薄切片。将切 片粘贴在载玻片上后，使用PBS对复合物进行洗涤，用DAPI将细胞核染 色。进而，使用PBS将多余的DAPI洗涤，用含有防荧光消退剂的封固材 料进行封固。使用荧光显微镜对各个样品检测GFP的荧光。

将结果示于图2。与对照进行比较确认了：在HMGB-1/S100A8投予小 鼠中，骨髓源性细胞（GFP阳性细胞）大量集中在皮肤溃疡闭合后的真皮、 特别是上层处。

骨髓多能干细胞可分化成成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等，但认为 在皮肤组织中可分化成表皮细胞、毛囊系细胞、真皮成纤维细胞等。虽然 已经明确了HMGB-1和S100A8具有动员骨髓多能干细胞的活性、和在将 HMGB-1和S100A8直接投予至皮肤溃疡部位的小鼠中可见皮肤溃疡缩小 的效果，但通过本次结果首次表明了：通过将HMGB-1或S100A8投予至 距离皮肤溃疡部远且不同位置的的静脉血内，会将骨髓源性细胞动员至皮 肤溃疡部位。

实施例3

利用HMGB-1和S100A8的静脉内投予来促进皮肤溃疡治愈的效果

在C57BL/6雄性小鼠（8周龄）的背部上制作直径为6mm的圆形皮肤 溃疡。为了防止小鼠的皮肤发生收缩，使用双面胶和医疗用粘接剂Aron  alpha A（三共）将硅制的外径为10mm、内径为6mm、厚为1mm的圆盘粘 接在溃疡部上。为了防止溃疡部分的干燥和细菌感染，用直径为10mm、厚 为1mm的硅制圆盘将溃疡部覆盖。为了保护溃疡部，用Tegaderm（3M） 覆盖。

从皮肤溃疡制作当天开始，以24小时的间隔从尾静脉投予HMGB-1 （40μg）或S100A8（250ng）共计5次。测量溃疡作成后第3天、第5天、 第10天的溃疡部分的面积。

将结果示于图3。对于HMGB-1，与阴性对照（PPS投予）相比，从溃 疡作成后第3天开始可见溃疡面积的缩小。另外，对于S100A8，与阴性对 照（PPS投予）相比，从溃疡作成后第7天开始可见溃疡面积的缩小。

目前，通过将HMGB-1和S100A8直接投予至皮肤溃疡部，获得了皮 肤溃疡的治愈促进效果，但通过本研究首次成功地通过投予至距离溃疡部 位远且不同位置的血管内而促进了皮肤溃疡的治愈。通过本发明，由于可 以在不直接投予至溃疡部分的情况下进行皮肤溃疡的治愈，因而可以开发 出在大面积皮肤溃疡、伴有皮肤缺损或感染灶或坏死灶的溃疡等难以直接 投予溃疡部分的状态中也可使用的药品。

实施例4

利用HMGB-1静脉内投予来促进皮肤溃疡的非疤痕性治愈的效果

在C57BL/6雄性小鼠（8周龄）的背部上制作直径为6mm的圆形皮肤 溃疡。为了防止小鼠的皮肤发生收缩，使用双面胶和医疗用粘接剂Aron alpha A（三共）将硅制的外径为10mm、内径为6mm、厚为1mm的圆盘粘 接在溃疡部上。为了防止溃疡部分的干燥和细菌感染，用直径为10mm、厚 为1mm的硅制圆盘将溃疡部覆盖。为了保护溃疡部，用Tegaderm（3M） 覆盖。

从皮肤溃疡制作当天开始，以24小时的间隔从尾静脉投予HMGB-1 （40μg）共计5次。采集溃疡制作4周后的溃疡部分，用10%甲醛缓冲液 固定。将样品进行石蜡包埋后，使用切片机制作薄切片。去石蜡后，进行 HE（苏木精伊红）染色和MT（Masson三色）染色。

将结果示于图4。投予了HMGB-1的小鼠皮肤与对照小鼠（PBS投予） 相比，在真皮上层明显可见Masson三色染色阳性部分。

在皮肤溃疡的治愈过程中，已知当皮肤组织的再构成未充分进行时， 通过疤痕治愈来进行溃疡的闭合。疤痕治愈是利用由成纤维细胞等分泌的 胶原纤维等非细胞成分所进行的溃疡部分的闭合，由于与正常组织不同、 没有功能性组织构建，因而在治愈后仍伴有组织的硬化、结疤等，从功能 方面、美容方面出发，抑制疤痕是重要的课题。由本次的结果可知：通过 静脉内投予HMGB-1，可以将骨髓源性细胞动员至溃疡部分，促进皮肤溃 疡的早期闭合和非疤痕性治愈。

实施例5

静脉内投予了HMGB-1的脑梗塞模型动物脑中的骨髓源性细胞的确认

在GFP骨髄移植小鼠中制作脑梗塞（大脑中动脉线栓模型）。具体地 说，使用异氟醚对通过上述实施例的方法制作的GFP骨髄移植小鼠进行吸 入麻醉后，将头部皮肤切开，将激光多普勒血流仪探头直接粘接在头盖骨 上确认脑血流。进而，将胸骨至下颚的正中皮肤切开，将右颈总动脉剥离， 使用4号丝线慢慢结扎。在右颈外动脉的远处部用6号丝线结扎。一边对 颈总动脉的线施加张力，一边在右颈外动脉近位部处开孔，插入前端加热 成形了700μm的6号单丝尼龙线（栓塞线）。向内颈动脉推进栓塞线，在 插入至距离栓塞线前端约8mm的部位处将颈总动脉线松开。利用激光多普 勒血流仪确认了在阻断血流前后、血流仪的数值变为1/10。

阻断血流30分钟后将栓塞线拔去，使血流恢复。12小时后，将纯化 HMGB-1（100μg）用500μL的PBS稀释，从所制作的疾病模型小鼠的尾静 脉投予。之后每隔24小时同样地投予HMGB-1，进行4次。对照小鼠投予 PBS。

从治疗最终日开始的2周后，在异氟醚的吸入麻醉下，使用2%多聚甲 醛进行灌流固定。将脑从头盖骨中取出，在10%蔗糖液中浸透12小时、20% 蔗糖液中浸透24小时，从脑组织进行脱水。脱水后投入至OTC复合物内， 在干冰上使其冻结，制作团块。团块使用冷冻切片用的切片机制作厚度为 8μm的切片，并在硅烷涂覆的载玻片上伸展。伸展后使其充分地干燥，使 用PBS洗涤复合物。

使含2%脱脂乳的PBS浸透至样品中后，用含2%脱脂乳的PBS将抗小 鼠巢蛋白抗体和βIII微管蛋白抗体稀释至500倍，在4℃浸透样品8小时。 使用PBS每5分钟地充分洗涤5次后，在室温下使用含2%脱脂乳的PBS 稀释至500倍的PE标记抗大鼠IgG抗体浸透至样品。同样，使用PBS充 分地洗涤后，在室温下使DAPI溶液浸透10分钟，用PBS充分地洗涤。用 含防荧光消退剂的封固剂进行封固后，使用共聚焦激光显微镜观察GFP、 DAPI、PE的荧光。

将结果示于图5。在HMGB-1投予小鼠的脑中，可见大量骨髓源性细 胞（GFP阳性细胞），部分可见骨髓源性细胞且巢蛋白阳性细胞（右图黄 色的细胞）或骨髓源性细胞且βIII微管蛋白阳性细胞（左图黄色的细胞）。 在PBS投予组中，虽然可见骨髓源性细胞，但未见同时表达巢蛋白或βIII- 微管蛋白的细胞（照片未示）。

已知骨髓源性细胞在体外（培养体系）分化成神经细胞。另外，已知 在体内（生物体内）骨髓源性细胞在脑内很少表达神经标记物，还不清楚 是否保有作为脑神经的功能。而虽然通过对脑梗塞的病症投予骨髓间充质 干细胞等非炎症系骨髄细胞确认了具有治疗效果，但治愈机制还不清楚。

由本结果可知：在脑梗塞制作后静脉投予了HMGB-1的小鼠中，在脑 内可见表达神经细胞标记物的骨髓源性细胞。可以预想到这些GFP阳性细 胞是来自于骨髓间充质干细胞等非炎症系细胞。

实施例6

通过HMGB-1投予所带来的脑梗塞灶的缩小效果

使用异氟醚对8周龄C57/Bl6雌性小鼠进行吸入麻醉后，将头部皮肤切 开，将激光多普勒血流仪探头直接粘接在头盖骨上确认脑血流。进而，将 胸骨至下颚的正中皮肤切开，将右颈总动脉剥离，使用4号丝线慢慢结扎。 在右颈外动脉的远处部用6号丝线结扎。一边对颈总动脉的线施加张力， 一边在右颈外动脉近位部处开孔，插入前端加热成形了700μm的6号单丝 尼龙线（栓塞线）。向内颈动脉推进栓塞线，在插入至距离栓塞线前端约 8mm的部位处将颈总动脉线松开。利用激光多普勒血流仪确认了在阻断血 流前后、血流仪的数值变为1/10。

阻断血流30分钟后将栓塞线拔去，使血流恢复。12小时后，将纯化 HMGB-1（10μg）用500μL的PBS稀释，从所制作的疾病模型小鼠的尾静 脉投予。之后每隔24小时同样地投予HMGB-1，进行4次。对照小鼠投予 PBS。

从治疗最终日开始的5天后，在异氟醚的吸入麻醉下，使用2%多聚甲 醛进行灌流固定。将脑从头盖骨中取出，脱水后投入至OTC复合物内，在 干冰上使其冻结，制作团块。团块使用冷冻切片用的切片机制作厚度为8μm 的切片，并在硅烷涂覆的载玻片上伸展。伸展后使其充分地干燥，使用PBS 洗涤复合物。使用含4%多聚甲醛的PBS固定10分钟后，利用磷酸缓冲液 洗涤5分钟、用蒸馏水浸透10分钟。进而使用0.5%甲酚紫溶液染色13分 钟。用蒸馏水洗涤1分钟后，分别浸透至50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇、 100%乙醇中10秒钟后，浸透至二甲苯中2分钟，重复2次。进而使用Entellan 液进行封固。

将结果示于图6。与PBS投予小鼠相比，HMGB-1投予小鼠中在脑梗 塞灶处确认到了显著的改善效果。

本实验中，通过在脑梗塞制作后将HMGB-1投予至血管内，可见脑梗 塞灶的缩小效果。目前已知通过在脑梗塞后静脉投予本人的骨髄细胞而具 有脑梗塞的改善效果，但由于HMGB-1具有动员骨髄来源的多能干细胞的 活性，因而可期待具有与静脉投予骨髄细胞时同样的效果。另外，由于将 HMGB-1直接投予至脑梗塞部位会有可能诱发脑组织的损伤或引发炎症 等，因而本实验这种血管内投予、皮下投予等不同位置性投予是能够治疗 脑梗塞的优异的投予方法。

实施例7

通过HMGB-1投予所带来的脑梗塞后的存活率改善

使用异氟醚对8周龄C57/Bl6雄性小鼠进行吸入麻醉后，将头部皮肤切 开，将激光多普勒血流仪探头直接粘接在头盖骨上确认脑血流。进而，将 胸骨至下颚的正中皮肤切开，将右颈总动脉剥离，使用4号丝线慢慢结扎。 在右颈外动脉的远处部用6号丝线结扎。一边对颈总动脉的线施加张力， 一边在右颈外动脉近位部处开孔，插入前端加热成形了700μm的6号单丝 尼龙线（栓塞线）。向内颈动脉推进栓塞线，在插入至距离栓塞线前端约 8mm的部位处将颈总动脉线松开。利用激光多普勒血流仪确认了在阻断血 流前后、血流仪的数值变为1/10。

对各个小鼠分别进行一定时间（45分钟或60分钟）的血流阻断后，将 栓塞线拔去，使血流恢复。12小时后，将纯化HMGB-1（10μg）用500μL 的PBS稀释，从所制作的疾病模型小鼠的尾静脉投予。之后每隔24小时同 样地投予HMGB-1，进行4次。对照小鼠投予PBS。观察梗塞制作后7天 内的存活率。

将结果示于图7。梗塞时间为30分钟的小鼠全部存活到7天后（分别 N=3）（未图示）。梗塞时间为45分钟的小鼠中，PBS投予例中7天后的 存活率为40%、而HMGB-1投予例中全部小鼠存活。梗塞时间为60分钟 的小鼠中，PBS投予例中7天后的存活率为50%、而HMGB-1投予例中全 部小鼠存活。

在45分钟和60分钟的梗塞时间的任一模型中，对照组（PBS投予组） 中存活到7天后的都是约为半数。通过在脑梗塞制作12小时后开始投予 HMGB-1，可见至梗塞制作7天后的存活率改善。脑梗塞是根据梗塞的部位、 范围、时间而左右生命预后的疾病。另外，由于脑梗塞经常会伴有麻痹、 意识消失等，因而有时很迟才会去医疗机构。目前可确认效果的t-PA制剂 等药品由于需要在发病后3小时~4小时以内进行投予，因而在所有脑梗塞 症例中可适用该制剂的比例极少。脑梗塞发病后经过长时间时也可进行投 予且有效的治疗药目前还很少。本发明利用静脉内投予这种极为简便且低 侵袭的方法、即便在脑梗塞发病后经过长时间（12小时后）开始投予也可 改善生命预后，因此能够开发出对于多数脑梗塞的例子可进行投予的新型 脑梗塞治疗药。

实施例8

骨折治愈过程中骨折部以外部位的骨髓多能干细胞的参与

对C57BL/6雄性小鼠（6周龄）照射致死量放射线（10Gy），之后立 即从尾静脉移植GFP（绿色荧光蛋白）转基因小鼠来源的骨髄细胞（5×10⁶个/0.1ml生理性磷酸缓冲溶液(pH7.4)）（GFP骨髄嵌合体小鼠）。8周后， 制作用皮肤将GFP骨髄嵌合体小鼠（图8左边小鼠）和野生型小鼠（图8 右边小鼠）结合的联体共生。进而，在野生型小鼠（图8右边小鼠）的右 下肢制作骨折，制作骨折治愈后的组织切片。对切片用含4%脱脂乳的PBS 封闭后，使利用含4%脱脂乳的PBS稀释过的抗小鼠骨钙素抗体发生反应， 用PBS进行洗涤后，在室温下使利用含4%脱脂乳的PBS稀释过的PE标记 抗大鼠IgG抗体反应1小时。用PBS洗涤后，使用DAPI对细胞核进行染 色，进而用PBS洗涤。封固后利用共聚焦激光显微镜观察荧光。

将其结果示于图8。骨钙素（OC）为红色荧光部分，作为骨髓源性细 胞的GFP阳性细胞为绿色荧光部分。重叠图像（Merge）的黄色的细胞是 骨钙素阳性的骨髓源性细胞。即，由图8显示了：左侧的GFP骨髄嵌合体 小鼠的骨髄细胞移动至野生型小鼠的右足的骨折部位并分化成成骨细胞。

一直以来，认为在骨折的治愈过程中损伤部位附近的成骨细胞集中到 损伤部位促进治愈。但是，由本结果可知：损伤部位远处的骨髓源性细胞 移动至骨折部分进行损伤组织的修复。由于左边小鼠与右边小鼠通过皮下 和皮内的血管相连，因此只要能够将大量的骨髓间充质干细胞等骨髓多能 干细胞从全身骨髄动员至血中，则可预料到能够促进骨折部分的治愈。

实施例9

目的：骨折模型小鼠中通过HMGB1静脉投予所带来的骨髓间充质干 细胞向损伤部位的动员活性的评价。

方法：针对上述目的，利用以下的方法进行研究。

1）在实验中，使用在PDGF受体α的启动子下游基因组敲入有GFP 蛋白的小鼠（PDGFRα-GFP小鼠）（参考文献：Hamilton et al.,Mol Cell Biol. 2003Jun；23（11）:4013-25）。该小鼠由于在PDGF受体α表达的细胞中 表达GFP蛋白，因而使用荧光显微镜进行观察时可以检测到绿色的荧光。

2）采集PDGFRα-GFP小鼠的骨髄细胞，接种于细胞培养用皿中，用 含10%FBS的α-MEM进行培养。每3-4天更换培养基，约14天后将附着 的细胞回收。使用抗CD11b MACS珠将回收的细胞分为CD11b阳性细胞和 CD11b阴性细胞。利用荧光显微镜进行观察时确认了：CD11b阳性细胞为 GFP阴性（图42的A1、A2）、CD11b阴性细胞为GFP阳性（图42的B1、 B2）。为了研究HMGB1是否使这些细胞迁移，进行Boyden小室法。在 Boyden小室的上层分别放入CD11b阳性细胞或CD11b阴性细胞，在下层 放入按照浓度达到0、50、100μg/mL的方式将HMGB1稀释至含10%FBS 的DMEM中的液体。小室在37℃、5%CO₂的孵育箱内静置。4小时后将小 室的膜回收，通过对向下层迁移的细胞进行染色来进行检测（图43）。

3）使用异氟醚对12周龄雄性PDGFRα-GFP小鼠实施全身麻醉，制作 左下腿胫骨的骨折模型。将10μg的HMGB1稀释于500μL的PBS中，在 骨折刚制作后、24小时后、48小时后的共计3次从尾静脉实施投予。阴性 对照从尾静脉投予500μL的PBS（N=6）。

4）在骨折制作72小时后取出左下腿胫骨，使用含4%多聚甲醛的PBS 静置24小时将组织固定。用PBS洗涤后，使用荧光实体显微镜检测GFP 的荧光（图44）。

结果：

CD11b阳性的细胞教示了为GFP阴性且不表达PDGF受体α（图42 的A1、A2）。CD11b阴性的细胞教示了为GFP阳性且表达PDGF受体α （图42的B1、B2）。CD11b阳性（PDGF受体α阴性）细胞通过HMGB1 不会迁移，而CD11b阴性（PDGF受体α阳性）细胞通过HMGB1发生了 迁移（图43）。

与作为阴性对照小鼠的PBS投予（图44的D1）组进行比较时，HMGB1 投予（图44的D2）组的6只中有4只在骨折部位周围的骨内观察到了GFP 阳性（PDGF受体α阳性）细胞。

讨论：本实验中，为了以活着的状态观察骨髓间充质干细胞，使用了 作为骨髓间充质干细胞的标记物之一的PDGF受体α阳性细胞表达GFP的 小鼠（PDGFRα-GFP小鼠）。已知骨髄细胞中含有造血系细胞（红细胞、 白细胞、巨噬细胞等）、间充质细胞，这些细胞中黏附在细胞培养皿上的 细胞为巨噬细胞（CD11b阳性）和骨髓间充质干细胞（CD11b阴性）。另 外，由于PDGF受体α是骨髓间充质干细胞的标记物之一，因而认为通过 本实验获得的CD11b阴性且GFP阳性（PDGF受体α阳性）是骨髓间充质 干细胞。由Boyden小室法的结果可知，HMGB1不会使巨噬细胞（CD11b 阳性细胞）迁移、而使骨髓间充质干细胞（PDGF受体α阳性、CD11b阴 性）迁移。另外，在使用了PDGFRα-GFP小鼠的骨折模型小鼠中可见：与 阴性对照组相比，HMGB1投予组中GFP阳性细胞（PDGF受体α阳性细 胞）聚集在骨折部分的周围。这些GFP阳性细胞认为是被HMGB1动员的 骨髓间充质干细胞。

已知骨髓间充质干细胞是分化成成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等的 多能干细胞。而通常来说，骨折的治愈机制是通过成骨细胞从骨折部位或 附近迁移来进行治愈，但如实施例8的联体共生的实验结果所示，认为骨 折部位以外的骨的骨髓间充质干细胞也有助于骨折部分的再生。

由本实验的结果可知，通过HMGB1的静脉内投予，动员至血中内的 骨髓间充质干细胞集中到骨折部分，由此认为HMGB1可作为骨折的治疗 药使用。

由于作为CD11b阳性细胞（PDGF受体α阴性）的巨噬细胞是炎症系 的细胞，因而不会迁移巨噬细胞与防止过度的炎症有关。过度的炎症会导 致组织损伤的扩大或延长治愈期间，因而在组织再生中成为不利因素。该 结果表明：HMGB1具有特异性地迁移对组织再生有效的间充质干细胞的活 性。

现有的骨折治疗主要是非侵袭性复位或手术、石膏固定等，用于积极 促进骨折部位治愈的药剂基本不存在。本方法由于通过药剂的静脉投予来 进行，因而还可应用于难治性骨折、手术困难的骨折等，可提供目前没有 的划时代的治疗方法。

（参考例1）

目的：评价生物体移植皮肤组织的功能性再生时骨髓源性细胞的贡献

方法：针对上述目的，利用以下方法进行研究。

1）利用针对GFP骨髄移植小鼠的生物体皮肤移植体系，研究移植皮肤 片的功能性再生时骨髓源性细胞的贡献程度。具体地说，对C57/BL6雄性 小鼠（6~8周龄）照射致死量放射线（10Gy），之后立即从尾静脉移植GFP （绿色荧光蛋白）转基因小鼠来源的骨髓细胞（5×10⁶个/0.1ml生理性磷酸 缓冲溶液(pH7.4)）。

2）等待移植骨髄细胞的移入（6周），从而在获得的GFP骨髄移植小 鼠的背部皮肤上移植了新生小鼠皮肤（雌性）。

3）等待移植皮肤片的移入和充分的皮肤组织再生（4周），利用荧光 实体显微镜观察移植皮肤片区域上的GFP荧光的聚集程度。

4）在吸入麻醉下通过生检采集移植皮肤片，使用带冷却装置的切片机 制作皮肤冷冻切片（6μm），进行4%多聚甲醛固定（30分钟），用DAPI 将组织内的细胞核染色，使用表皮细胞特异性角蛋白5的抗体实施免疫染 色后，将组织封固，利用共聚焦激光显微镜研究GFP阳性骨髓源性细胞的 存在。另外，一部分的标本利用HE染色研究其组织构建。

结果：在向GFP骨髄移植小鼠的生物体皮肤移植体系中，在再生后的 皮肤区域观察到了同样强的GFP荧光的聚集（图9）。另外，在使用了移 植皮肤片的HE标本的组织学观察中，确认了含有大量毛囊的皮肤组织的功 能性再生（图9）。在利用共聚焦激光显微镜的观察中，表达角蛋白5的表 皮角质形成细胞、真皮成纤维细胞、以及平滑肌细胞或脂肪细胞的多数显 示GFP荧光，显示了这些细胞是骨髄来源的（图10）。即，首次弄清楚了 在移植皮肤的功能性再生时所需的上皮系和间充质细胞的多数是由骨髄来 源的干细胞提供的。

讨论：这些研究结果首次明确地表明了在目前临床现场中日常进行的 皮肤移植的皮肤再生时，骨髓源性细胞作出很大贡献，这是极有意义的发 现。

有报告指出，在骨髄内存在造血系干细胞和间充质干细胞这2种干细 胞系统。本次研究中显示了大量动员至移植皮肤内的骨髄来源的上皮系细 胞和间充质细胞是由骨髄来源的造血系干细胞提供的，这是很难预想到的， 强烈地教示了骨髄来源的间充质干细胞对移植组织的功能性再生作出贡献 的可能性。即，可以预想到：在刚植皮后，由处于灌注不足、坏死方向的 移植皮肤组织释放骨髄来源的间充质干细胞动员因子，将间充质干细胞从 骨髄介由末梢血液循环动员至移植皮肤片内，从而诱导功能性皮肤组织再 生。

（参考例2）

目的：皮肤组织提取液内存在的骨髓间充质干细胞诱导因子的鉴定

方法：为了鉴定被预想到是从处于灌注不足状态的切除皮肤释放的骨 髓间充质干细胞动员因子，通过以下的方法进行研究。

1）为了获得小鼠骨髓来源的间充质干细胞，从C57BL/6小鼠的大腿骨 或下腿骨采集骨髓细胞，将含有10%胎牛血清的D-MEM（Nacalai公司制） 作为细胞培养培养基而加入细胞培养皿中，在37℃、二氧化碳气体浓度为 5%的条件下进行培养。当细胞增殖到其所占的面积相对于培养皿底面积为 70～100%时，用0.25%胰蛋白酶1mM EDTA（Nacalai公司制）将细胞从培 养皿上剥离，再在相同的条件下进行传代培养。传代操作至少重复5次以 上。然后，将这些附着细胞分离培养，用流式细胞仪对细胞表面抗原进行 分析，确认为Lin阴性、CD45阴性、CD44阳性、Sca-1阳性、c-kit阴性。 确认了这些细胞能够分化为骨细胞、脂肪细胞且具有骨髓间充质干细胞的 性质。

2）将从400只新生小鼠获得的游离皮肤片浸渍到生理性磷酸缓冲液 (pH7.4)（PBS）400ml内，在4℃下进行24小时的孵育后，为了除去组织， 在4℃的条件下以440G离心10分钟，回收上清，从而制作了皮肤提取液。

3）为了确认所获得的皮肤提取液中存在骨髓间充质干细胞诱导活性， 本发明人等使用Boyden小室对已形成细胞株的C57BL6小鼠骨髓来源的间 充质干细胞的迁移活性进行了研究。具体而言，在Boyden小室的下槽（容 量为25μl）中插入皮肤提取液（25μl），放置具有8μm微孔的聚碳酸酯膜， 然后与该碳酸酯膜相接地放置Boyden小室上槽（容量为50μl），向其中加 入骨髓来源的间充质干细胞悬浮液（5×10⁴个/50ml培养液：DMEM/10%胎 牛血清），在CO₂孵育箱内、在37℃下培养4~24小时。培养后，将小室 的上槽拿开，取出硅薄膜，利用染色定量地研究通过所述微孔迁移到小室 下槽的骨髓来源的间充质干细胞的数量。

4）进行肝素亲和柱层析法和阴离子交换柱（Q柱）色谱法以对皮肤提 取液内的具有骨髓来源的间充质干细胞动员活性的因子进行纯化。用4℃的 9倍容积的20mM磷酸缓冲液(pH7.5)将皮肤提取液稀释到10倍（稀释液A）。 预先使20mM磷酸缓冲液(pH7.5)（30ml）流到HiTrap肝素HP柱（柱容量： 5ml，GE Healthcare）中使柱平衡。然后，使稀释液A与柱结合。然后，用 20mM磷酸缓冲液(pH7.5)、100mM NaCl（30ml）对柱进行洗涤。为了将吸 附的蛋白洗脱，向柱内流入20mM磷酸缓冲液(pH7.5)、1000mM NaCl，将 洗脱液分级至管内。对吸附级分分别收集通过2）所说明的利用Boyden小 室的迁移活性评价法具有迁移能力的级分。将其用9倍容量的50mM Tris  HCl(pH8.0)进行稀释（稀释液B）。预先使50mM Tris HCl(pH8.0)（30ml） 流到HiTrap mono Q柱（柱容量：1ml，GE Healthcare）中使柱平衡。然后， 使稀释液B与柱结合。为了将吸附的蛋白质洗脱，向柱内流入Tris  HCl(pH8.0)、1000mM NaCl，将洗脱液分级至管内。以上的纯化过程都可在 4～16℃下进行，优选在4～8℃下进行，更优选在4℃下进行。通过2）所 说明的利用Boyden小室的迁移活性评价方法对该洗脱液进行评价。

5）将通过利用Boyden小室的迁移活性评价和利用柱/色谱法的组合获 得的具有骨髄来源间充质干细胞动员活性的由皮肤提取液纯化的标准品利 用SDS-PAGE电泳法根据分子量进行凝胶内分级，通过银染色检测电泳蛋 白的条带。

6）在通过5）的SDS-PAGE电泳和银染色而作为单一条带进行了凝胶 内分级的皮肤提取液来源的蛋白组中，将由骨髄来源的间充质干细胞动员 活性最强的色谱法纯化标准品获得的蛋白条带全部切出，利用质谱分析和 数据库解析进行该蛋白的鉴定。

7）由所鉴定的蛋白组中选择具有骨髄来源的间充质干细胞动员活性的 候选蛋白，用中和抗体对含有该候选蛋白的纯化标准品进行处理（在该蛋 白的多克隆抗体稀释100倍的条件下在冰上对纯化标准品溶液100μl孵育 30分钟）后，通过使用Boyden小室的迁移能分析来研究骨髄来源间充质干 细胞动员活性的抑制程度。

8）将所得的骨髄来源间充质干细胞纯化标准品混合到基质胶（matrigel） 中，使得达到约10%体积，插入至直径为约1mm、5mm长的硅管内，将其 移植到GFP骨髄移植小鼠背部皮下。2周后取出插入管，利用荧光测定装 置定量地分析由迁移至管内的骨髓源性细胞发出的GFP荧光。进而，从管 内将迁移细胞取出，接种在DMEM/10%胎牛血清培养基中，在CO₂孵育箱 中进行培养，从而研究骨髄来源间充质干细胞的生物体内动员活性。继续 培养2周后的细胞用2%多聚甲醛在25℃的条件下固定10分钟后，每5分 钟使用PBS洗涤多聚甲醛，进行4次，用2%脱脂乳液进行处理，在4℃的 条件下使利用含0.5%tween 20的2%脱脂乳稀释至1000倍的抗小鼠角蛋白 5抗体反应16小时。每5分钟使用PBS洗涤抗体，进行4次，在25℃的条 件下使利用2%脱脂乳稀释至1000倍的Alexa546标记抗兔子IgG抗体反应 1小时。

结果：将从切除的新生小鼠皮肤提取至PBS中的溶液作为起始材料， 利用上述方法进行具有骨髄来源间充质干细胞动员活性的蛋白质的鉴定和 功能解析。通过利用Boyden小室的迁移活性解析显示，皮肤提取液中具有 极强的骨髄来源间充质干细胞诱导活性（图11）。以该活性为指标，使用 肝素亲和柱和阴离子交换柱（Q柱）进行目标因子的纯化，使用SDS-PAGE 电泳对所得各级分进行解析，结果显示：在含有通过银染色作为单一条带 进行了凝胶内分级的多个蛋白的纯化标准品内具有很强的骨髄来源间充质 干细胞动员活性（图12泳道7）。将所得的银染色条带切出，进行质谱分 析、数据库解析，结果可知：用箭头表示的分子量约为25,000的蛋白是 HMGB1（图12）。为了明确该纯化级分（泳道7）中所含的HMGB1具有 目标的骨髄来源间充质干细胞动员活性，进行利用抗HMGB1多克隆抗体 的迁移抑制实验。结果可知：抗HMGB1多克隆抗体强烈地抑制了该纯化 标准品中的骨髄来源间充质干细胞迁移活性（图13），存在于皮肤提取液 内的骨髄来源干细胞动员因子是HMGB1。

进而，为了确认HMGB1在生物体内具有骨髄来源间充质干细胞动员 活性，将放有该纯化标准品的硅管插入到GFP骨髄移植小鼠背部皮下，研 究2周后动员至管内的细胞的性质。结果是：与对照组（图12中SDS-PAGE 泳道4中使用的纯化标准品）相比，HMGB1纯化标准品将大量（对照组的 约3倍）GFP阳性的骨髓源性细胞动员至管内（图14）。图15表示利用荧 光实体显微镜拍摄的强放大图像。进而，将动员至管内的GFP阳性细胞取 出，在DMEM/10%胎牛血清培养基内进行培养，结果确认了：刚开始培养 后是圆形的悬浮细胞状态（图16），但24小时后GFP阳性骨髓源性细胞 附着在培养皿上，作为纺锤丝的成纤维细胞样形态、进而近似圆形的上皮 细胞样形态的细胞进行增殖（图17）。进而确认了：将这些细胞继续培养 2周时，在GFP阳性骨髓源性细胞中可见呈毛囊形态的细胞（图18A：明 视野、弱放大，图18B：GFP荧光、弱放大，图18C：明视野、强放大， 图18D：GFP荧光、强放大）。另外，对作为上皮角质形成细胞的标记物 的角蛋白5进行免疫组织化学时，在GFP阳性骨髓源性细胞中确认了角蛋 白5阳性细胞（图18E：明视野，图18F：角蛋白5阳性细胞的荧光）。

讨论：这次，本发明的发明人在世界上首次发现了：游离皮肤片会产 生HMGB1；所产生的HMGB1具有将骨髓来源的间充质干细胞大量动员至 皮肤片内的活性；动员至皮肤片内的骨髓来源间充质干细胞在皮肤组织中 分化成成纤维细胞、脂肪细胞、平滑筋细胞等间充质细胞，进而分化成形 成表皮细胞毛囊的细胞，由此诱导移植皮肤组织的功能性再生。可以容易 地预想到利用该HMGB1的骨髄来源间充质干细胞动员和作为其结果的功 能性组织再生不仅对于移植皮肤再生作为功能性组织再生诱导机制发挥功 能，而且在伴有灌注不足、坏死的多数器官和组织损伤时也作为功能性组 织再生诱导机制发挥功能。相信通过利用HMGB1制剂开发药品，若能在 损伤组织再生时将骨髄来源间充质干细胞动员至局部位置，则可进行没有 纤维性疤痕治愈所导致的功能障碍、必要的功能性器官相伴的功能性组织 再生诱导医疗。

（参考例3）

目的：皮肤提取液中HMGB1家族的鉴定和骨髓间充质干细胞诱导活 性的研究

方法：使用Western blot法确认了新生小鼠皮肤提取液中是否含有 HMGB蛋白家族。使用SDS-PAGE法将作为样品的[参考例2]中获得的皮 肤提取液10μl进行电泳，使用印迹装置（ATTO）将凝胶中分离出的蛋白 转移到PVDF膜上。用含有3%脱脂乳的0.1%Tween 20的PBS（S-T-PBS） 在室温下孵育1小时，然后使其分别与用S-T-PBS稀释至1000倍的兔抗小 鼠HMGB1抗体、兔抗小鼠HMGB2抗体、兔抗小鼠HMGB3抗体在4℃下 反应16小时。反应后，将该PVDF膜用S-T-PBS洗涤5分钟、5次，然后 将该PVDF膜使用用S-T-PBS稀释2000倍的过氧化物酶标记山羊抗兔IgG 抗体（GE Healthcare）在25℃下孵育1小时。然后用S-T-PBS洗涤5分钟、 5次，然后使ECL Western Blotting检测系统（GE Healthcare）与该PVDF 膜反应，在使ECL胶片感光后进行显影，检测HMGB1、HMGB2、HMGB3 蛋白的存在。

使用Trizol（invitrogen）从新生小鼠皮肤提取RNA，然后使用SuperScript  III cDNA合成试剂盒（Invitrogen）合成cDNA。以该cDNA为模板，使用 PCR（聚合酶链反应）法对HMGB1、HMGB2、和HMGB3的cDNA进行 扩增，将其插入在哺乳类细胞中表达蛋白的质粒载体pCAGGS中，以使得 表达在氨基酸序列的N末端添加了Flag标签的序列 （Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lys；序列号：30）的蛋白。将这些质粒载体基 因导入至HEK293（人胎儿肾细胞来源的培养细胞株），培养48小时使蛋 白表达。将分别表达HMGB1、HMGB2和HMGB3蛋白的细胞和培养上清 在4℃下孵育16小时，然后以4400g离心5分钟，回收上清。将该上清每 50mL与100μL的抗Flag抗体Gel（Sigma）混合，在4℃下孵育16小时。 离心回收Gel，然后用PBS洗涤5次。然后使用3X Flag肽（终浓度100μg/ml） 进行洗脱。用使用了用S-T-PBS稀释1000倍的小鼠抗Flag抗体和用S-T-PBS 稀释2000倍的过氧化物酶标记抗小鼠IgG抗体（GE Healthcare）的Western  blot法确认了重组蛋白的表达。与[参考例2]同样地使用Boyden小室评价这 些纯化重组蛋白的小鼠骨髓间充质干细胞迁移活性。另外，为了观察HMGB 家族在体内的药效，将8周龄C57BL/6小鼠的背部皮肤切出直径为8μm的 圆形，从而制作皮肤溃疡模型，然后将纯化的HMGB1、HMGB2、HMGB3 各（100ng）与1g/100mL PBS浓度的透明质酸溶液分别等量混合，然后将 100μL投予至溃疡面。为了使溃疡面不干燥，用粘着性透明创伤覆盖/保护 材料Tegaderm（3M Healthcare）覆盖，测量经时的创伤面积，从而测定治 愈效果。

此外，为了调查人皮肤提取液和人纯化HMGB1是否具有将人骨髓间 充质干细胞迁移的活性，与[参考例2]同样地使用Boyden小室进行评价。 将面积为1cm²的人皮肤浸渍到1ml的PBS中，在4℃的条件下孵育16小 时，然后在4℃的条件下以440G离心10分钟。仅回收上清，将其用作人 皮肤提取液。另外，加入Boyden小室的上部的细胞使用人骨髓间充质干细 胞（Cambrex公司）（该细胞使用流式细胞仪进行细胞表面抗原分析的结 果为CD105阳性、CD166阳性、CD29阳性、CD44阳性、CD34阴性、CD45 阴性。此外，通过分化诱导试验，向脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞的分化 为阳性）。另外，在小室下部以100ng/孔加入人HMGB1（R&D公司）和 用PBS稀释10倍的人皮肤提取液，使用PBS作为对照。

结果：Western blot的结果是，除了HMGB1的条带以外，还检测到了 HMGB2和HMGB3的条带。因此确认了，新生小鼠皮肤提取液中在除 HMGB1之外还含有作为家族蛋白的HMGB2和HMGB3（图19）。制作了 分别在蛋白的N末端添加了Flag标签的HMGB1、HMGB2、HMGB3的表 达载体（图20）。将表达载体基因导入至HEK293细胞，在使用Flag标签 将表达的蛋白纯化后，使用Western blot法对蛋白进行了确认（图21）。对 使用了这些纯化蛋白的小鼠骨髓间充质干细胞的迁移活性进行测定，结果 确认了任一蛋白质均具有活性（图22）。每隔7天测量在小鼠背部制作的 溃疡面积，结果确认了：与非治疗组相比，HMGB1、2和3的治疗组具有 显著的溃疡面积缩小的效果（图23）。可知：与小鼠的情况相同，人HMGB1 和人皮肤提取液也具有将人骨髓间充质干细胞迁移的活性（图24）。

讨论：作为与HMGB1同源性高的蛋白，已知有HMGB2和HMGB3。 期待这些蛋白也具有与HMGB1同样的性质。这里，确认了从游离皮肤片 提取液中产生了作为HMGB1家族的HMGB2和HMGB3。此外，制作 HMGB1、HMGB2、HMGB3的重组蛋白，确认了在体外的骨髓间充质干细 胞迁移活性，并确认了在体内的皮肤溃疡治疗效果。可知：新生小鼠游离 皮肤片中的HMGB家族（HMGB1、HMGB2、HMGB3）和重组HMGB家 族具有骨髓间充质干细胞诱导活性和将骨髓来源的能够分化为上皮系的干 细胞诱导到局部的活性，并且，这些被诱导的骨髓来源的细胞群在损伤组 织中能够分化为表皮角质形成细胞、毛囊和成纤维细胞等各种各样的细胞， 从而具有促进损伤组织治愈的效果。另外，骨髓间充质干细胞由于是多能 干细胞，因此相信对于其他组织损伤状态、例如脑损伤、心肌梗塞、骨折 等组织损伤的治疗，通过全身投予或局部投予HMGB家族，可以期待同样 的治疗效果。

另外可知：人与小鼠的各自构成HMGB1的氨基酸序列具有98% （213/215）的同源性，各自构成HMGB2的氨基酸序列具有96%（202/210） 的同源性，各自构成HMGB3的氨基酸序列具有97%（195/200）的同源性。 因此可认为人的HMGB具有与小鼠的HMGB同样的活性，由本参考例的 结果可知：人的皮肤提取液、HMGB1与小鼠的皮肤提取液、HMGB1同样 地具有诱导骨髓间充质干细胞的活性。

（参考例4）

目的：确立骨髓间充质干细胞诱导因子组织提取液的制作方法

方法：将一只6周龄C57BL6份的脑、心脏、肠、肾脏、肝脏和一只 新生小鼠份的皮肤浸渍到生理性磷酸缓冲液(pH7.4)（PBS）1ml内，在4℃ 下孵育24小时后，为了除去组织，在4℃的条件下以440G离心10分钟， 回收上清，从而制成组织提取液。为了确认所得到的提取液中存在骨髓间 充质干细胞诱导活性，使用Boyden小室与[参考例2]同样地研究了对骨髓 来源间充质干细胞的迁移活性。另外，使用HMGB1 ELISA试剂盒 （Shino-Test）测量相同样品中所含的HMGB1的浓度。然后，使脑、心脏 和皮肤的组织提取液与[参考例2]同样地结合于肝素亲和柱，使用Boyden 小室确认了结合级分的蛋白的骨髓间充质干细胞诱导活性。

结果：小鼠脑提取液中含有与新生小鼠皮肤提取液等同的HMGB1。此 外，小鼠脑中与皮肤同样地可见骨髓间充质干细胞诱导活性。小鼠肠提取 液和小鼠心脏提取液中几乎不含有HMGB1，但也可见有骨髓间充质干细胞 的诱导活性。另外，小鼠脑、小鼠心脏的肝素柱结合级分与小鼠皮肤的肝 素柱结合级分同样地具有诱导骨髓间充质干细胞的活性（图25）。表1示 出了测定小鼠各组织提取液的HMGB1浓度与骨髓间充质干细胞的诱导活 性的结果。

表1

HMGB1浓度（ng/mL）   骨髓间充质干细胞诱导活性   皮肤   110   有   脑   140   有   心脏   4   有   肠   0   有   肾脏   115   ND   肝脏   61   ND

ND：未实施

讨论：开发出了仅通过将不仅仅是皮肤而且包括脑的器官浸渍到生理 性缓冲液中这样简便的方法即可简便地提取HMGB1的方法。该方法对于 其他器官、例如肝脏或肾脏也是同样的。另外，尽管从心脏或肠获得的提 取液中几乎不含有HMGB1，但也可见骨髓间充质干细胞诱导活性。这可认 为是由于提取液中含有与HMGB1不同的其他骨髓间充质干细胞诱导物质。 这些提取液中所含的物质本来就存在于各组织中，在生理上当组织损伤时 将骨髓间充质干细胞诱导到损伤组织。通过本发明开发出了从各种器官功 能性地且简便地提取含有HMGB1的多种骨髓间充质干细胞诱导物质的新 方法。此外，为了由组织提取液纯化骨髓间充质干细胞诱导物质，开发出 了使其与肝素柱结合的方法。另外，这些具有骨髓间充质干细胞诱导活性 的成分能够从脑或心脏通过与皮肤同样的方法采用肝素柱进行纯化。

（参考例5）

目的：确立从培养细胞提取间充质干细胞迁移活性物质的方法。

方法：将人胎儿肾来源的培养细胞株HEK293和人子宫颈癌细胞株 HeLa分别在含有10%胎牛血清的D-MEM（Nacalai公司制）中培养。将各 细胞用PBS洗涤后，将细胞107个浸渍到4℃的5ml的PBS（Nacalai公司 制）中16小时。以重力加速度为440G在4℃下离心5分钟，回收上清。 在Boyden小室的上层加入人骨髓间充质干细胞，在下层加入用DMEM稀 释了5倍的细胞提取液，确认人骨髓间充质干细胞迁移活性。

结果：HEK293提取液、HeLa提取液同样地均显示了将骨髓间充质干 细胞迁移的活性（图26）。

讨论：通过将培养细胞浸渍到PBS中这样的简便方法，成功地提取了 将骨髓间充质干细胞迁移的活性物质。

（参考例6）

目的：制作小鼠脑缺损模型，通过将皮肤提取液肝素柱纯化级分缓释 地投予至局部损伤部位，使自身骨髓系统中所含的干细胞迁移到局部损伤 部位，从而研究是否能够诱导神经系统细胞的再生。

方法：

（1）皮肤提取液肝素柱纯化级分的制作

将切除的新生小鼠皮肤在PBS（一只/ml）中在4℃下孵育16小时，将 从中提取的皮肤提取液用4℃的9倍容积的20mM磷酸缓冲液(pH7.5)稀释 到10倍。预先使20mM磷酸缓冲液(pH7.5)（30ml）流入HiTrap肝素HP 柱（柱容量：5ml，GE Healthcare）中使柱平衡。然后，使稀释液与柱结合。 其后，用20mM磷酸缓冲液(pH7.5)、100mM NaCl（30ml）对柱进行洗涤。 为了将吸附的蛋白洗脱，向柱内加入20mM磷酸缓冲液(pH7.5)、1000mM NaCl，将洗脱液分级到管中。使用上述所示的Boyden小室法分别评价吸附 级分的小鼠骨髓来源细胞株迁移活性，收集具有迁移能力的级分。将具有 该活性的溶液作为皮肤提取液肝素纯化级分用于以下的实验中。

（2）骨髓抑制小鼠的制作

对小鼠进行10Gy的X射线单次照射，制成骨髓抑制小鼠。

（3）向骨髓抑制小鼠的GFP小鼠骨髓移植

从GFP小鼠的两侧大腿骨和下腿骨采集骨髓细胞。将其从照射后经过 24小时的骨髓抑制小鼠的尾静脉投予。需要说明的是，投予是在异氟醚的 吸入麻醉下进行的。

（4）小鼠脑损伤（脑组织缺损）模型的制作

对移植了GFP小鼠的骨髓细胞的骨髓抑制小鼠用异氟醚进行吸入麻 醉，向腹腔内注入戊巴比妥（45mg/kg）。将小鼠固定到脑定位固定装置， 用手术刀从头部正中切开。在距前囟的右外侧2.5mm、前方1mm处用钻进 行头部穿孔（图27A）。以距离该部位深度为3mm的位置为前端，插入并 固定20G Surflow针的外筒。这里，使用注射器施加负压，以抽吸部分脑组 织（图27B）。

（5）皮肤提取液肝素柱纯化级分向脑组织缺损部的投予

在上述位置，使用Hamilton注射器和26G注射器，注入溶解于纤维蛋 白糊制剂的纤维蛋白原（Bolheal（化血研））的皮肤提取液肝素柱纯化级 分5μl，接着注入纤维蛋白糊制剂的凝血酶（Bolheal（化血研））5μl（图 27C）。通过该操作，获得皮肤提取液肝素柱纯化级分作为缓释剂的效果。

（6）脑组织缺损部的神经系统细胞再生效果的评价

使用对照组和治疗组的小鼠进行评价。确定适当的经过设定（经时地）， 将小鼠用4%多聚甲醛灌流固定后，将脑切出。然后，用4%多聚甲醛外固 定。在用15%和30%梯度的蔗糖脱水后，制成冷冻切片。

用DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐）溶液进行核染色，使用防 光消退剂进行封固。用激光共聚焦显微镜评价损伤部位（脑组织缺损部） 的GFP阳性细胞的聚集。

结果：定性地表示投予后2周和6周后的GFP阳性细胞聚集。在2周 后（对照：图27D，皮肤提取液肝素柱纯化级分：图27E）和6周后（对照： 图27F，皮肤提取液肝素柱纯化级分：图27G），与对照组相比，治疗组的 损伤部位均具有GFP阳性细胞的聚集更多的倾向。

讨论：通过投予皮肤提取液肝素柱纯化级分，骨髓来源的细胞聚集于 脑组织缺损部位并显示神经细胞的形态。已知骨髓来源间充质干细胞也能 够分化为神经细胞，从本结果可知：通过皮肤提取液肝素柱纯化级分，能 够诱导脑损伤部位的神经系统细胞再生。另外，其也能够用于脑缺血性疾 病或脑挫伤中的脑组织障碍部位的神经再生。

（参考例7）

目的：皮肤组织提取液内存在的骨髓来源组织干细胞诱导因子所带来 的骨髓组织干细胞向末梢血的动员

方法：针对上述目的，通过以下的方法进行研究。

1）骨髓来源的组织干细胞诱导剂的制备：将从25只新生小鼠（2日龄） 获得的游离皮肤片浸渍到生理性磷酸缓冲液(pH7.4)（PBS）25ml中，在4℃ 下孵育24小时后，为了除去组织，在4℃的条件下以440G离心10分钟， 回收上清，从而制作了皮肤提取液（SE）。

使用Trizol（invitrogen）从C57/Bl6新生小鼠皮肤提取RNA，然后使 用SuperScript III cDNA合成试剂盒（Invitrogen）合成cDNA。将该cDNA 作为模板，使用PCR（聚合酶链反应）法对HMGB1的cDNA进行扩增， 将其插入到在哺乳类细胞中表达蛋白质的质粒载体pCAGGS中，以使得表 达在氨基酸序列的N末端添加有Flag标签的序列 （Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lys；序列号：30）的蛋白质（图20）。将这 些质粒载体基因导入至HEK293（人胎儿肾细胞来源的培养细胞株）中培养 48小时，使蛋白质表达。将分别表达了HMGB1的细胞和培养上清在4℃ 下孵育16小时后，以4400g离心5分钟，将上清回收。在该上清每50mL 中混合100μL的抗Flag抗体Gel（Sigma），在4℃下孵育16小时。进行 离心，将Gel回收，之后使用PBS洗涤5次。进而，使用3X Flag肽（终 浓度100μg/ml）进行洗脱。洗脱出的蛋白质使用HMGB1 ELISA试剂盒 （Shino-Test）确认浓度，冷冻干燥后使用PBS调整至200μg/mL。

2）用安装有30G1/2的注射针的注射器从8周龄雄性小鼠（C57/Bl6） 的尾静脉投予上述皮肤提取液（SE）500μL或者作为阴性对照组的PBS 500μL（图28）。在投予6/12/24/48小时后，在异氟醚的吸入麻醉下，用经 肝素涂覆的1mL的注射器从小鼠的心脏采集末梢血1mL，在与3mL的PBS 混合后，轻轻地叠置于3mL的Ficol（GE healthcare）的上面。用离心机在 25℃下以400g离心40分钟。回收中间层的白色混浊层的细胞作为单核细 胞级分。向回收的细胞中加入1mL的溶血剂HLB溶液（免疫生物研究所）， 在室温下孵育5分钟。重复该溶血操作2次。加入10mL的PBS，在25℃ 下以440g离心5分钟，除去上清，回收细胞。将该细胞1,000,000个与分 别用PBS稀释100倍的抗小鼠PE标记PDGFRα抗体（e-Bioscience）、PE 标记抗小鼠PDGFRβ抗体（e-Bioscience）、PerCy5标记抗小鼠CD44抗体 （BD biosciences）在室温下孵育20分钟。其后，将该细胞在25℃以440g 离心5分钟，除去上清。加入含1%多聚甲醛的PBS 400μL，制成流式细胞 分析的样品。

用安装有30G1/2的注射针的注射器从8周龄雄性小鼠（C57/Bl6）的尾 静脉投予小鼠HMGB 1250μL（1μg/μL）或者作为阴性对照组的PBS 250μL （图29）。在投予12小时后，在异氟醚的吸入麻醉下，用经肝素涂覆的 1mL的注射器从小鼠的心脏采集末梢血1mL，在与3mL的PBS混合后， 轻轻地叠置于3mL的Ficol（GE healthcare）的上面。用离心机在25℃下以 400g离心40分钟。回收中间层的白色混浊层的细胞作为单核细胞级分。向 回收的细胞中加入1mL的溶血剂HLB溶液（免疫生物研究所），在室温下 孵育5分钟。重复该溶血操作2次。加入10mL的PBS，在25℃下以440g 离心5分钟，除去上清，回收细胞。将该细胞1,000,000个与分别用PBS稀 释100倍的抗小鼠PE标记PDGFRα抗体（e-Bioscience）、PerCy5标记抗 小鼠CD44抗体（BD biosciences）在室温下孵育20分钟。其后，将该细胞 在25℃以440g离心5分钟，除去上清。加入含1%多聚甲醛的PBS 400μL， 制成流式细胞分析的样品。

结果：在注射皮肤提取液（SE）12小时后的末梢血中，确认了PDGFRα 阳性、CD44阳性细胞被显著地动员（图30）。在HMGB1注射12小时后 的末梢血中，确认了PDGFRα阳性、CD44阳性细胞被显著地动员（图31）。

（参考例8）

目的：通过静脉内投予重组HMGB1蛋白来确认间充质干细胞是否被 动员到末梢血中。

方法：从C57BL6小鼠（8~10周龄、雄性）的尾静脉投予重组HMGB1 蛋白/生理盐水（100μg/ml）400μl（40μg HMGB1）或者生理盐水400μl。12 小时后采集小鼠末梢血，加入PBS将总量稀释到4mL。向离心管中加入 Ficoll-Paque Plus（GE）液3mL，然后在其上叠置稀释血液。以400G（18℃） 离心40分钟，将含有单核细胞的中间层回收到新的离心管中，加入45mL 的PBS以800G（18℃）离心5分钟，除去上清，然后再一次加入45mL的 PBS、以80G（18℃）离心5分钟并除去上清。使得到的单核细胞与藻红素 （PE）标记抗小鼠PDGFRα抗体和异硫氰酸荧光素（FITC）标记抗小鼠 CD44抗体发生反应，然后利用流式细胞仪（Facscan;Becton,Dickinson and  Company）评价单核细胞级分内的PDGFRα阳性/CD44阳性细胞的存在频 率。

结果：可知HMGB1投予12小时后，末梢血单核细胞级分内的PDGFRα 阳性且CD44阳性细胞和PDGFRα阳性且CD44阴性细胞显著地增加（图 32）。即显示了：HMGB1具有将作为间充质干细胞的标记物已知的PDGFRα 阳性细胞从骨髓内动员到末梢血中的活性。

讨论：PDGFRα和CD44已知是代表骨髓来源多能干细胞的骨髓间充质 干细胞的表面标记物。骨髓间充质干细胞是能够分化为骨细胞、软骨细胞、 脂肪细胞的多能干细胞，并且还能够分化为神经细胞和上皮细胞等。另外， 本实验中使用的皮肤片由于为缺血状态，组织慢慢地变为坏死状态，从而 核等细胞内的蛋白质从细胞表面的蛋白质释放到周围。另外，HMGB1是皮 肤提取液中含有的蛋白质。在植皮等中，这些蛋白质成为信号，将骨髓来 源的组织干细胞动员到植皮片中，在植皮片内重建骨髓细胞来源的表皮、 皮下组织、毛囊组织等，使皮肤功能性地再生。本实验中，通过将这样的 皮肤提取液或HMGB1投予到静脉内，首次发现成功地将骨髓来源组织干 细胞动员到末梢循环中。根据该发现，通过将骨髓来源的多能干细胞动员 到末梢血中，从而使针对脑梗塞、心肌梗塞、骨折、皮肤溃疡等伴随着组 织损伤的难治性疾病的新治疗方法成为可能。另外，动员到末梢血中的细 胞能够与通常的采血方法同样采集，因此与目前为了治疗脑梗塞而从骨髓 进行采集的现有方法相比，是简便且安全的骨髓来源组织干细胞的采集方 法。

（参考例9）

目的：评价在生物体移植皮肤组织的功能性再生时的骨髓源性细胞的 贡献

方法：针对上述目的，通过以下的方法进行研究。

1）利用针对GFP骨髄移植小鼠的生物体皮肤移植体系，研究移植皮肤 片的功能性再生时的骨髓源性细胞贡献程度。具体地说，对C57BL/6雄性 小鼠（6～8周龄）照射致死量放射线（10Gy），之后立即从尾静脉移植 GFP（绿色荧光蛋白）转基因小鼠来源的骨髄细胞（5×10⁶个/0.1ml生理性 磷酸缓冲溶液(pH7.4)）。

2）等待移植骨髄细胞的移入（6周），从而在获得的GFP骨髄移植小 鼠的背部皮肤上移植了新生小鼠皮肤（雌性）。

3）等待移植皮肤片的移入和充分的皮肤组织再生（4周），利用荧光 实体显微镜观察移植皮肤片区域的GFP荧光的聚集程度。

4）在吸入麻醉下通过活检采集移植皮肤片，使用带冷却装置的切片机 制作皮肤冷冻切片（6μm），进行4%多聚甲醛固定（30分钟），用DAPI 将组织内的细胞核染色，用含防荧光消退剂的封固剂进行封固，然后利用 共聚焦激光显微镜研究GFP阳性骨髓源性细胞的存在。

结果：在向GFP骨髄移植小鼠的生物体皮肤移植体系中，再生后的皮 肤组织的表皮角质形成细胞、真皮成纤维细胞、以及平滑肌细胞或脂肪细 胞的多数显示GFP荧光，显示了这些细胞是骨髄来源的（图33）。即，在 移植皮肤的功能性再生时所需的上皮系和间充质细胞的多数是由骨髄来源 的干细胞提供的。

讨论：以上结果教示了：皮肤损伤时，骨髄细胞聚集至损伤部位，并 分化成构建皮肤的各种器官，从而对皮肤的功能性再生作出贡献。另外可 预想到在植皮皮肤片中具有聚集可分化成各种器官的骨髄细胞的物质。

有报告指出，在骨髄内存在造血系干细胞和间充质干细胞这2种干细 胞系统。本次研究中显示了大量动员至移植皮肤内的骨髄来源的上皮系细 胞和间充质细胞是由骨髄来源的造血系干细胞提供的，这是很难预想到的， 强烈地教示了骨髄来源的间充质干细胞对移植组织的功能性再生作出贡献 可能性。即，可以预想到：在刚植皮后，由处于灌注不足/坏死方向的移植 皮肤组织释放骨髄来源间充质干细胞动员因子，将间充质干细胞从骨髄介 由末梢血液循环动员至移植皮肤片内，从而诱导功能性皮肤组织再生。

（参考例10）

目的：皮肤组织提取液内存在的骨髓来源组织干细胞诱导因子的鉴定

方法：为了鉴定被预想是从处于灌注不足状态的切除皮肤释放的骨髓 间充质干细胞动员因子，如以下的方法进行研究。

1）为了获得小鼠骨髓来源的间充质干细胞，从C57BL/6小鼠的大腿骨 或下腿骨采集骨髓细胞，将含有10%胎牛血清的D-MEM（Nacalai公司制） 作为细胞培养培养基加入细胞培养皿中，在37℃、二氧化碳气体浓度为5% 的条件下进行培养。当细胞增殖到其所占的面积相对于培养皿底面积为 70～100%时，用0.25%胰蛋白酶1mM EDTA（Nacalai公司制）将细胞从培 养皿上剥离，再在相同的条件下进行传代培养。传代操作至少重复5次以 上。然后，将这些附着细胞分离培养，用流式细胞仪对细胞表面抗原进行 分析，确认为Lin阴性、CD45阴性、CD44阳性、Sca-1阳性、c-kit阴性。 确认了这些细胞能够分化为骨细胞、脂肪细胞且具有骨髓间充质干细胞的 性质。

2）将从5只新生小鼠（2日龄）获得的游离皮肤片浸渍到生理性磷酸 缓冲液(pH7.4)（PBS）5ml内，在4℃下进行24小时的孵育后，为了除去 组织，在4℃的条件下以440G离心10分钟，回收上清，从而制作了皮肤 提取液。另外，同样地将从1只6周龄小鼠获得的游离皮肤片浸渍到生理 性磷酸缓冲液(pH7.4)（PBS）5ml内，在4℃下孵育24小时后，为了除去 组织，在4℃的条件下以440G离心10分钟，回收上清，从而制作了皮肤 提取液。

3）为了确认所获得的皮肤提取液中存在骨髓间充质干细胞诱导活性， 本发明人等使用Boyden小室对已形成细胞株的C57BL6小鼠骨髓来源的间 充质干细胞的迁移活性进行了研究。具体而言，在Boyden小室的下槽（容 量为25μl）中加入2日龄或6周龄小鼠的皮肤提取液（5μl）与DMEM（20μl） 的混合液，放置具有8μm微孔的聚碳酸酯膜，然后与该碳酸酯膜相接地放 置Boyden小室上槽（容量为50μl），向其中加入骨髓来源的间充质干细胞 悬浮液（5×10⁴个/50ml培养液：DMEM/10%胎牛血清），在CO₂孵育箱内、 在37℃下培养4~24小时。培养后，将小室的上槽拿开，取出硅薄膜，利用 染色定量地研究了通过所述微孔迁移到小室下槽的骨髓来源的间充质干细 胞的数量（图34）。

4）从2日龄小鼠、6周龄小鼠各自的皮肤采集约2cm²，在液氮中快速 冷冻后，用研钵粉碎。使用RNeasy（Qiagen）从这些样品中提取并纯化RNA。 使用纯化的RNA利用微阵列分析筛选在2日龄小鼠中更多地表达的 mRNA。2日龄小鼠为2倍以上的得分高的基因有767个。从这些基因中， 研究与肝素亲和性高的蛋白质、具有分泌可能性的蛋白质、2日龄小鼠为6 倍以上的得分高的基因，结果存在作为上游第57个的基因的S100A9。为 此，用Western blot法检测S100A9和已知与S100A9形成异源二聚体的 S100A8在2日龄皮肤提取液中的存在。即，将2日龄皮肤提取液5μl与 SDS-PAGE样品缓冲液5μl（Bio-Rad）混合，在98℃下用加热块加热5分 钟，然后冷却至25℃。将该样品施于12.5%丙烯酰胺凝胶的e-PAGEL （ATTO）上，用电泳装置（ATTO）以40mA电泳75分钟。回收电泳后的 凝胶，用印迹装置（ATTO）将凝胶中的蛋白质转印到预先用100%甲醇处 理过的长7cm、宽9cm的PVDF膜（Millipore）上。转印在120mA下进行 75分钟。转印结束后回收PVDF膜，在含4%脱脂乳的PBS（nacalai）中在 室温下振荡30分钟。然后，将回收的PVDF膜浸渍到将5μl抗S100A8抗 体（R&D）或抗S100A9（R&D）用10mL的含4%脱脂乳的PBS稀释而得 到的液体中，室温下振荡60分钟。除去抗体液后，用30mL的含0.1%Tween 20的PBS将膜在室温下振荡洗涤5分钟。洗涤重复5次。洗涤后，将膜加 入到将5μl的HRP标记抗山羊IgG抗体（GE healthcare）用10mL的含4% 脱脂乳的PBS稀释而得到的液体中，在室温下振荡45分钟。在除去抗体液 后，用30mL的含0.1%Tween 20的PBS将膜在室温下振荡洗涤5分钟。 洗涤重复5次。用ECL检测试剂盒（GE healthcare）使膜发光从而使胶片 感光。利用显影装置对胶片进行显影，得到S100A8和S100A9的蛋白质的 信号（图35）。

5）进行肝素亲和柱层法以对皮肤提取液内的具有骨髓来源的间充质干 细胞动员活性的因子进行纯化。以下操作使用FPLC装置（GE healthcare） 进行。首先，将2日龄小鼠皮肤提取液用4℃的9倍容积的20mM磷酸缓 冲液(pH7.5)稀释到10倍（稀释液A）。预先使20mM磷酸缓冲液(pH7.5) （300ml）流到HiPrep 16/10肝素FF（GE Healthcare）中使柱平衡。然后， 使稀释液A与柱结合。然后，用20mM磷酸缓冲液(pH7.5)（300ml）对柱 进行洗涤。为了将吸附的蛋白质洗脱，制作（A液）20mM磷酸缓冲液(pH7.5)、 10mM NaCl与（B液）20mM磷酸缓冲液(pH7.5)、500mM NaCl。首先以A 液100%/B液0%进行送液、缓缓地增加B液的比例并最终以A液0%/B液 100%进行送液。总送液量为150mL。将洗脱液每管mL地分级到经涂覆的 管中。将分级的样品各5μl与SDS-PAGE样品缓冲液5μl（Bio-Rad）混合， 在98℃下用加热块加热5分钟，然后冷却至25℃。将该样品施于（5-20% 梯度）丙烯酰胺凝胶的e-PAGEL（ATTO）上，用电泳装置（ATTO）以40mA 电泳75分钟。电泳后用Dodeca银染色试剂盒o-Rad）检测电泳后的蛋白质 （图36）。

分别与上文同样地使用Boyden小室评价经分级的样品的各自的迁移活 性（图37）。

分别与上文同样地使用Western blot法检测经分级的各样品中S100A8 和S100A9蛋白质的存在（图38）。

6）使用Trizol（invitrogen）从新生小鼠皮肤提取RNA，然后使用 SuperScript III cDNA合成试剂盒（Invitrogen）合成cDNA。将该cDNA作 为模板，使用PCR（聚合酶链反应）法对S100A8和S100A9的cDNA进行 扩增，将其插入到在哺乳类细胞中表达蛋白质的质粒载体pCAGGS中，以 使得表达在氨基酸序列的N末端添加有GST标签的序列（序列号：31（氨 基酸序列）、序列号：32（DNA序列））的蛋白质（图39）。使用脂转染 试剂（Invitrogen）将pCAGGS-GST-S100A8或pCAGGS-GST-S100A9转染 到人胎儿肾细胞来源的HEK293培养细胞株中，48小时后回收细胞和培养 上清。将细胞和培养上清在4℃下以4400g离心5分钟，将上清（上清A） 和细胞分离，分别进行回收。细胞加入含0.1%Tween 20的PBS并在冰冷 却下对其进行30秒的超声波处理，从而破坏细胞膜。然后，在4℃下以4400g 离心5分钟，回收上清（上清B）。将上清A和上清B混合，添加到预先 用30mL的PBS置换了缓冲液的HiTrap GST FF柱（GE healthcare，5mL） 中。添加后用PBS 100mL对柱进行洗涤，用含有还原型谷胱甘肽的20mM 磷酸缓冲液（pH.8）将吸附的蛋白质洗脱。研究使用了重组S100A8和 S100A9的Boyden小室的骨髓间充质干细胞迁移活性。将纯化的S100A8 和S100A9蛋白质的浓度调整到0.1ng/μL 且溶解于DMEM而得到的样品或 用4倍容积的DMEM稀释2日龄小鼠皮肤提取液而得到的样品加入到 Boyden小室的下层。阴性对照同样地使用从转染了未插入S100A和S100A9 cDNA的对照载体的细胞中提取蛋白质、从HiTrap GST FF柱洗脱得到的级 分。将样品加入下层后，放置具有8μm微孔的聚碳酸酯膜，然后与该聚碳 酸酯膜相接地放置Boyden小室上槽（容量为50μl），向其中加入骨髓来源 的间充质干细胞悬浮液（5×10⁴个/50ml培养液：DMEM/10%胎牛血清）， 在CO₂孵育箱内、在37℃下培养4~24小时。培养后，将小室的上槽拿开， 取出聚碳酸酯膜，利用染色定量地研究通过其微孔迁移到小室下槽的骨髓 来源的间充质干细胞的数量（图40）。

7）从8周龄雄性小鼠的尾静脉注入上述纯化的GST-S100A8和S100A9 重组蛋白质250μL（1ng/μL）。12小时后在异氟醚的吸入麻醉下，用经肝 素涂覆的1mL的注射器从小鼠的心脏采集末梢血1mL，与3mL的PBS混 合，然后轻轻地叠置于3mL的Ficol（GE healthcare）上。用离心机在25℃ 下以400g离心40分钟。回收中间层的白色混浊层的细胞作为单核细胞级 分。向回收的细胞中加入1mL的溶血剂HLB溶液（免疫生物研究所），在 室温下孵育5分钟。重复该溶血操作2次。加入10mL的PBS，在25℃下 以440g离心5分钟，除去上清，回收细胞。将该细胞1,000,000个与分别 用PBS稀释100倍的抗小鼠PE标记PDGFRα抗体（e-Bioscience）、PE标 记抗小鼠PDGFRβ抗体（e-Bioscience）、FITC标记抗小鼠CD45抗体（BD biosciences）、PerCy5标记抗小鼠CD44抗体（BD biosciences）在室温下 孵育20分钟。其后，将该细胞在25℃以440g离心5分钟，除去上清。加 入含1%多聚甲醛的PBS 400μL，制成流式细胞分析的样品。抗体使用（I） PDGFRα/CD45/CD44、（II）PDGFβ/CD45/CD44的组合。分析结果是研究 了PDGFRα（或β）和CD44的表达细胞与CD45弱阳性-阴性细胞的比例（图 41A、图41B）。

结果：通过研究切除的2日龄小鼠皮肤和6周龄小鼠皮肤的骨髓间充 质干细胞迁移活性，发现与6周龄小鼠相比、2日龄小鼠的皮肤提取液具有 更强的活性。根据DNA微阵列的结果可见，S100A9在2日龄小鼠皮肤中 强烈地表达。可见将皮肤提取液用肝素柱进行粗纯化得到的样品的间充质 干细胞迁移活性与含有S100A9和S100A8相关。制作这些蛋白质的表达载 体，并使用HEK293生产、纯化了重组蛋白质。在使用了Boyden小室的分 析中，这些S100A8、S100A9纯化品具有骨髓间充质干细胞迁移活性。另 外可知，通过小鼠静脉投予，这些蛋白质也表现出了将PDGFRα、CD44阳 性细胞群动员到末梢血中的活性（图41）。

讨论：这次，本发明的发明人在世界上首次发现了游离皮肤片产生 S100A8和S100A9，而且所产生的S100A8和S100A9具有强的将骨髓来源 的间充质干细胞迁移的活性。另外，骨髓间充质干细胞已知是能够分化为 骨组织、脂肪组织、软骨组织、成纤维细胞等的多能干细胞，最近也指出， 骨髓来源的细胞中存在也能够分化为心肌、神经细胞、表皮细胞等组织的 多能干细胞。这次植皮片的表皮细胞、毛囊细胞、皮下组织的成纤维细胞 等由骨髓来源的细胞构成，因此认为S100A8和S100A9能够将骨髓来源的 组织干细胞动员到植皮片中，从而诱导损伤组织的功能性修复。由于 S100A8和S100A9通过静脉注射投予能够将骨髓间充质干细胞动员到末梢 血中，因此使得难以局部投予的深部组织（脑、心脏、脊髄等）也能够通 过末梢循环来进行投予。相信通过利用本发明技术来制造药品，若能够在 损伤组织再生时将包括间充质干细胞的骨髓来源组织干细胞动员到局部， 则不仅能够使皮肤组织的组织损伤愈合，而且可期待在脑、肌肉、骨等各 种组织损伤治愈过程中缩短治愈时间、使损伤组织功能性再生等效果。