用于纯化由固相肽合成法制备的肽的化合物和方法

摘要

本发明涉及能够用于纯化通过固相肽合成产生的肽的化合物。另外，本发明还涉及使用本发明的化合物纯化通过固相肽合成产生的肽的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及用于纯化由固相肽合成法制备的肽的化合物和方 法。

背景技术

肽的化学合成法被很好的建立。原则上，分为两种不同的方法： 溶液中合成，其经常是非常耗时的并因此对科学研究无用；和固相 载体上合成，其允许快速优化反应周期。可用于固相肽合成(SPPS) 的方案是基于用规定的序列在不溶性固相上合成肽的Merrifield技 术(Merrifield，R.B.，J.Amer.Chem.Soc.85，1963，2149)。SPPS的总的 原理是基于反复的偶联-脱保护循环：通过羧基端连接在固相上的肽 的游离N-端胺与单个N-保护的氨基酸单元偶联。该单元然后脱保护， 显露出可以连接另一个氨基酸的新的N-端胺。

然而，现今的SPPS方法除了目标化合物(成熟肽)之外，还产生 相对众多的杂质，特别是大量的不成熟肽。因此源自固相肽合成 (SPPS)的肽的纯化需要除去由不完全的偶联/脱保护步骤而产生的被 删过的肽(即缺乏一个或几个氨基酸残基的肽)，和程度少得多的来自 外消旋化或侧链重排的其他肽副产物，以及SPPS程序的脱保护或裂 解阶段期间引入的各种化学物质。尤其是，要合成的肽越长，杂质 的数量、特别是被删过的肽的数量越多。因此，SPPS法的重要目标 是从杂质中高速高收率地只回收目标肽。

因此，已有建议在每次偶联反应后通过乙酸酐进行封端，以终 止非目标序列肽链的进一步伸长并避免进一步产生被删过的肽和得 到截短的肽。在连接最后的氨基酸后，只有具有完整氨基酸序列的 肽在其N-端具有氨基：该氨基可用于纯化目标肽。

已经公开了几篇利用N-端氨基的肽纯化法的报告。然而，这些 方法均不能实现有效的一步分离；反而需要复杂的分离过程。

已经开发了另一种方法，其中只有目标肽在它的N-端被两个额 外的残基(半胱氨酸-甲硫氨酸)延长，然后与被苯基-汞基团衍生化的 固相载体起反应，所述苯基-汞基团利用了选择性结合半胱氨酸的SH 基团。在分离之后，甲硫氨酸-肽的酰胺键被BrCN选择性裂解，以 产生目标肽(D.E.Kriegeret al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，73，3160 (1976))。可是，该方法的局限是不适用于含甲硫氨酸或半胱氨酸的 肽。

另一种已经公开的方法中，目标肽与固相载体通过SH基团共价 连接(美国专利n°5,648,462和n°5,994,588)。可是，该方法的局限是 不适用于含半胱氨酸的肽。

因此，需要有其他的方法来纯化通过SPPS产生的肽，所述方法 适用于任何类型的肽并且是易于实施的。

发明内容

本发明人发现，在SPPS结束时，并且在肽从固相上脱保护/裂解 步骤之前，有可能用包含以连接体分开的两个化学官能团的化合物来选 择性标记成熟肽。通过根据本发明所述化合物与特定固相反应，该化合 物能因此用于将成熟肽从其他封端的截短肽(不成熟肽)中纯化出来。本 发明因此涉及通式(I)的化合物：

X₁-L-X₂(I)

其中：

-X₁选自-N₃或-C≡CH，

-L表示隔开X₁和X₂的连接体，

-X₂选自通式(A)、(B)和(C)的化合物：

其中

■Y₁和Y₂独立地表示-CH-或-N-，

■Y₃表示-OH或离去基团，

■R₁和R₂独立地表示-H、-CH₃或C₂-C₅烷基，

■虚线存在或不存在，

■当虚线存在时，R₃是O且R₄不存在，

■当虚线不存在时，R₃和R₄表示-CH₃；

其中

■R₅表示-H或吸电子基团，

■R₆和R₇独立地表示-CH₃或-H，

■X₃是氨基甲酸酯前体；

和

其中：

■R₈表示-O-CH₃或-H，和

■X₄是氨基甲酸酯前体。

本发明还涉及通过固相合成产生的肽的纯化方法，所述方法包括 如下步骤：

(a)获得具有游离的N-末端氨基的成熟肽与不成熟的封端肽的 混合物，其中所述成熟和不成熟的肽具有受到保护的侧链并且与固相共 价结合；

(b)将步骤(a)的混合物与本发明的通式(I)化合物接触，

其中将从步骤(a)获得的混合物与通式(I)化合物接触的所述步骤 导致在成熟肽和通式(I)化合物之间通过所述成熟肽游离N-末端氨基与 X₂的反应而形成共价连接，

(c)将从步骤(b)获得的混合物进行酸处理以将所述肽从固相上 裂解，

(d)将从步骤(c)获得的肽和能够与X₁反应的固相载体接触，所 述步骤导致在所述固相载体和所述成熟肽之间形成稳定的共价键，

(e)洗涤从步骤(d)获得的固相载体以除去不成熟的封端肽，

(f)通过在选自下面的条件下裂解X₂与成熟肽之间的共价键，从 固相载体上释放成熟肽，获得纯化的成熟肽：

i.X₂是(A)时为亲核条件，

ii.X₂是(B)时为碱性条件，和

iii.X₂是(C)时为紫外线照射。

本发明还涉及本发明的通式(I)化合物在纯化固相合成法制备肽 中的应用。

具体实施方式

如图1所示，本发明的一般原理如下：得益于化学基团X₂，本 发明的化合物能够与成熟肽的游离N-末端氨基特异性反应以形成共价 键，所述共价键在特定条件下是可特异性裂解的。在从固相上脱保护/ 裂解后，使所述肽然后和能够与X₁特异性反应的固相载体接触；所述 反应导致在成熟肽与所述固相载体之间形成完全稳定的共价键。由于 X1与固相载体之间的反应(叠氮化物与炔烃之间的反应，优选由铜(I)盐 催化，或叠氮化物与膦之间的反应)是高度化学选择性的，因此不能发 生在组成肽的氨基酸上存在的化学官能团上(氨基酸不包含叠氮化物、 炔烃或膦官能团)，该方法体现出适用于任何类型的肽的优点，无论肽 的氨基酸组成如何。另外，该方法非常迅速并且易于实施。

本发明因此涉及通式(I)的化合物：

X₁-L-X₂(I)

其中：

-X₁选自-N₃或-C≡CH，

-L表示隔开X₁和X₂的连接体，

-X₂选自通式(A)、(B)和(C)的化合物：

其中

■Y₁和Y₂独立地表示-CH-或-N-，

■Y₃表示-OH或离去基团，

■R₁和R₂独立地表示-H、-CH₃或C₂-C₅烷基，

■虚线存在或不存在，

■当虚线存在时，R₃是O且R₄不存在，

■当虚线不存在时，R₃和R₄表示-CH₃；

其中

■R₅表示-H或吸电子基团，

■R₆和R₇独立地表示-CH₃或-H，

■X₃是氨基甲酸酯前体；

和

其中：

■R₈表示-O-CH₃或-H，和

■X₄是氨基甲酸酯前体。

根据本发明，本发明的通式(I)化合物的所述连接体L通常将X₁和X₂隔开至少一个原子，特别是1至30个连续的原子，更特别是1至 20个连续的原子，更加特别是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连 续的原子。

一般地，本发明的通式(I)化合物的所述连接体L选自：

--(CH₂)_n-，

--CH₂-(CH₂-O-CH₂)_n-CH₂-，

--Ar-，

--(CH₂)_n-Ar-，

--CH₂-(CH₂-O-CH₂)_n-CH₂-Ar-，

--(CH₂)_n-O-Ar-，

--CH₂-(CH₂-O-CH₂)_n-CH₂-O-Ar-，和

--CH₂-(CH₂-O-CH₂)_n-Ar-，

其中“n”是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多，并且其中 Ar表示下式的芳基：

其中R₉、R₁₀、R₁₁和R₁₂独立地表示H、-CH₃、-O-CH₃、-NO₂或卤素原 子，一般选自F、CI、Br和I。

一般地，根据本发明，所述通式(A)化合物选自：

其中Y₃表示-OH或离去基团。

根据本发明，当Y₃是“离去基团”时，所述离去基团可以是在键 的异裂中能够带着一对电子离开的任何基团。特别地，当Y₃是“离去基 团”时，Y₃通常选自-OR₁₃和N(R₁₃)₂，其中R₁₃表示CH₃或C₂、C₃、C₄或C₅烷基。

根据本发明，“吸电子基团”或“EWG”是指能够通过诱导或内 中介效应吸引电子离开它的相邻原子的任何化学基团。通常，本发明的 吸电子基团选自具有下式的吸电子基团：

根据本发明，“氨基甲酸酯前体”是指能够与胺反应以形成氨基 甲酸酯官能团的任何化学基团。本发明的具体氨基甲酸酯前体具有通式 (II)：

其中X₅是离去基团。

根据本发明，X₅是“离去基团”时，所述离去基团可以是在键的异 裂中能够带着一对电子离开的任何基团。特别是，所述离去基团X₅一 般选自：

在具体的实施方式中，所述通式(B)的化合物选自：

其中X₅如前面所限定。

在另一种具体的实施方式中，所述通式(C)的化合物选自：

其中X₅如前面所限定。

在一种实施方式中，本发明的所述通式(C)化合物不是

在另一种实施方式中，本发明的所述通式(C)化合物不是

本发明化合物的合成途径不受任何限制。一般地，本发明的通式 (A)化合物从1，3-二甲基巴比妥酸或5，5-二甲基-1，3-环己二酮在标准程序 下进行C-酰化获得。通常，本发明的通式(B)化合物从2-巯基乙醇获得， 所述2-巯基乙醇被S-烷基化或芳基化，然后氧化成砜，以提供在标准条 件下进一步转化为通式(II)的氨基甲酸酯前体的醇。一般地，本发明的 通式(C)化合物从苄醇获得，该苄醇在标准条件下进一步转化为通式(II) 的氨基甲酸酯前体。

本发明还涉及通过固相合成产生的肽的纯化方法，所述方法包括 如下步骤：

(a)获得具有游离的N-末端氨基的成熟肽与不成熟的封端肽的 混合物，其中所述成熟和不成熟的肽具有受到保护的侧链并且与固相共 价结合；

(b)将步骤(a)的混合物与本发明的通式(I)化合物接触，

其中将从步骤(a)获得的混合物与通式(I)化合物接触的所述步骤 导致在成熟肽和通式(I)化合物之间通过所述成熟肽游离N-末端氨基与 X₂的反应而形成共价连接，

(c)将从步骤(b)获得的混合物进行酸处理以将所述肽从固相上 裂解，

(d)将从步骤(c)获得的肽和能够与X₁反应的固相载体接触，所 述步骤导致在所述固相载体和所述成熟肽之间形成稳定的共价键，

(e)洗涤从步骤(d)获得的固相载体以除去不成熟的封端肽，

(f)通过在选自下面的条件下裂解X₂与成熟肽之间的共价键，从 固相载体上释放成熟肽，获得纯化的成熟肽：

i.X₂是(A)时为亲核条件，

ii.X₂是(B)时为碱性条件，和

iii.X₂是(C)时为紫外线照射。

根据本发明，所述“具有游离的N-末端氨基的成熟肽与不成熟 的封端肽的混合物，其中所述成熟和不成熟的肽具有受到保护的侧链并 且与固相共价结合”是在任何SPPS方法之后获得的。特别是，N端被 封端基团修饰的所述不成熟肽通常在已经用乙酸酐进行封端的情况下 用乙酰基封端，或用丙酰基、4-硝基苯基、2，4-二硝基苯基或用2，6-二硝 基苯基封端。另外，在SPPS期间，可以通过熟练技术人员已知的任何 方法，例如使用Boc、tBu、Trt、Mtt、Mmt、Pbf、Pmc、Tos、Bzl、Z、 Troc、Pac、Alloc、Dde、Acm保护基，来进行成熟和不成熟肽的侧链 的保护。关于SPPS中使用的固相的性质，可以由技术人员选择任何适 当的固相。SPPS中通常使用的固相的例子是最后被PEG链取代的聚苯 乙烯-二乙烯基苯共聚物(Tentagel，Argogel，Novagel)、交联聚丙烯酰胺 树脂或交联PEG聚合物例如PEGA，ChemMatrixTM。

在SPPS后获得的成熟肽因此与许多种杂质混合。

根据本发明，“成熟肽”是指通过在固相上的组合化学获得的同 一成熟肽的若干拷贝或不同成熟肽的若干拷贝。

根据本发明，步骤(a)的混合物与本发明的通式(I)化合物接触的所 述步骤(b)，通常是通过将与固相载体结合的所述肽在溶剂、通常为二甲 基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮或二氯甲烷中与过量的、通常为2、5或10 当量的通式(I)化合物的和过量的、通常为2、5或10当量的碱反应来进 行的。

当X₂是通式(A)的化合物时，在X₂与成熟肽的末端氨基之间形 成的键是烯胺类型的，通常如式A′所示：

当X₂是通式(B)或(C)的化合物时，在X₂与成熟肽的末端氨基之 间形成的键是氨基甲酸酯类型的，典型如式B′和C′所示：

根据本发明，将从步骤(b)获得的混合物进行酸处理以从固相载 体上裂解所述肽的所述步骤(c)，通常是通过用TFA(三氟乙酸)或氢氟酸 溶液中的碳阳离子清除剂处理来进行的。本发明的特别适当的酸处理是 用三异丙基硅烷(2.5％v/v)、苯酚(5％w/v)和水(5％v/v)在TFA中的混合物 进行的标准处理。

通常，能够与X₁反应的本发明的适当固相载体选自合成的亲水 聚合物，例如PEGA树脂、ChemMatrix^TM树脂、SPOCC(超渗透的有机 组合化学)树脂，或选自天然的亲水性碳水化合物聚合物，例如琼脂糖 或琼脂糖凝胶。这些固相载体用能够与X₁反应的化合物嫁接；即用包 含叠氮化物、炔烃、环辛炔或膦官能团的化合物嫁接，以与X₁形成共 价的、不可逆的键。用能够与X₁反应的化合物嫁接的本发明固相载体 的例子是：

■当X₁是C≡CH时：

其中n是1、2、3、4或5。

■当X₁是N₃时：

因此，根据本发明纯化由固相合成制备的肽的所述方法中，将从 步骤(c)获得的肽和能够与X₁反应的固相载体接触的所述步骤(d)，取决 于X₁的性质和固相载体的性质。

在一种实施方式中，当用包含叠氮化物或炔烃官能团的化合物嫁 接固相载体时，本发明的方法的所述步骤(d)在催化剂、特别是选自铜盐、 通常是Cu(I)盐的存在下进行。在另一种实施方式中，当用包含环辛炔 或膦官能团的化合物嫁接固相载体时，实施本发明方法的所述步骤(d) 无需催化剂。纯化通过固相合成产生的肽的本发明方法的所述步骤(d) 通常如下进行：

i.当X₁是C≡CH时：

将粗肽混合物与过量的叠氮化物官能化的固相载体(通常为1.2-2 摩尔当量)在无氧气氛中、在pH＝5-8的水基缓冲液(通常为100mM磷酸 盐或HEPES，pH＝7)中混合，当所述肽不溶于缓冲液时任选添加有机溶 剂，然后添加Cu(I)离子源(通常0.1-10摩尔当量)和任选Cu(I)配位体例 如三[苯甲基-1H-1，2，3-三唑-4-基)甲基]胺或三[3-羟基-1-丙基-1H-1，2，3- 三唑-4-基)甲基]胺。通常，铜(I)源是固体Cu(I)盐例如溴化铜，或是通 过临时用还原剂例如抗坏血酸钠或三-(羧乙基)-膦还原Cu(II)盐例如硫 酸铜而获得的。

ii.当X₁是N₃时：

ii.a)将粗肽混合物与过量的炔烃官能化的固相载体(通常为1.2-2 摩尔当量)在无氧气氛中、在pH＝5-8的水基缓冲液(通常为100mM磷酸 盐或HEPES，pH＝7)中混合，当所述肽不溶于缓冲液时任选添加有机溶 剂，然后添加Cu(I)离子源(通常为0.1-10摩尔当量)和任选Cu(I)配位体 例如三[苯甲基-1H-1，2，3-三唑-4-基)甲基]胺或三[3-羟基-1-丙基 -1H-1，2，3-三唑-4-基)甲基]胺。通常，铜(I)源是固体Cu(I)盐例如溴化铜， 或是通过临时用还原剂例如抗坏血酸钠或三-(羧乙基)-膦还原Cu(II)盐 例如硫酸铜而获得的。

ii.b)或者，可以使用适当的环辛炔-官能化的树脂，通过无铜的 环加成来进行与固相载体形成共价键。一般地，其实施是通过将粗肽混 合物与过量的环辛炔官能化的固相载体(通常为1.2-2摩尔当量)在pH ＝2-8的水基缓冲液中(通常为100mM磷酸盐或HEPES，pH＝7)混合，当 所述肽不溶于缓冲液时任选添加有机溶剂。

ii.c)还或者，与固相载体形成共价键，可以通过使用适当的膦 官能化树脂，通过Staudinger连接反应来进行。通常，其是通过将粗肽 混合物与过量的膦官能化的固相载体(通常为1.2-2摩尔当量)在无氧气 氛、pH＝5-8的水基缓冲液中(通常为100mM磷酸盐或HEPES，pH＝7) 混合，当所述肽不溶于缓冲液时任选添加有机溶剂来进行的。

在所述步骤(d)中，可以用作添加剂以完全溶解所述粗肽混合物 的有机溶剂一般选自二甲基甲酰胺、二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮、乙腈、 六氟异丙醇、三氟乙醇、异丙醇、乙醇或甲醇。

根据本发明，洗涤从步骤(d))获得的固相载体以除去不成熟的封 端肽的步骤(e)，通常如下实施：将所述固相载体转移到配备有能够保留 固相载体但是让任何溶剂自由通过的过滤器的开放容器中，例如装有聚 丙烯烧结料的聚丙烯注射器或烧结玻璃漏斗，然后用大量的不同水溶液 和有机溶剂、例如EDTA二钠盐250mM、甲醇、二甲基甲酰胺和去离 子水相继地流动洗涤。

根据本发明，通过裂解X₂和成熟肽之间的共价键从固相载体上 释放所述成熟肽来获得纯化的成熟肽的所述步骤(f)，是根据用于标记成 熟肽的通式(I)化合物的性质，在不同条件下进行的。确实，在成熟肽的 N-末端氨基和所述化合物(I)的X₂部分之间形成的键的稳定性将根据X₂的性质而异：

-在成熟肽的N-末端氨基和式(A)的X₂部分之间形成的键在亲 核条件下是可裂解的。一般地，本发明的亲核条件是用大量过剩的肼、 乙醇胺或羟胺在溶剂例如水、或水与有机溶剂例如甲醇、乙醇、六氟异 丙醇、三氟乙醇、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮或乙腈的混合物中进 行处理；

-在成熟肽的N-末端氨基和式(B)的X₂部分之间形成的键在碱性 条件下是可裂解的。一般地，本发明的碱性条件由用pH大于9、一般 在9和13之间、特别在10和12、更特别在11和12之间的碱性溶液处 理固相载体构成。本发明的适合的碱性溶液是CAPS缓冲液、磷酸盐缓 冲液、或基于氢氧化钠的溶液；

-在成熟肽的N-末端氨基和式(C)的X₂部分之间形成的键在紫外 线照射条件下是可裂解的。一般地，本发明的紫外线照射由固相载体在 对于固定波长、典型254nm、320nm、350nm或420nm的紫外光UV- 透明的容器中悬浮在无氧去离子水中构成。

步骤(f)后，通过过滤将成熟肽与固相载体分离，并用去离子水洗 涤树脂。

由于式(A)和(B)的X₂部分，通常获得纯成熟肽的碱性溶液。如 果需要的话，然后可以用适当的酸化缓冲液来降低溶液的pH。

本发明还涉及本发明的通式(I)化合物在纯化通过固相合成产生 的肽中的应用。

在本发明的整篇说明书中，为了简化分子的表示，采用了键。这种键只表示化合物没有表现出的其余部分。

下面的图和实施例公开了本发明的其它方面和优点，所述图和实 施例应该认为是说明性而不限制本申请的范围。

附图说明

图1：本发明的一般原理。

图2：活化的碳酸酯6的合成

图3：通过铜(I)-催化的环加成在固相载体上的选择性嫁接。

图4：从第二树脂上最后裂解。

图5：在固相肽合成mitogaligin的31-53片段后获得的粗肽的 HPLC-MS分析(峰A中洗脱的成熟肽31-53)。

图6：用本发明化合物标记后，肽的HPLC-MS分析(在峰F中 洗脱的标记的成熟肽31-53)。

图7：粗环加成混合物的HPLC-MS分析(t＝2h)，显示了标记的 成熟肽31-53的总消耗量。

图8：洗涤树脂、然后温和的碱介导释放后的HPLC-MS分析。

实施例

固相肽合成

97个氨基酸蛋白质mitogaligin的31-53片段(mitogaligin的所述 31-53片段具有以下氨基酸序列RGLSWTGTSRRLPWSTWSLSRST，如 SEQ ID NO：1所示)的固相肽合成(SPPS)，使用Fmoc/iBu化学，以 0.1mmol的规模，用HBTU/HOBt作为连接试剂和Rink树脂，在Applied  Biosystem的自动化合成器433A上运行。使用10-倍过量的保护氨基酸 和连接试剂，自动进行伸长。所用的侧链保护基是Arg(Pbf)、Ser(tBu)、 Thr(tBu)、Trp(Boc)。使用从制造商购买的0.1mmol规模程序，单偶联 继之以用乙酸酐封端。进行双偶联以引入Arg40和Arg41。用87.5/5/2.5/5 的TFA/H₂O/iPr₃SiH/苯酚处理2h，从树脂上释放粗肽，用冰冷的二乙醚 沉淀所述肽，离心回收并用二乙醚洗涤3次。

通过HPLC(高压液相色谱法)和MALDI-TOF(基质辅助激光解吸 电离/飞行时间)质谱来分析肽(图5-8)。HPLC分析在配备有Hitachi L-2130泵、Hitachi L-2455二极管阵列检测器和Hitachi L-2200自动进样 器的LaChrom Elite系统上进行。机器配有C18反相柱，Nucleosil，5μm，250x4.6mm。溶剂A和B分别是含0.1％TFA的H₂O和含0.1％ TFA的MeCN。梯度为以1ml/min的流速经30min从25％到35％B。 MS分析在配备有337-nm氮激光器和无网格延迟的提取离子源的 Autoflex MALDI-TOF仪器(德国不来梅，Bruker Daltonics)上进行。所述 仪器使用反射阳离子模式，有150ns延迟，加速电压为19kV。使用Flex -控制软件(Bruker)实现仪器控制和外部校准。观察到的m/z与单同位素 离子对应使用干滴法，用α-氰基-4-羟基-肉桂酸(HCCA)的溶液作为基 质，将样品共结晶。成熟肽(31-53)在峰A中洗脱，如图5所示。

活化的碳酸酯6的合成(图2)

·2-(2-叠氮基-乙氧基)-乙醇(2)

2-(2-氯-乙氧基)-乙醇(15g，0.12mol)和叠氮化钠(15.7g，2当量) 在H₂O(50ml)中的溶液在90℃加热16h。反应混合物冷却到室温后用 CH₂Cl₂(6x50ml)提取。合并的有机层在MgSO₄上干燥并过滤。减压除 去溶剂，得到叠氮化物2，为无色液体(15g，95％)。¹H和¹³C NMR谱 与文献数据相匹配(Cheng，H.et al.J.Med.Chem.2005，48，645-653)。

¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ3.78-3.73(m，2H)，3.70(t，2H，J＝ 5.0Hz)，3.61(t，2H，J＝4.5Hz)，3.41(t，2H，J＝5.0Hz)，2.09(bt，1H)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)：δ72.7，70.3，62.1，51.0.

·甲苯-4-磺酸2-(2-叠氮基-乙氧基)-乙酯(3)

2-(2-叠氮基-乙氧基)-乙醇2(14.1g，0.108mol)和吡啶(13ml，1.5 当量)在CH₂Cl₂(150ml)中的溶液在冰浴中冷却。添加对-甲苯磺酰氯 (30.7g，1.5当量)，然后添加DMAP(173mg，0.01当量)。反应混合物在 室温下搅拌72h，然后用1M HCl水溶液(3x50ml)洗涤，在MgSO₄上干燥，在减压下过滤然后浓缩。通过快速柱色谱纯化(洗脱剂∶石油醚 /AcOEt 9∶1然后7∶3)，获得甲苯磺酸酯3，为无色油(23.8g，78％)。1H和 ¹³C NMR谱与文献数据相配(Gill，H.et al.J.Med.Chem.2009，52， 5816-5825)。

¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ7.81(d，2H，J＝8.2Hz)，7.35(d，2H， J＝8.2Hz)，4.17(t，2H，J＝4.7Hz)，3.70(t，2H，J＝4.7Hz)，3.61(t，2H，J＝ 5.0Hz)，3.32(t，2H，J＝5.0Hz)，2.45(s，3H)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)： δ145.2，133.2，130.1，128.2，70.4，69.4，69.0，50.9，21.9. ·2-[2-(2-叠氮基-乙氧基)-乙基巯基(sulfanyl)]-乙醇(4)

将NaOH水溶液(3.33g在20ml H₂O中，1.5当量)滴加到甲苯磺 酸酯3(15.8g，55.5mmol)和β-巯基乙醇(5.8ml，1.5当量)的MeOH (200ml)溶液中。所得的混合物在室温下搅拌72h，然后在减压下蒸发甲 醇。所得的悬浮液用水(50ml)稀释并用CH₂Cl₂(6x50ml)提取。合并 的有机层在MgSO₄上干燥，在减压下过滤然后浓缩。通过快速柱色谱 纯化(洗脱剂∶石油醚/AcOEt 8∶2然后6∶7)，得到硫化物4，为无色液体 (8.41g，79％)。

¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ3.74(t，2H，J＝5.8Hz)，3.68(t，2H，J ＝6.4Hz)，3.65(t，2H，J＝5.0Hz)，3.40(t，2H，J＝5.0Hz)，2.79(t，2H，J＝ 5.8Hz)，2.75(t，2H，J＝6.4Hz)，2.41(bs，1H)；¹³C NMR(125MHz， CDCl₃)：δ71.4，69.9，60.9，50.9，36.2，31.5；ESI-HRMS::[M+H]⁺mJz＝ 214.0623(对C₆H₁₃N₃NaO₂S计算得到：214.0626). ·2-[2-(2-叠氮基-乙氧基)-乙基磺酰基]-乙醇(5)

硫化物3(8.41g，44mmol)的CH₂Cl₂(100ml)溶液在冰浴中冷 却。逐份添加mCPBA(84％纯度，27.1g，3当量)，得到的溶液在室温下 搅拌16h。加入1M NaHSO₃溶液(20ml)，所得的悬浮液在室温下剧烈 搅拌30min。白色的间氯苯酸沉淀物在硅藻土垫上过滤。有机层用饱和 的NaHCO₃水溶液(3x20ml)洗涤，在MgSO₄上干燥，在减压下过滤然 后浓缩。通过快速柱色谱纯化(洗脱剂∶石油醚/AcOEt1∶1然后3∶7然后 是纯AcOEt)，得到砜5，为无色液体(8.41g，86％)。

1H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ4.12(t，2H，J＝5.1Hz)，3.96(t，2H， J＝5.3Hz)，3.67(t，2H，J＝4.9Hz)，3.44(t，2H，J＝4.9Hz)，3.34-3.40(m， 4H)，2.63(bs，1H)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)：δ70.2，65.2，57.5，56.7， 55.0，51.0；ESI-HRMS::[M+Na]⁺m/z＝246.0519(对C₆H₁₃N₃NaO₄S算得： 246.0524).

·2-[2-(2-叠氮基-乙氧基)-乙基磺酰基]-乙基4-硝基苯基碳酸酯(6)

醇5(4.0g，17.9mmol)和吡啶(10ml，6.9当量)的CH₂Cl₂(100ml) 溶液在冰浴中冷却，并加入对硝基苯基氯甲酸酯(5.42g，1.5当量)。所 得的溶液在室温下搅拌16h，然后用1M HCl水溶液洗涤(3x50ml)，在 MgSO₄上干燥，在减压下过滤然后浓缩。通过快速柱色谱纯化(洗脱剂∶ 石油醚/AcOEt7∶3然后1∶1)，得到碳酸酯6，为白色无定形固体(6.3g， 91％)。

1H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ8.29(d，2H，J＝8.8Hz)，7.40(d，2H， J＝8.8Hz)，4.75(t，2H，J＝5.8Hz)，3.97(t，2H，J＝5.1Hz)，3.68(t，2H，J＝ 4.6Hz)，3.61(t，2H，J＝5.8Hz)，3.43(t，2H，J＝4.6Hz)，3.35(t，2H，J＝5.1 Hz)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)：δ155.5，152.2，145.8，125.6，122.0，70.3， 65.2，62.2，55.1，53，9，50.9；ESI-HRMS::[M+Na]⁺m/z＝411.0581(对 C₁₃H₁₆NaN₄O₈S算得：411.0587). 在树脂上装配叠氮基示踪标签

在iPr₂NEt(20当量)存在下溶解在DMF中的活化碳酸酯 N₃-CH₂CH₂OCH₂CH₂SO₂CH₂CH₂-OCOO-(pNO₂)-C₆H₄6(10当量)与肽 树脂7(1当量)混合2h。然后用DMF(3x)和CH₂Cl₂(3x)洗涤肽树脂， 并应用标准TFA裂解来释放叠氮基标记的肽8(HPLC峰F，见图6)。 在炔烃树脂上选择性负载叠氮基标记的肽

将0.4mmol/g(1当量)的氨甲基PEGA 800树脂(Novabiochem) 引入配有聚丙烯烧结料和特氟龙塞的注射器中，依次用CH₂Cl₂(3x)、 含0.1％TFA的CH₂Cl₂(3x)、CH₂Cl₂(3x)、含10％iPr₂NEt的 CH₂Cl₂(3x)、CH₂Cl₂(3x)和肽合成级DMF(3x)洗涤。然后，通过抽吸 转移戊炔酸(2当量)和HATU(2当量)，然后转移iPr₂Net(4当量)。旋 转混合树脂2h。使用Kaiser试验检查反应的完成。用DMF(3x)彻底洗 涤后，将溶解在脱氧的100mM pH 7HEPES缓冲液中的CuSO₄(0.5当 量)和抗坏血酸钠(1当量)加入到炔树脂9(2当量)中，然后加入叠氮 基标记的粗肽8(1当量)。2h后，通过HPLC检查上清液中标记肽8的 总消耗量(参见图7)，并用250mM EDTA二钠盐溶液(pH 4.2)、去离子 水、甲醇、二甲基甲酰胺和去离子水依次彻底洗涤肽树脂10，以除去截 短的肽和铜催化剂。

释放纯的、未标记的目标肽

肽树脂10最后用50mM CAPS缓冲液，pH 11.7，(2x30min)在 20℃处理，或在37℃处理3x5min(参见图8的HPLC分析)，溶液用 TFA酸化到pH降至3-5。随后可以使用标准程序例如疏水SPE小柱除 去缓冲盐。

在整个本申请中，各种参考文献描述了本发明所属领域的现有技 术状态。这些参考文献的公开内容通过在本公开中参考而在此引入。