一种番茄青枯病拮抗菌及其应用

摘要

本发明公开了一种番茄青枯病拮抗菌，它的16SrRNA具有SEQIDNo.1所示的基因序列；本发明分离筛选出的番茄青枯病拮抗菌能够有效地防治番茄青枯病，对减少大量化肥、农药的使用，减轻农业面源污染具有重要的作用。

说明书

技术领域

本发明涉及番茄青枯病生防领域，尤其涉及一株番茄青枯病拮抗菌及其应用。 

背景技术

番茄青枯病是由茄青枯拉尔氏菌[Ralatonia solanacearum (smith) Yabuuchi et al]引起的世界范围内的毁灭性土传病害，热带、亚热带的国家和地区，如：南美洲、日本、印度、菲律宾，我国台湾、广东、浙江、福建、江苏、湖北、四川、重庆等都有严重发生。该病可造成植株大面积萎蔫死亡，一般田块发病率为10%～15%，重病田发病率高达80%～98.5%，导致番茄产量严重下降，造成重大的经济损失。 

R. solanacearum 是一种土壤习居菌，能够在无寄主情况下的土壤中存活很长时间。R. solanacearum主要从根系侵入植株，也可从茎部伤口侵入并直接进入导管系统，在其中大量繁殖并产生代谢物质，阻碍植物体内水分运输，造成植株萎蔫。目前，针对番茄青枯病缺少有效的化学药剂，加之青枯菌对化学农药易产生抗药性，而且大量使用化学农药会造成环境污染和生产成本上升。休耕期撒施石灰可减轻病害发生，但易造成土壤板结。抗病育种工作，由于缺乏理想的抗源材料，进展缓慢。水旱轮作要求轮作年限长，且附近无其它宿主存在方可起到良好效果，因而实施起来较困难。土壤灭菌后形成了土壤生物真空，一旦土壤受到病原菌侵染，会导致病原菌的大爆发而造成更为严重后果。生物防治作物病害具有可利用资源丰富、成本低廉、能够避免环境二次污染，被认为是解决土传病害一条有希望的途径。利用病原菌拮抗微生物进行生物防治是生物防治的一个重要组成部分。 

发明内容

本发明目的在于针对番茄青枯病缺少有效的化学药剂，加之青枯菌对化学农药易产生抗药性的不足，提供一种番茄青枯病拮抗菌及其应用。 

本发明目的通过以下技术方案来实现：一种番茄青枯病拮抗菌，它的16S rRNA具有SEQ ID No.1所示的基因序列；该番茄青枯病拮抗菌保存在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存编号为：CGMCC No.3332。 

上述番茄青枯病拮抗菌在防治番茄青枯病方面的应用。 

本发明的有益效果是，本发明分离筛选出的番茄青枯病拮抗菌能够有效地防治番茄青枯病，对减少大量化肥、农药的使用，减轻农业面源污染具有重要的作用。 

本发明的番茄青枯病拮抗菌④-37已在中国专利局指定的保藏单位“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏单位地址为：北京市朝阳区大屯路；保藏日期为2009年10月9日，保藏编号为：CGMCC No.3332；分类命名为：蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。 

附图说明

    图1为番茄青枯病生防效果图。  

具体实施方式

从浙江嘉善、丽水、杭州等番茄种植基地采集21个土样，利用牛肉膏蛋白胨培养基进行分离，共分离到细菌420多株；然后进行平板拮抗试验，得到对番茄青枯病茄青枯拉尔氏菌有较好拮抗效果初筛细菌27株；通过盆栽试验，进一步筛得对番茄青枯病茄青枯拉尔氏菌具有相对稳定的拮抗效果复筛细菌4株。该菌株④-37为其中一株细菌。根据菌株的形态特征、培养特征和生理生化特征，参照伯杰氏细菌鉴定手册，对该菌株④-37进行鉴定，初步确认为蜡状芽孢杆菌，该菌株取样来自浙江丽水。 

保藏菌株的形态、培养、生理、生化等特征： 

蜡状芽孢杆菌④-37：属蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）；在牛肉膏蛋白胨培养基中生长良好，细胞杆状；在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上培养时菌落表面湿润、光滑、边缘整齐且规则、圆形，菌苔厚、不透明、白色。菌株④-37理化试验结果见下表：

经测定，菌株④-37的16S rRNA的基因序列如SEQ ID No.1所示。

通过以下实施例对本发明作更详细说明，但以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施例的限制。 

对所涉材料的说明： 

蛋白胨：生化制剂，国产；

牛肉膏：生化制剂，国产；

Yeast extract (酵母浸膏):生化试剂，国产；

Casein hydrolysate (酪蛋白水解物): 生化试剂，国产；

琼脂: 生化试剂，国产；

NaCl：分析纯，国产

K₂HPO₄：分析纯，国产；

葡萄糖：分析纯，国产；

MgSO₄^.7H₂O：分析纯，国产；

蔗糖：分析纯，国产。

实施例1：细菌分离纯化 

细菌按以下方法步骤分离纯化：

1培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂粉15-20g，H₂O 1000ml，pH 7.0—7.2。121.3℃灭菌20分钟。

2试验步骤 

2.1 培养基制备

配制牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，制备细菌斜面。

2.2土壤稀释液的制备 

（1）称取10g土壤，加入装有100ml无菌水带玻璃珠的500ml三角瓶中，振荡15分钟，即10^-1；

（2）吸取土悬液10ml，加入装有90ml无菌水的500ml三角瓶中，即10^-2；

（3）从（2）中吸取10ml，加入装有90ml无菌水的500ml三角瓶中，即10^-3；

（4）从（3）中吸取5ml，加入装有45ml无菌水的250ml三角瓶中，即10^-4；

（5）从（4）中吸取5ml，加入装有45ml无菌水的250ml三角瓶中，即10^-5；

（6）从（5）中吸取5ml，加入装有45ml无菌水的250ml三角瓶中，即10^-6；

2.3细菌分离；

（7）从（3）（4）（5）中分别吸取0.1ml，加入到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板中进行涂布培养（28-30℃培养2-3天），各3个重复；

（8）选择20-200菌落数的培养皿挑取菌落进行斜面培养（28-30℃培养2-3天）；

2.4 多个土样

（9）共21个土样，每个土样重复上述1.2.1～1.2.2步骤。

2.5 结果：分离到细菌420多株。 

实施例2：分离细菌对番茄青枯病茄青枯拉尔氏菌平板拮抗试验 

1.培养基

1.1 固体培养基：青枯病菌培养基配制：MgSO₄^.7H₂O0.3g，K₂HPO₄2.0g，Yeast extract (酵母浸膏) 4.0g，Casein hydrolysate (酪蛋白水解物) 8.0g，Sucrose (蔗糖)  10.0g，Agar (琼脂) 18g，Distilled water (蒸馏水) 1000ml。

牛肉膏蛋白胨琼脂培养基配制：同实施例1中2.1 

1.2 液体培养基：细菌液体摇瓶培养基：牛肉膏蛋白胨培养基不加琼脂即可。番茄青枯病菌液体摇瓶培养基：青枯病菌培养基不加琼脂即可。

2、试验步骤 

2.1 培养基制备：配制青枯病菌培养基（固体、液体），制备病原菌茄青枯拉尔氏菌斜面；配制牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（固体、液体），制备细菌斜面。

2.2 平板拮抗试验 

2.2.1 菌种活化：番茄青枯病菌和细菌进行菌种活化。

2.2.2 制备青枯病菌平板：活化青枯病菌接入液体培养基中进行摇瓶培养，28-30℃，200转/分。隔天以青枯病菌培养基倒平板，等培养基凝固后每个平板中加入0.1ml青枯病菌发酵液（发酵约40小时），涂布，28-30℃培养过夜，备用。 

2.2.3 准备细菌液体发酵液：在青枯病菌液体摇瓶培养第二天，活化分离细菌接入液体培养基中进行摇瓶培养，28-30℃，200转/分，隔天备用（发酵约40小时）。 

2.2.4 平板拮抗试验：用灭菌滤纸片（Φ9mm）蘸取分离细菌发酵液放入青枯病菌平板，每个平板放5株不同拮抗细菌，3个重复。24h左右观察实验结果，主要考察抑菌圈有无及大小。 

3、结果：通过平板拮抗试验得到拮抗效果较好细菌27株，菌株④-37就是其中一株。 

试验例3：菌株④-37发酵液在盆栽上对番茄青枯病进行生防效果试验 

为了检验菌株④-37的生防效果，进行了本试验。

实验步骤 

1、育苗

1.1 育苗基质准备：育苗基质为：草炭：蛭石：珍珠岩＝7:1:0.5，然后用自来水调节含水率至60％～70％，备用。

1.2 播种：在育苗穴盘（规格90×60）每穴中装入四分之三高左右的1.1制备基质，用手轻压，然后每穴中均匀撒入50颗蕃茄种子，再铺上一层薄薄的基质，并用塑料袋盖住穴盘，防止水分蒸发，备用。 

1.3 出苗：把1.2准备好的播种穴盘放入人工气候箱培养，温度25℃，放入大盆水保湿，打开所有日光灯，18点以后全部关掉，并保证日夜温差在10℃以上。大约4～5天出苗，出苗后掀掉塑料袋，等两子叶平展，备用。 

2、苗移入穴盘中培养 

2.1 苗移栽：在穴盘（规格45×45 ）每穴中装满按1.1制备的基质（略压紧），然后每穴中移入1株1.3准备好的两子叶平展苗，两指在根部略压紧，在大棚中培养。穴盘中培养至3～4片真叶（大约3～4周）。注意：拿苗时两指捏住1片子叶。

2.2 青枯雷尔氏菌和试验拮抗菌发酵液准备：青枯雷尔氏菌和试验拮抗菌活化，然后每株接液体摇瓶培养，28～30℃，200转/分钟，培养约40小时，备用。 

2.3 预用拮抗菌：苗移栽入盆前1个礼拜，每穴中加入5ml相应的拮抗菌发酵液。 

3、盆栽 

3.1 盆栽土准备：从浙江丽水番茄种植基地青枯病发病严重的地块挖2～4吨土，备用。

3.2 土装盆：称取合适量的2.1准备土，混入2％有机肥，每盆（规格280×220 ）中装入4.5公斤混土，备用。 

3.3 移栽：每盆中移栽5株番茄苗，根据需要补充水分。本试验设2个对照，即CK1和CK2，一个处理2，每个处理6盆，每盆5株苗，均匀分布。CK1：移栽时不加任何菌；CK2：移栽时每株只浇50ml青枯雷尔氏菌稀释发酵液（稀释1000倍）。处理2：移栽时每株根部先浇50ml青枯雷尔氏菌稀释发酵液（稀释1000倍），然后再浇50ml拮抗菌稀释发酵液（稀释10倍）。 

3.4 记录：每天记录温度，湿度，标准植株真叶数，每盆发病株数、发病叶片及总真叶数。 

4、结果：如图1所示，说明菌株④-37对番茄青枯病具一定防效，虽然到观察结束菌株④-37处理病株数仍比对照CK2少，但到后期防效已不显著。可能慢慢地青枯雷尔氏菌大量繁殖，菌株④-37已无法防控。因此建议使用本菌株④-37进行青枯病防治时，后期补用菌株④-37制品；或者施用本发明制品与种植园艺措施结合效果会更好。 

<110>  浙江省农业科学院

<120>  番茄青枯病拮抗菌及其应用

<160>  1    

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  1418

<212>  DNA

<213>  Bacillus cereus

<400>  1

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