一种分离水牛奶中酪蛋白组分的方法

摘要

一种分离水牛奶中酪蛋白组分的方法，以水牛奶为原料，采用等电点缓慢酸沉，再结合分级钙沉的方法对水牛奶中αs-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白三种酪蛋白组分进行了分离。分级钙沉酪蛋白各组分的总回收率达到88%，其中分离后的αs-酪蛋白和β-酪蛋白的质量分数分别达到91.6%和67.8%，κ-酪蛋白的质量分数也由13.8%提高至43.3%，为进一步纯化奠定了基础。同时在理论上，若采用二次分级钙沉的技术路线可将β-酪蛋白的质量分数提高至100%。该方法操作简单，分离效果明显，适宜工业化生产。

说明书

技术领域

本发明涉及一种分离水牛奶中酪蛋白组分的方法，尤其是一种通过简 单工艺同时将αs-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白分离的方法。

背景技术

水牛奶中乳蛋白主要由酪蛋白和乳清蛋白组成，其中以杂交高代为例 ，α_s1-酪蛋白、α_s2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白分别占酪蛋白的 35.30%、16.97%、33.88%、13.85%，α-乳清蛋白、β-乳球蛋白分别 占乳清蛋白的30.95%、48.49%。酪蛋白以酪蛋白胶束结合磷酸钙形成 的复合体形式存在，称为“酪蛋白酸钙-磷酸钙复合体”（Ca-phosph ocaseinate或Ca-caseinate-phosphhate-complate）。

近几十年来，为了研究酪蛋白胶束体系的稳定机制，以及各酪蛋白组 分的结构功能特性，分离纯化酪蛋白组分是开展上述研究的基础，分 离纯化的效率和质量直接关系后续多项工作的成败，因此成为研究的 热点。目前酪蛋白组分的分离方法主要包括沉淀分离、层析分离、膜 分离以及酶法分离等，其中，层析分离主要用于实验室规模，而膜分 离以及酶法分离一般都需要结合其他方法共同完成分离步骤，应用最 为广泛的是沉淀分离，主要是利用各酪蛋白组分在不同温度、离子强 度，钙浓度的溶液中溶解性的不同进行分离，分离过程主要关注目标 产物的得率以及纯度，但对其分离过程的系统研究较少。

发明内容

本发明的目的是提供一种分离水牛奶中酪蛋白组分的方法，能够同时 分离αs-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白，并且操作简单，分离效果 明显，适宜工业化生产。

本发明的目的通过以下技术方案实现：一种分离水牛奶中酪蛋白组分 的方法，包括以下步骤：

①新鲜水牛奶，于8000g、4℃下离心脱脂20～30min后，采用等电点缓 慢酸沉的方法，用酸溶液缓慢调节脱脂后牛奶的pH至4.5~4.7，于800 0g、4℃下离心20～30min保留沉淀，蒸馏水洗涤2次，即得到粗制酪蛋 白粉末，冻干备用；

②将等电点缓慢酸沉，冻干后得到的酪蛋白粉末配制成2%的酪蛋白溶 液，采用碱溶液 缓慢调节酪蛋白溶液的pH至7.0~7.5；

③按照0.06mol的Ca²⁺浓度在步骤②酪蛋白溶液中加入二价可溶性钙盐 ，在8000g下离心20～30min，保留上清液和沉淀，将沉淀溶于乙二胺 四乙酸二钠溶液中，透析后冻干即获得质量分数达91.6%的α_s-酪蛋白 ；

④在步骤③离心保留的上清液中继续加入二价可溶性钙盐，使Ca²⁺浓度 终浓度到达0.3mol，再次离心，保留上清液和沉淀，上清液透析冻干 后获得质量分数达43.3%的κ-酪蛋白，将沉淀溶于乙二胺四乙酸二钠 溶液中，透析后冻干即获得质量分数达100%的β-酪蛋白。

所述酪蛋白为水牛奶及水牛奶制品的酪蛋白。

所述水牛奶为摩拉纯种水牛奶、摩拉杂交一代水牛奶、摩拉杂交高代 水牛奶；所述水牛奶制品为水牛奶酸乳、水牛奶干酪、水牛奶乳粉。

所述二价可溶性钙盐为氯化钙。

所述乙二胺四乙酸二钠溶液为乙二胺四乙酸二钠配制成0.06～0.3mol 溶液。

所述酸溶液为冰乙酸或盐酸配制成0.05～0.1mol溶液。

所述碱溶液为氢氧化钠或氨水配制成0.1～0.2mol溶液。

本发明具有以下优点：

1.本发明采用分级钙沉对αs-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白三种酪 蛋白组分进行了同步分离，操作工艺简单，为较大规模分离酪蛋白组 分提供一种简单可行的方法，一方面为实验室制备样品提供了参考， 同时对大规模工业化制备也具有一定的借鉴意义，为后续工业应用提 供了便利。

2.本发明制取的αs-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白纯度高，为试剂 型αs-酪蛋白、β-酪蛋白的生产提供了方法，同时该工艺采用的试剂 很少，节约了制备成本。

3.本发明制取的αs-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白得率均较高，能 够有效利用资源。

附图说明

图1 为等电点缓慢酸沉后得到的酪蛋白电泳图。

1-低分子量蛋白标品 2-脱脂后的水牛奶全蛋白 3-等电点缓慢酸除 去酪蛋白后的乳清蛋白 4-等电点缓慢酸沉得到的酪蛋白，上样浓度 均稀释至1000μg/mL,上样量10μL。

图2 为分级钙沉后得到的酪蛋白电泳图。

1-低分子量蛋白标品，2-、3- 、4-、5-、6-、7-分别为0.30mol、0 .25mol、 0.20mol、0.15mol、0.10mol、0.06molCa²⁺处理酪蛋白后沉 淀溶解液，8-、9- 、10-、11-、12-、13-分别为0.30mol、0.25mol 、0.20mol、0.15mol、0.10mol、0.06mol Ca²⁺处理酪蛋白后上清液， 上样浓度均稀释 至1000μg/mL,上样量10μL。

图3 为采用考马斯亮蓝法得到的蛋白质含量标准曲线。

具体实施方式

下面通过实验对酪蛋白组分的分离效果进行评价。

1、等电点缓慢酸沉粗分酪蛋白效果的评价

为了评价等电点缓慢酸沉后酪蛋白的纯度，我们采用SDS-PAGE对脱脂 后牛乳中的蛋白组成及等电点缓慢酸沉后沉淀及上清液中的蛋白组成 进行了对比分析。结果见图1。

由图1可知，图1中泳道2的全蛋白经等电点缓慢酸沉后，基本上可以将 水牛奶中的牛血清蛋白及乳清蛋白全部除去，得到如图1中泳道4的粗 酪蛋白，而牛血清蛋白和乳清蛋白等杂质留在酸沉酪蛋白后的如图1中 泳道3的酸乳清中。该方法操作简单，分离效果良好，适宜规模化生产 。

2、分级钙沉酪蛋白组分效果的评价

为了评价各种钙盐浓度下酪蛋白组分的分离情况，我们采用SDS-PAGE 和考马斯亮蓝法对0.06mol、0.10mol、0.15mol、0.20mol、0.25mol、 0.30molCa²⁺处理后的酪蛋白组分进行了纯度和得率分析。结果见图2、 图3和表1。

从图2中可以看出，Ca²⁺浓度达到0.06mol时，酪蛋白中的α_s-酪蛋白已 完全沉淀，并有β-酪蛋白也同时发生沉淀，且沉淀物中除了以上两种 酪蛋白组分外，牛血清蛋白也发生完全沉淀。同时，在0.06mol-0.30 mol Ca²⁺浓度处理酪蛋白沉淀溶解液的电泳条带中，0.06molCa²⁺浓度 出现微弱的κ-酪蛋白条带，随着Ca²⁺浓度不断加大，κ-酪蛋白条带反 而不断减弱，尤其是当Ca²⁺浓度达到0.20mol时，κ-酪蛋白条带几乎消 失。在0.06mol-0.30molCa²⁺浓度处理酪蛋白的上清液中，主要含有β -酪蛋白和κ-酪蛋白两条带，且随着Ca²⁺浓度的逐渐增大，β-酪蛋白 条带逐渐减弱，与考马斯亮蓝测定上清液中蛋白质含量变化趋势相一 致。根据以上现象，可以判断，通过Ca²⁺沉淀酪蛋白三种组分的先后次 序为：αs-酪蛋白最先钙沉，其次是β-酪蛋白，最后是κ-酪蛋白。 由图2还可看出，κ-酪蛋白在极低的0.06mol Ca²⁺浓度存在条件下， 开始发生沉淀，随Ca²⁺浓度的不断增大，κ-酪蛋白反而溶解，不再沉 淀析出。这与α_s-酪蛋白遇钙沉淀，引起κ-酪蛋白的交联沉淀有关。 在Ca²⁺处理后酪蛋白上清液的所有条带中均不含有牛血清蛋白，而都含 有条带很弱的β-乳球蛋白、α-乳白蛋白，说明牛血清蛋白对Ca²⁺非常 敏感，很低的浓度即发生沉淀，而β-乳球蛋白和α-乳白蛋白对Ca²⁺却 有一定的耐受能力。

表1 各等级钙沉组分中酪蛋白的质量

根据表1，可以明显看出，在0.06mol-0.30mol Ca²⁺浓度处理酪蛋白的 上清液中，蛋白质质量逐步减少，结合电泳图谱，该过程上清液中主 要组分为β-酪蛋白和κ-酪蛋白，而沉淀中κ-酪蛋白析出量小，说明 该过程主要发生β-酪蛋白的沉淀反应。据此可以提出一种简单分离β -酪蛋白的方法——二次钙沉法：即先采用0.06mol Ca²⁺浓度处理酪蛋 白，离心弃沉淀，即弃去α_s-酪蛋白，保留上清液，添加二价可溶性 钙盐，使Ca²⁺终浓度达到0.3mol，再次离心，保留沉淀，将沉淀溶入乙 二胺四乙酸二钠溶液中，搅拌使其充分溶解，透析后即可得到质量分 数达100%的β-酪蛋白。

为了进一步评价各钙盐浓度处理酪蛋白后，各酪蛋白组分中的αs-酪 蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白的质量分数，我们采用以下计算方法对 其进行估算：

如果忽略沉淀中的牛血清蛋白和κ-酪蛋白以及上清液中的乳清蛋白， 根据α_s-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白在水牛奶中的比例3.77:2.4 5:1，结合分级钙沉酪蛋白总回收率，可以估算沉淀以及上清液中各种 酪蛋白组分质量分数比例，以沉淀中αs-酪蛋白的质量分数为例：

A₁=B₁×B₂×B₃

式中：A₁为沉淀中αs-酪蛋白质量；B₁为酪蛋白总质量；B₂为酪蛋白 总回收率；B₃为理论上酪蛋白中αs-酪蛋白所占的质量分数。

$A/\%=\frac{A_1}{A_2}\times 100$

式中：A为沉淀中αs-酪蛋白质量分数；A₁为沉淀中αs-酪蛋白质量； A₂为沉淀质量。

计算结果见表2：

表2 各等级钙沉组分中α_s-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白质量分数

根据表2，在0.06mol-0.30mol Ca²⁺浓度范围内，沉淀中α_s-酪蛋白的 质量分数由91.6%降至76.8%，上清液中β-酪蛋白的质量分数由67.8% 降至56.7%，κ-酪蛋白的质量分数由32.2%提升至43.3%。

实施例1

取1.00kg摩拉纯种水牛奶，于8000g、4℃下离心脱脂30min后，采用0 .1mol冰乙酸缓慢调节脱脂后牛奶pH至4.5~4.7，于8000g、4℃下离心 20min后保留沉淀，冻干即得到粗酪蛋白冻干粉。将酪蛋白样品配制成 2%的蛋白溶液，用0.1mol氢氧化钠溶液缓慢调节酪蛋白溶液的pH至7. 0~7.5，按照0.06mol的比例加入二价可溶性钙盐，离心保留上清液和 沉淀，将沉淀溶于0.06mol乙二胺四乙酸二钠溶液中，透析后冻干即获 得质量分数达91.6%的αs-酪蛋白；在上清中继续加入二价可溶性钙盐 ，使其浓度达到0.3mol，再次离心，保留上清液和沉淀。将沉淀溶于 0.30mol乙二胺四乙酸二钠溶液中，透析后冻干即获得质量分数达100 %的β-酪蛋白；保留的上清液透析后冻干即获得质量分数达43.3%的κ -酪蛋白；

实施例2

取1.00kg摩拉杂交一代水牛奶，于8000g、4℃下离心脱脂30min后，采 用0.05mol盐酸缓慢调节脱脂后牛奶pH至4.5~4.7，于8000g、4℃下离 心30min保留沉淀，冻干即得到粗酪蛋白冻干粉。将酪蛋白样品配制成 2%的蛋白溶液，用0.1mol氢氧化钠溶液缓慢调节酪蛋白溶液的pH至7. 0~7.5，按照0.06mol的比例加入二价可溶性钙盐，离心保留上清液和 沉淀，将沉淀溶于0.06mol乙二胺四乙酸二钠溶液中，透析后冻干即获 得质量分数达91.6%的αs-酪蛋白；在上清中继续加入二价可溶性钙盐 ，使其浓度达到0.3mol，再次离心，保留上清液和沉淀。将沉淀溶于 0.25mol乙二胺四乙酸二钠溶液中，透析后冻干即获得质量分数达100 %的β-酪蛋白；保留的上清液透析后冻干即获得质量分数达43.3%的κ -酪蛋白；

实施例3

取1.00kg摩拉杂交高代水牛奶，于8000g、4℃下离心脱脂20min后，采 用0.1mol冰乙酸缓慢调节脱脂后牛奶pH至4.5~4.7，于8000g、4℃下离 心30min保留沉淀，冻干即得到粗酪蛋白冻干粉。将酪蛋白样品配制成 2%的蛋白溶液，用0.2mol氨水溶液缓慢调节酪蛋白溶液的pH至7.0~7. 5，按照0.06mol的比例加入二价可溶性钙盐，离心保留上清液和沉淀 ，将沉淀溶于0.06mol乙二胺四乙酸二钠溶液中，透析后冻干即获得质 量分数达91.6%的αs-酪蛋白；在上清中继续加入二价可溶性钙盐，使 其浓度达到0.3mol，再次离心，保留上清液和沉淀。将沉淀溶于0.20 mol乙二胺四乙酸二钠溶液中，透析后冻干即获得质量分数达100%的β -酪蛋白；保留的上清液透析后冻干即获得质量分数达43.3%的κ-酪蛋 白；