肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的特异性检测用引物探针组合和试剂盒

摘要

本发明涉及一种采用荧光PCR技术，特异性检测样品中肺炎链球菌和流感嗜血杆菌核酸存在的寡核苷酸序列组合，以及包括该组合的试剂盒。该试剂盒能够灵敏地检测并鉴别样品中存在的肺炎链球菌核酸和流感嗜血杆菌核酸，其检测下限均为20拷贝每反应体系，在疾病监测、临床诊断等领域具有重要的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种采用荧光PCR技术，特异性检测样品中肺炎链球菌和流感嗜血杆菌核酸存在的寡核苷酸序列组合，以及包括该组合的试剂盒。 

技术背景

细菌性肺炎的病原体因宿主年龄、伴随疾病与免疫功能状态有较大差异。就获得方式而言，社区获得性肺炎病原体中常见的为肺炎链球菌和流感嗜血杆菌。 

肺炎链球菌是革兰阳性球菌，是引起细菌性肺炎的最主要病原体，约占其2/3左右，全年均可发病，冬春季高发。流感嗜血杆菌是革兰阴性小杆菌，在4-18月龄的儿童中高发，可以引起细菌性肺炎和细菌性脑膜炎。根据WTO统计数据，每年有超过30万人死于流感嗜血杆菌引起的肺炎和脑膜炎。肺炎链球菌的实验室诊断主要依靠病原菌培养。传统的检测法需要培养分离出菌株之后才能鉴定，需要时间较长。且流感嗜血杆菌生长条件苛刻，营养要求很高，费时费力，不利于快速检测，并对于操作人员来说具备一定的危险性。近年来针对病原体的PCR反应快速检测技术开始出现。对于PCR检测来说，引物的选择至关重要，直接影响检测的特异性。如果引物特异性不够，则可能导致检测的假阳性结果或者假阴性结果的出现。 

对于肺炎患者呼吸道分泌物中肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的检测是查明病因的重要步骤，对于临床诊断和治疗药物选择具有重要意义。 

本发明针对肺炎链球菌和流感嗜血杆菌特异的靶序列设计引物和 Taqman探针，利用real-time PCR的方法，用来鉴别检测样品中肺炎链球菌和流感嗜血杆菌核酸，可以快速获得特异性检测结果。 

发明内容

为了更加准确地检测样品肺炎链球菌和流感嗜血杆菌核酸存在，本发明提供一种特异性检测样品中肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的寡核苷酸序列组合和包含该组合的试剂盒，其特征在于序列组合或试剂盒的PCR反应液中用于核酸扩增的引物为： 

P1：5`-AGTCGTTCCAAGGTAACAAGT-3`， 

P2：5`-CACGCACCGACTACCTAAACC-3`， 

P3：5`-TGCAACTCCAGCTGCTAAAGTATT-3`， 

P4：5`-TCTTCACCGTAAGATACTGTGCC-3`。 

P1和P2为针对肺炎链球菌基因组特异性序列设计并经预实验筛选出的特异性引物，P3和P4为针对流感嗜血杆菌基因组特异性序列设计并经预实验筛选出的特异性引物。 

本发明的特征还在于，序列组合或试剂盒的PCR反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针为： 

Probe1：5`-X<sub>1</sub>-GATCAGATTGAAGCTGATAAAACGATACA-Y<sub>1</sub>-3`， 

Probe2：5`-X<sub>2</sub>-TAGGTCAACGTCGTGCAGATGCAGTT-Y<sub>2</sub>-3`。 

X₁和X₂为荧光报告基团，Y₁和Y₂为荧光淬灭基团。Probe1为针对肺炎链球菌基因组特异性序列设计并经预实验筛选出的特异性探针，Probe2为针对流感嗜血杆菌基因组特异性序列设计并经预实验筛选出的特异性探针。 

本发明的特征还在于，试剂盒包括PCR反应液、酶混合液、阴性质控品和阳性质控品。其中PCR反应液主要含有上述的引物和探针、反应缓冲液、Mg²⁺和dNTP等，酶混合液主要含有热启动Taq酶，阴性质控品为去离子水，阳性质控品为含有检测靶序列的核酸。 

本发明的另一优选实施方案为：序列组合或试剂盒的PCR反应液中用于荧 光信号监测的寡核苷酸探针的荧光基团分，其中Probe1荧光报告基团X₁为Fam，荧光淬灭基团Y₁为Eclipse，Probe2荧光报告基团X₂为Hex，荧光淬灭基团Y₂为Eclipse。 

本发明的另一优选实施方案为：试剂盒的包含上述两对特异性引物和两条特异性探针，属于实时荧光双重PCR检测，可在同一个反应体系中对肺炎链球菌和流感嗜血杆菌核酸进行检测和鉴别。 

本发明的另一优选实施方案为：试剂盒的PCR反应循环参数为95℃，2min；进入循环阶段：95℃变性10s，60℃退火延伸1min，共反应40个循环。 

本发明的另一优选实施方案，试剂盒选用的PCR反应体系为20μl，包括2×PCR缓冲液10μl、10mmol/L dNTP 1.0μl、25μmol/L引物各0.5μl、10μmol/L探针各0.2μl、热启动Taq酶混合液0.2μl、样品DNA 2μl，加灭菌水至终体系20μl。 

本发明提供的试剂盒对肺炎链球菌核酸的检测下限为20个拷贝每反应体系；对流感嗜血杆菌核酸的检测下限为20个拷贝每反应体系。 

本发明分别根据肺炎链球菌或流感嗜血杆菌基因组保守区分别设计特异性引物和探针，提供的试剂盒可以检出肺炎链球菌或流感嗜血杆菌的核酸，但不能检出非肺炎链球菌或流感嗜血杆菌病原体的核酸，说明试剂盒具有很好的特异性。 

本发明提供的试剂盒3小时内即可完成检测，双重检测可节省50％的检测费用，可为肺炎链球菌或流感嗜血杆菌的疾病监测和临床诊断提供实验依据。 

附图说明

图1为双重实时荧光PCR检测肺炎链球菌核酸灵敏度的扩增曲线图。从左至右的5条曲线分别为肺炎链球菌特异性PCR片段构建质粒梯度稀释(10⁵-10¹)后扩增结果。横坐标为反应循环数，纵坐标为不同循环数荧光检测信号的ΔRn值。 

图2为双重实时荧光PCR检测流感嗜血杆菌核酸灵敏度的扩增曲线图。从左至右的5条曲线分别为流感嗜血杆菌特异性PCR片段构建质粒梯度稀释(10⁵-10¹)后扩增结果。横坐标为反应循环数，纵坐标为不同循环数荧光检测信号的ΔRn值。 

图3为实时荧光双重PCR检测体系对肺炎链球菌和流感嗜血杆菌核酸检测特异性扩增曲线图。肺炎链球菌和流感嗜血杆菌均出现S型扩增曲线，而其他病原微生物质控菌均未出现S型扩增曲线。横坐标为反应循环数，纵坐标为不同循环数荧光检测信号的ΔRn值。 

具体实施方式

下面结合具体实施例详细说明本发明的优选实施方式。需要指出的是，这里列出的实施例仅仅为示例性说明的目的，而不应将其解释为对本发明范围的任何限制。其中使用的试剂盒、缓冲液等试剂仅仅为该具体实施例中具体选择的试剂，应理解，本领域技术人员可根据需要选择其他公司的相应试剂以实现本发明的目的。 

1、引物和TaqMan探针的设计与合成 

利用Blast工具对Genbank和国内外文献中的所有的肺炎链球菌和流感嗜血杆菌基因组序列进行分析，分别选择其稳定的保守区域作为检测靶序列，并针对这两个检测靶序列设计和合成多套引物和探针(见表1)。引物和探针均由日本TaKaRa大连宝生物公司合成，其中肺炎链球菌的检测探针5’端标记FAM荧光基团，3’端标记Eclipse荧光淬灭基团，流感嗜血杆菌的检测探针5’端标记Hex荧光基团，3’端标记Eclipse荧光淬灭基团。 

2、检测菌种的准备 

本实施例中所使用的肺炎链球菌、流感嗜血杆菌以及其他阴性对照菌株(百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌、A群脑膜炎奈瑟氏菌、B群脑膜炎奈瑟氏菌、C群脑膜炎奈瑟氏菌、肺炎支原体、嗜肺军团菌、肺炎衣原体和卡他莫拉菌)均购买于中国药品生物制品检定所。 

3、菌株DNA的抽提 

选用Qiagen公司QIAamp DNA Mini Kit(货号：51306)提取菌株DNA。具体步骤试剂盒参考操作说明书。 

4、引物和探针的筛选 

采用设计的多套引物和探针分别检测提取的肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和阴性对照菌株细菌的基因组DNA，经反复实验，筛选出灵敏度、特异性和重复性最佳的引物探针组合。(见序列表，肺炎链球菌正向引物p1、反向引物p2和探针probe1；流感嗜血杆菌正向引物p3、反向引物p4和探针probe2) 

5、标准品的构建与制备 

分别利用p1、p2和p3、p4引物，PCR扩增肺炎链球菌和流感嗜血杆菌特异性基因片段，将PCR产物克隆至pMD-18T载体，转化DH5α大肠杆菌，利用碱裂解法提取阳性克隆质粒，利用紫外可见分光光度计分别测定在波长260nm处、280nm处DNA的吸光率，然后计算质粒浓度与纯度。然后10倍梯度稀释至10个拷贝每微升。 

6、反应条件优化 

对引物、探针、酶等要素逐一优化，确定的反应体系为：2×PCR缓冲液10μl、10mmol/L dNTP 1.0μl、25μmol/L引物各0.5μl、10μmol/L探针各0.2μl、热启动Taq酶0.2μl、模板2ul，加灭菌水至终体系20μl。 

根据扩增片段长、引物和探针的退火温度以及酶的特性，主要对反应退火温度和延伸时间进行了优化，最终确定的循环参数为：预变性95℃，2min；扩增和检测：95℃变性10s，60℃退火延伸1min，40个循环，每个循环在退火及延伸阶段采集荧光信号。 

在扩增结束后按同一条件分析数据，确定各样品的Ct值。 

7、检测限的评价 

以上述5中的阳性标准品评价本发明的提供的试剂盒的检测限，阳性标准品浓度为：1×10⁵copies/μl，1×10⁴copies/μl，1×10³copies/μl，1× 10²copies/μl，1×10⁵copies/μl，1×10⁵copies/μl，本发明提供的试剂盒对肺炎链球菌核酸的检测下限为20个拷贝每反应体系；对流感嗜血杆菌核酸的检测下限均为20个拷贝每反应体系。 

8、检测特异性的评价 

以上述2中的菌株DNA为模板评价了本试剂盒的特异性。对肺炎链球菌和流感嗜血杆菌DNA进行检测时均可见明确的扩增曲线，对上述9种其他咽部常见病原微生物DNA检测时，未产生阳性扩增曲线，说明我们使用的探针和引物与我们选定的其他菌株之间不存在交叉反应。 

尽管上文中以优选的方式，通过具体实施例示例性说明了本发明的某些实施方式，但是本领域技术人员应了解，本发明并不限于上面所公开的实施方式，而是可以根据本发明所属技术领域的知识对其进行修改，所作修改不会超出本发明要求保护的范围。例如，本发明所使用的荧光实时PCR也可以根据需要采用说明书中所列出的实施例中指出的荧光基团和荧光淬灭基团以外的标记物质，如Tet、FAM、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、TxRd、JOE等标记物；或使用Taqman技术之外的其他标记体系，例如MGB探针、分子信标MB探针、蝎形探针、荧光双杂交探针等荧光探针标记技术；或使用染料嵌合法如SYBR Green I等不饱和染料与LC Green等饱和染料，只要其使用了本发明所述的特异性引物序列，即可定性或定量检测目的基因的存在，进而特异性地检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的存在。所以，这些本领域技术人员所了解的改变和惯用手段的替换也落入本发明的保护范围内。本发明的保护范围应由所附的权利要求书所限定。