一种维生素B12复合发酵助剂及其在维生素B12发酵中的应用方法

摘要

本发明公开了一种维生素B12复合发酵助剂及其在维生素B12发酵中的应用方法，包含以下质量百分比的组分：90～98%的甜菜碱、0.15～0.55%的复合维生素和1.45～9.85%的复合氨基酸；所述复合维生素包含质量百分比30～55%的硫胺素、10～25%的盐酸吡哆醇和40～55%的叶酸；所述复合氨基酸包含质量百分比5～10%的赖氨酸、10～15%的丝氨酸、10～15%的谷氨酸、30～35%的天冬酰胺和30～40%的天冬氨酸。将复合发酵助剂添加到发酵中的维生素B12中，保证了发酵过程中各种营养成分的供应，有效提高了维生素B12的发酵产量。

说明书

技术领域

本发明涉及维生素B₁₂的制备，具体涉及一种用于维生素B₁₂发酵制备中的复 合发酵助剂及其应用方法。

背景技术

维生素B₁₂为钴胺类化合物，临床上主要用于治疗恶性贫血，同时也用于治 疗各种神经系统疾病和某些肝脏疾病等。

目前维生素B₁₂主要依靠脱氮假单胞菌通过好氧工艺发酵制得。发酵培养基 的主要成分包括有机碳源、有机氮源、甜菜碱、少量无机盐等。其中有机物中 附带的微量元素营养因子是正常机能与代谢活动不可或缺的因素，作为辅因子 参与很多微生物代谢的调控，是微生物代谢调控中的一个关键环节，不同水平 的辅因子可以改变特定酶活力的大小，从而重新分配碳架物质在细胞内的流向。 此外，微量元素营养因子还参与调节呼吸代谢的酶活性，作为辅酶因子提高微 生物对氧的利用率。但是在微生物发酵生产中，不同厂家、不同时间、不同工 艺生产的有机培养物中营养因子的含量参差不齐，严重影响了发酵工艺的控制 及发酵效果。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一 种应用于发酵中的菌株呼吸作用调节剂，同时能保证各种微量元素的恒量供应， 降低因有机碳氮源中微量元素不稳定造成的发酵问题，能有效提升发酵产量的 维生素B₁₂复合发酵助剂。

本发明所要解决的第二个技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一 种能保证各种微量元素的恒量供应，降低因有机碳氮源中微量元素不稳定造成 的发酵问题，能有效提升发酵产量的维生素B₁₂复合发酵助剂在维生素B₁₂发酵中 的应用方法。

为解决上述第一个技术问题，本发明的技术方案是：

一种维生素B₁₂复合发酵助剂，包含以下质量百分比的组分：90～98%的甜菜 碱、0.15～0.55%的复合维生素和1.45～9.85%的复合氨基酸；所述复合维生素 包含质量百分比30～55%的硫胺素、10～25%的盐酸吡哆醇和40～55%的叶酸； 所述复合氨基酸包含质量百分比5～10%的赖氨酸、10～15%的丝氨酸、10～15% 的谷氨酸、30～35%的天冬酰胺和30～40%的天冬氨酸。

优选的，所述甜菜碱包括无水甜菜碱、一水甜菜碱、盐酸盐甜菜碱、磷酸 盐甜菜碱、磺酸甜菜碱的一种或一种以上的混合物。

优选的，所述甜菜碱中残胺的含量为0.001～0.1wt%。

为解决上述第二个技术问题，本发明的技术方案是：

一种维生素B₁₂复合发酵助剂在维生素B₁₂发酵中的应用方法，包括以下步骤：

（1）种子培养：将种子培养基灭菌之后，接种入脱氮假单胞菌菌悬液，于 28～32℃、250～300rpm下振荡培养至种子液中菌体的光密度值（OD₇₀₀）达到10～ 15。

（2）发酵培养：将发酵培养基于115℃灭菌20分钟，将所述维生素B₁₂复 合发酵助剂按照1.0～2.0wt%的添加量加入到发酵培养基中，然后按照5～10% 的接种量接种入所述种子液，于28～32℃进行有氧发酵培养，搅拌或者震荡， 发酵过程中补加所述维生素B₁₂复合发酵助剂，维持甜菜碱的含量为0.15～ 0.35g/dl，发酵时间1～7天。

优选的，所述种子培养基配方为：蔗糖3.0～5.0g/dl、玉米浆1.0～ 3.0g/dl、硫酸铵0.1～0.2g/dl、磷酸氢二铵0.1～0.3g/dl、硫酸锰0.07～ 0.09g/dl、氯化钴0.001～0.003g/dl、氧化镁0.01～0.03g/dl、5,6～二甲基 苯并咪唑0.0005～0.0015g/dl、硫酸锌0.0005～0.0015g/dl和碳酸钙0.1～ 0.2g/dl，所述种子培养基的pH7.2～7.5。

优选的，所述发酵培养基配方为：蔗糖7.0～8.0g/dl、玉米浆6.0～7.0 g/dl、硫酸铵0.05～0.1g/dl、磷酸二氢钾0.04～0.07g/dl、氯化钴0.006～ 0.008g/dl、氧化镁0.04～0.05g/dl、5,6～二甲基苯并咪唑0.004～0.006g/dl、 硫酸锌0.005～0.008g/dl和碳酸钙0.05～0.12g/dl；所述发酵培养基的pH为 7.0～7.5。

优选的，所述甜菜碱包括无水甜菜碱、一水甜菜碱、盐酸盐甜菜碱、磷酸 盐甜菜碱、磺酸甜菜碱的一种或一种以上的混合物。

由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

本发明的维生素B₁₂复合发酵助剂包含90～98%的甜菜碱、0.15～0.55%的复 合维生素和1.45～9.85%的复合氨基酸；其中复合维生素包含质量百分比30～ 55%的硫胺素、10～25%的盐酸吡哆醇和40～55%的叶酸；复合氨基酸包含5～10% 的赖氨酸、10～15%的丝氨酸、10～15%的谷氨酸、30～35%的天冬酰胺和30～ 40%的天冬氨酸，甜菜碱作为一种生物碱，具有提供甲基的作用，另外，甜菜碱 可以调节胞内渗透压，提高微生物及相关代谢酶对恶劣环境的抗逆能力，此外， 甜菜碱能够提高细胞膜的通透性，促进营养物质及氧气在胞内外的交换，并有 助于发酵产物向外分泌，解决由胞内发酵产物浓度过高导致的反馈性抑制问题。 而复合发酵助剂中的各种复合维生素和复合氨基酸的微量营养因子添加物，满 足了发酵所需微量元素的恒定供应，解决了由于有机碳氮源中微量元素含量不 稳定导致的发酵产量低问题，极大的提高了发酵产量。

本发明在将维生素B₁₂复合发酵助剂应用到维生素B₁₂发酵过程中时，在发酵 过程中不断补加复合发酵助剂，保证了发酵过程中各种营养成分的供应，保证 了发酵效果，有效提高了维生素B₁₂的发酵产量。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。

实施例1

维生素B₁₂复合发酵助剂是由以下质量百分比的原料混合制备而成的：95% 的无水甜菜碱、0.55%的复合维生素和4.45%的复合氨基酸；其中复合维生素包 含质量百分比45%的硫胺素、10%的盐酸吡哆醇和45%的叶酸；其中复合氨基酸 包含质量百分比5%的赖氨酸、15%的丝氨酸、15%的谷氨酸、35%的天冬酰胺和 30%的天冬氨酸。所述甜菜碱中残胺的含量为0.01wt%。

实施例2

维生素B₁₂复合发酵助剂是由以下质量百分比的原料混合制备而成的：93% 的盐酸盐甜菜碱、0.5%的复合维生素和6.5%的复合氨基酸；其中复合维生素包 含质量百分比35%的硫胺素、15%的盐酸吡哆醇和50%的叶酸；其中复合氨基酸 包含质量百分比10%的赖氨酸、10%的丝氨酸、15%的谷氨酸、30%的天冬酰胺和 35%的天冬氨酸。所述甜菜碱中残胺的含量为0.001wt%。

实施例3

维生素B₁₂复合发酵助剂是由以下质量百分比的原料混合制备而成的：96% 的磷酸盐甜菜碱、0.15%的复合维生素和3.85％的复合氨基酸；其中复合维生素 包含质量百分比50%的硫胺素、10%的盐酸吡哆醇和40%的叶酸；其中复合氨基 酸包含质量百分比5%的赖氨酸、15%的丝氨酸、10%的谷氨酸、32%的天冬酰胺 和38%的天冬氨酸。所述甜菜碱中残胺的含量为0.05wt%。

实施例4

维生素B₁₂复合发酵助剂是由以下质量百分比的原料混合制备而成的：97% 的无水甜菜碱和一水甜菜碱、0.2%的复合维生素和2.8%的复合氨基酸；其中复 合维生素包含质量百分比45%的硫胺素、15%的盐酸吡哆醇和40%的叶酸；其中 复合氨基酸包含质量百分比8%的赖氨酸、12%的丝氨酸、12%的谷氨酸、33%的 天冬酰胺和35%的天冬氨酸。

实施例5

在500ml的摇瓶中进行种子培养，装液量100ml。种子培养基配方为：蔗糖 3.0g、玉米浆3.0g、硫酸铵0.1g、磷酸氢二铵0.3g、硫酸锰0.07g氯化钴0.003g、 氧化镁0.01g、5,6～二甲基苯并咪唑0.0015g、硫酸锌0.0005g和碳酸钙0.2g， 种子培养基的pH7.2，于115℃灭菌20分钟后，接入1ml脱氮假单胞菌菌悬液， 于32℃、250rpm下振荡培养至种子液中菌体光密度值（OD₇₀₀）达到10～15。

在1000ml的摇瓶中进行发酵培养，发酵培养基装液量100ml。发酵培养基 配方为：蔗糖7.0g、玉米浆7.0g、硫酸铵0.05g、磷酸二氢钾0.07g、氯化钴 0.006g、氧化镁0.05g、5,6～二甲基苯并咪唑0.006g、硫酸锌0.005g和碳酸 钙0.12g，所述发酵培养基的pH为7.0。将发酵培养基于115℃灭菌20分钟， 将实施例1制备经微滤除菌的维生素B₁₂复合发酵助剂按照1.0wt%的添加量加入 到发酵培养基中，然后按照5%的接种量接种入培养好的种子液，于32℃、250rpm 进行振荡、有氧发酵培养，发酵过程中每个摇瓶分别在第72、96和120小时补 加0.2%的维生素B₁₂复合发酵助剂，维持甜菜碱的含量为0.15～0.35g/dl。

培养周期为168h，定时取样。对比例为只在发酵过程中添加50wt%含量的 液态无水甜菜碱。实施例跟对比例分别做5个平行样。最终的发酵情况见表1。

表1

实施例6

在500ml的摇瓶中进行种子培养，装液量100ml。种子培养基配方为：蔗糖 5.0g、玉米浆1.0g、硫酸铵0.2g、磷酸氢二铵0.1g、硫酸锰0.09g氯化钴0.001g、 氧化镁0.03g、5,6～二甲基苯并咪唑0.0005g、硫酸锌0.0015g和碳酸钙0.1g， 种子培养基的pH7.5，于115℃灭菌20分钟后，接入1ml脱氮假单胞菌菌悬液， 于30℃、250rpm下振荡培养至种子液中菌体光密度值（OD₇₀₀）达到10～15。

在1000ml的摇瓶中进行发酵培养，发酵培养基装液量100ml。发酵培养基 配方为：蔗糖8.0g、玉米浆6.0g、硫酸铵0.1g、磷酸二氢钾0.04g、氯化钴 0.008g、氧化镁0.04g、5,6～二甲基苯并咪唑0.006g、硫酸锌0.005g和碳酸 钙0.12g，所述发酵培养基的pH为7.5。将发酵培养基于115℃灭菌20分钟， 将实施例2制备经微滤除菌的维生素B₁₂复合发酵助剂按照2.0wt%的添加量加入 到发酵培养基中，然后按照10%的接种量接种入培养好的种子液，于30℃、 250rpm进行振荡、有氧发酵培养，发酵过程中每个摇瓶分别在第72、96和120 小时补加0.3%的维生素B₁₂复合发酵助剂，维持甜菜碱的含量为0.15～ 0.35g/dl。

培养周期为166h，定时取样。对比例为只在发酵过程中添加50wt%含量的 液态盐酸盐甜菜碱。实施例和对比例分别做5个平行样。最终的发酵情况见表 2。

表2

实施例7

在500ml的摇瓶中进行种子培养，装液量100ml。种子培养基配方为：蔗糖 4.0g、玉米浆2.0g、硫酸铵0.15g、磷酸氢二铵0.2g、硫酸锰0.08g氯化钴 0.002g、氧化镁0.02g、5,6～二甲基苯并咪唑0.001g、硫酸锌0.001g和碳酸 钙0.15g，种子培养基的pH7.3，于115℃灭菌20分钟后，接入1ml脱氮假单胞 菌菌悬液，于32℃、250rpm下振荡培养至种子液中菌体光密度值（OD₇₀₀）达到 10～15。

在1000ml的摇瓶中进行发酵培养，发酵培养基装液量100ml。发酵培养基 配方为：蔗糖7.5g、玉米浆6.5g、硫酸铵0.02g、磷酸二氢钾0.06g、氯化钴 0.007g、氧化镁0.045g、5,6～二甲基苯并咪唑0.005g、硫酸锌0.006g和碳酸 钙0.1g，所述发酵培养基的pH为7.3。将发酵培养基于115℃灭菌20分钟，将 实施例3制备的经微滤除菌的维生素B₁₂复合发酵助剂按照1.5wt%的添加量加入 到发酵培养基中，然后按照8%的接种量接种入培养好的种子液，于32℃、250rpm 进行振荡、有氧发酵培养，发酵过程中持续补加维生素B₁₂复合发酵助剂，维持 甜菜碱的含量为0.15～0.35g/dl。

培养周期为168h，发酵结束，维生素B₁₂的发酵效价为189mg/L。

实施例8

将种子培养基于115℃灭菌20分钟后，接入脱氮假单胞菌菌悬液，于32℃ 振荡培养至种子液中菌体的光密度值（OD₇₀₀）达到10～15。

将发酵培养基于115℃灭菌20分钟，将实施例4制备的经微滤除菌的维生 素B₁₂复合发酵助剂按照1.8wt%的添加量加入到发酵培养基中，然后按照7%的接 种量接种入培养好的种子液，于32℃进行振荡、有氧发酵培养，发酵过程中依 据甜菜碱的量持续补加维生素B₁₂复合发酵助剂，维持甜菜碱的含量为0.15～ 0.35g/dl。

培养周期为168h，维生素B₁₂的发酵效价为195mg/L。