一种无背景定向克隆PCR产物的载体及制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种无背景定向克隆PCR产物载体及制备方法和应用，其特征是在载体筛选标记基因前引入XcmI盒，该XcmI盒的特征在于XcmI酶切后形成突出的dT末端，且序列拼接后将在筛选标记基因前形成一个无活性的核糖体结合位点，载体自连时筛选标记基因不能表达。本发明制备的载体经XcmI酶切后形成突出dT末端可以应用于TA克隆，dT末端也可以通过T4DNA聚合酶补平形成平末端，应用于平末端连接，方法易行，成本低廉，在两种克隆方法中的应用均可以达到无背景、定向克隆的效果。

说明书

技术领域

本发明属基因工程技术领域，具体涉及一种可无背景定向克隆PCR产物的 载体，还涉及一种可无背景定向克隆PCR产物载体的制备方法，同时还涉及一 种可无背景定向克隆PCR产物载体的应用。

背景技术

PCR(polymerase chain reaction)是分子生物学中的常规的实验技术，大部 分基因功能探讨等都需要将目的片段通过PCR扩增出来然后克隆到相应的载体 来进行研究。目前克隆PCR产物的方法有很多种，包括传统的酶切连接技术， 新开发的不依赖酶切的Gateway系统，不依赖于T4 DNA连接酶的Topo  cloning以及不依赖于连接酶的克隆系统(ligation-independent cloning，LIC) 等。尽管如此，在一些如cDNA文库构建，蛋白相互作用网络检测，转录调控 网络研究等需要大规模构建克隆的工作中，前面提到的这些方法都具有各自的局 限性。酶切连接的方法操作繁琐，且受限制性内切酶识别位点的限制，Gateway和Topo cloning操作成本较高，LIC的方法依赖于10-15bp的单链DNA互补区， 该区域通常容易形成二级结构从而影响克隆的效率。因此，最简单的方法还是将 PCR产物直接与相应的载体进行连接。

PCR产物直接连接载体常规方法就是采用TA克隆方案，利用Taq酶具有不 依赖于模板的末端转移酶活性在PCR产物的3’端加上单个脱氧核苷酸A，然后 在克隆载体上通过一定方法的处理(包括加dT尾和采用特异性内切酶等)获得 突出dT，通过TA互补在T4DNA连接酶的作用下完成直接连接。利用此原理， 现在已经开发了多种商业化的T载体，通过各种改造，目前研究者已经开发出 不同筛选标记的T载体，以及高阳性率的T载体等，但由于目的片段两端都带 有同样的dA尾，目的片段插入正反的筛选依然是目前存在的一个问题。虽然目 前有通过给PCR产物引入特异性碱基，使之正向和反向插入到载体后与载体序 列组合成不同限制性内切酶识别序列，通过将连接产物进行特异性内切酶处理可 以较大程度上去除片段的插入正反，但增加了实验步骤，操作繁琐，特别是在大 规模克隆过程中增加其工作量。

另外一种PCR产物直接克隆的方法是平末端连接。由于Taq酶不具有3’-5’ 外切酶活性，PCR过程中具有相对较高的错配率，在调取基因时一般都采用具 有3’-5’外切酶活性的高保真DNA聚合酶来扩增，由此得到的PCR产物不具有 突出的A尾，只形成平末端产物。平末端产物的连接载体也必须是平末端，其 载体自连是平末端连接过程中的一大困扰。载体去磷酸化等处理可以降低载体自 连的概率，但由此PCR引物需要经过磷酸化处理，很大程度上增加了实验成本， 由于载体去磷酸化效率的问题，克隆阳性率远不能达到100％，PCR产物平末端 克隆插入正反的筛选也给大规模克隆增加了工作量。

综上所述，虽然PCR产物的直接克隆在大规模克隆构建上具有操作简单等 优势，但在克隆筛选上还需要很大程度上进行优化。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种PCR产物克隆载体，该载体可以达到无背 景、定向克隆PCR产物的目的。

本发明的另一个目的是在于提供了一种PCR产物克隆载体的制备方法，方 法易行，成本低廉，为基因克隆特别是大规模克隆提供方法。

本发明的再一个目的是在于提供了一种PCR产物克隆载体的应用，该载体 既可以完成PCR产物的TA连接克隆，又可以完成平末端连接克隆，且在两种 克隆方法中的应用均可以达到无背景、定向克隆的效果。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

本发明设计的克隆载体将PCR片段插入位点设计为抗性基因不具有活性的 核糖体结合位点内部，克隆构建过程中通过PCR片段一段引入能与载体序列组 合成有活性核糖体结合位点的方式来筛选正确的克隆，而载体自连和片段反向插 入均造成筛选标记基因的核糖体结合位点不具有活性，从而达到无背景、定向克 隆的目的。

本发明的理论基础是：位于基因起始密码子上游8±3bp的核糖体结合位点是 原核基因的表达起始的重要元件，其序列由富含GA的核苷酸组成。不同基因前 的核糖体结合位点序列不尽相同，但其序列GA含量直接影响基因表达效率。如 核糖体结合位点序列由AGGAGA突变成TCCAGA时，基因则关闭表达。根据 上述理论，在抗性基因起始密码子上游5bp处引入TCCAGA的不具有活性的核 糖体结合位点，并在TCC-AGA中间引入PCR片段插入位点，将PCR片段5’ 端通过引物引入GGA、3’端通过引物引入AGG序列，由此PCR片段正向插入 到载体后将形成AGGAGA有活性的核糖体结合位点，从而启动相应抗性基因的 表达，而PCR片段反向插入或载体自连都将形成TCCAGA不具活性的核糖体结 合位点，克隆在含有相应抗生素的平板上均不能生长，由此排除实验原因理论上 可以达到PCR产物的无背景定向克隆。

一种无背景定向克隆PCR产物的载体的制备方法，包括以下步骤：

1)包含无活性核糖体结合位点的抗性筛选基因的中间载体的制备：以通用 载体pUC18(TAKARA公司购买)为前体，用包含多克隆位点及无活性核糖体 结合位点的筛选标记基因cat替换其中的lacZα片段，得到中间载体pBP1；其具 体步骤为：

a.利用特异性引物以pUC18载体为模板用高保真DNA聚合酶KOD-Plus-Neo 扩增包括Amp抗性基因、复制子，lac启动子元件的载体框架；扩增体系为： 10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μl，2mM dNTPs 5μl，25mM MgSO₄ 3μl，10 μM正向引物1μl，10μM反向引物1μl，pUC18 DNA 100ng，超纯水加到最后 体系为50μl，最后加KOD-Plus-Neo 1U；正向引物：SEQ ID No：2，反向引物： SEQ ID No：3；利用PCR回收试剂盒纯化后得到载体框架片段，然后用识别片段 两端限制性位点的内切酶BglII和KpnI对载体框架片段进行酶切，并回收相应 片段；

b.利用特异性引物以pACYC184质粒为模板用高保真DNA聚合酶 KOD-Plus-Neo扩增cat基因的读码框；扩增体系为：10×PCR Buffer for  KOD-Plus-Neo 5μl，2mM dNTPs 5μl，25mM MgSO₄ 3μl，10μM正向引物1μl， 10μM反向引物1μl，pACYC184 DNA 100ng，超纯水加到最后体系为50μl，最 后加KOD-Plus-Neo 1U，正向引物：SEQ ID No：4，反向引物：SEQ ID No：5； 利用PCR回收试剂盒纯化，利用识别cat基因的读码框两端的内切酶BglII和 KpnI对片段进行酶切，并利用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切后的片段；

c.将步骤a和步骤b获得的回收后的片段以摩尔比1∶3混合，在T4 DNA 连接酶作用下形成闭合环状，后转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，用Amp筛选 获得阳性克隆，从中提取质粒并测序鉴定，得到中间载体pBP1；

2)一种无背景定向克隆PCR产物的载体的制备方法：

A.设计、合成XcmI盒：人工合成XcmI盒，其特征包括5’端内切酶识别 位点、5’端XcmI识别位点、lac启动子，ccdB负筛选标记基因、3’端XcmI识别 位点、3’端内切酶识别位点等，5’端XcmI位点的切点最后一个碱基为T，T前 面3个碱基不含A和G，3’端XcmI位点的切点最后一个碱基为A，A前面的3 个碱基不含A和G，A后面两个碱基不和T或C，且3’端XcmI位点的切点A 与筛选标记基因起始密码子ATG之间的距离在7-9bp之间；设计合成的XcmI 盒序列见序列列表SEQ ID No：1；

B.将XcmI盒用PstI+SphI进行酶切，并利用DNA凝胶回收试剂盒回收酶 切后的片段；

C.将中间载体pBP1用PstI+SphI酶切，并利用DNA凝胶回收试剂盒回收 酶切后的片段；

D.将酶切回收的XcmI盒和酶切回收后的中间载体pBP1以适当比例(摩 尔比为3∶1)混合，在T4DNA连接酶作用下形成闭合环状分析，后转入大肠 杆菌DB3.1感受态细胞，用Amp筛选获得阳性克隆，从中提取质粒并测序鉴定， 得到目的载体pDNB1。得到的载体的筛选标记基因读码框前含有人工合成的 XcmI盒，XcmI盒的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

其中步骤1)所述出发载体pUC18可以选用类似的各种克隆载体(如pUC19、 pUC118、pUC119、pBlueScript II SK、pGEM系列、pMD系列等)，其中选用的 筛选标记基因可以用出发载体上不包含的其他筛选标记基因(如neo、tetR等)。

步骤2)A中所述酶切XcmI盒可以用其他可以实现酶切产生突出T末端或 者平末端的盒来替换，其序列特征满足酶切自连后在抗性基因起始密码子ATG 之间的距离在5-7bp前组装成无活性的核糖体结合位点。

本发明设计的目的载体pDNB1需要在大肠杆菌DB3.1中进行增殖，克隆构 建过程中连接产物转化普通的大肠杆菌。

一种载体在PCR产物TA连接克隆中的应用，其步骤是：

1)用XcmI酶切目的载体pDNB1，回收大的载体片段即获得可以直接进行 TA克隆的T载体；

2)设计扩增片段特异性的正反向引物，将正向引物5’端引入GGA，反向引 物的5’端引入CCT；

3)采用Taq酶PCR反应扩增出特异性的两端带A尾的PCR片段；

4)将两端带A尾的PCR片段与步骤1)中获得的T载体相连接，转化大肠 杆菌DH5α，采用载体上的两种抗性基因进行筛选；

5)挑取克隆进行PCR验证，检测插入片段的正反和阳性率。

一种载体在PCR产物平末端连接克隆中的应用，其步骤是：

1)用XcmI酶切目的载体pDNB1，回收大的载体片段即获得T载体，用 T4DNA聚合酶处理该T载体，补平dT尾，形成平末端片段，即获得可以直接 进行PCR产物平末端连接的载体。

2)设计扩增片段特异性的正反向引物，将正向引物5’端引入GGA，反向引 物的5’端引入CCT；

3)采用高保真酶PCR反应扩增出特异性的平末端PCR片段；

4)将平末端PCR片段与步骤1)获得的载体相连接，转化大肠杆菌DH5α， 采用载体上的两种抗性基因进行筛选；

5)挑取克隆进行PCR验证，检测插入片段的正反和阳性率。

步骤1)dT尾去除可以选用其他可以达到同样功能的修饰酶来取代。 本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1.本发明制备的载体经XcmI酶切后形成突出dT末端可以应用于TA克隆， dT末端也可以通过T4DNA聚合酶补平形成平末端，应用于平末端连接，在两 种克隆方法中的应用均可以达到无背景、定向克隆的效果。

2.本发明设计的载体可以自行制备扩增，方法易行，成本低廉，用本发明设 计的载体来完成PCR产物的快速克隆，阳性率达到100％，且能区分PCR片段 插入的正反向，极大简化了克隆操作和筛选的步骤，大大降低了实验成本，在高 通量克隆构建中优势尤其突出。

附图说明

图1为一种中间载体pBP1载体图谱示意图。

图2为一种目的载体pDNB1载体图谱示意图。灰色框代表被切出来的XcmI盒； 白色框代表cat读码框。

具体实施方式

实例1：

中间载体pBP1构建：

1)利用特异性引物(正向引物：SEQ ID No：2，反向引物：SEQ ID No：3)以pUC18 载体(TAKARA公司购买)为模板用高保真DNA聚合酶KOD-Plus-Neo (TOYOBO公司购买)扩增包括Amp抗性基因、复制子，lac启动子元件的载 体框架(扩增体系为：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μl，2mM dNTPs 5μl， 25mM MgSO₄ 3μl，10μM正向引物1μl，10μM反向引物1μl，pUC18 DNA  100ng，超纯水加到最后体系为50μl，最后加KOD-Plus-Neo 1U)，利用商业化的 PCR回收试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)纯化后得到载体框架片段， 然后用识别片段两端限制性位点的内切酶BglII(TAKARA公司购买)和KpnI (TAKARA公司购买)对载体框架片段进行酶切，并回收相应片段；

2)利用特异性引物(正向引物：SEQ ID No：4，反向引物：SEQ ID No：5)以 pACYC184质粒(New England Biolabs公司购买)为模板用高保真DNA聚合酶 KOD-Plus-Neo(TOYOBO公司购买)扩增cat基因的读码框(扩增体系为：10×PCR  Buffer for KOD-Plus-Neo 5μl，2mM dNTPs 5μl，25mM MgSO₄ 3μl，10μM正向 引物1μl，10μM反向引物1μl，pACYC184 DNA 100ng，超纯水加到最后体系 为50μl，最后加KOD-Plus-Neo 1U)，利用商业化的PCR回收试剂盒(北京百泰 克生物技术有限公司)纯化，利用识别cat基因的读码框两端的内切酶BglII (TAKARA公司购买)和KpnI(TAKARA公司购买)对片段进行酶切，并利用 商业化DNA凝胶回收试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)回收酶切后的片 段；

3)将步骤1)和步骤2)获得的回收后的片段以适当比例(摩尔比为1∶3)混 合，在T4 DNA连接酶作用下形成闭合环状分析，后转入大肠杆菌DH5α (TAKARA公司购买)感受态细胞，用Amp筛选获得阳性克隆，从中提取质粒 并测序鉴定，得到中间载体pBP1(图1)。

实例2：

一种无背景定向克隆PCR产物的载体pDNB1的构建：

1)设计、合成800bp左右的XcmI盒，其包含PstI识别位点、XcmI识别位点、 lac启动子，ccdB负筛选标记基因、XcmI识别位点、SphI识别位点等特征，序 列见序列列表SEQ ID No：1；

2)将XcmI盒用PstI(TAKARA公司购买)和SphI(TAKARA公司购买)进行 酶切，并利用商业化DNA凝胶回收试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)回 收酶切后的片段；

3)将中间载体pBP1用PstI(TAKARA公司购买)和SphI(TAKARA公司购买) 酶切，并利用商业化DNA凝胶回收试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)回 收酶切后的片段；

4)将酶切回收的XcmI盒和酶切回收后的中间载体pBP1以适当比例(摩尔比为 3∶1)混合，在T4DNA连接酶作用下形成闭合环状分析，后转入大肠杆菌DB3.1 (Invitrogen公司购买)感受态细胞，用Amp筛选获得阳性克隆，从中提取质粒 并测序鉴定，得到目的载体pDNB1(图2)。

实例3：

一种无背景定向克隆PCR产物的载体在TA连接克隆上的应用：

1)用限制性内切酶XcmI(New England Biolabs公司购买)处理pDNB1质粒， 3h后电泳回收得到2.5kb左右的线性质粒载体，即命名为pDNB-T，即为可以直 接进行PCR片段TA克隆的T载体；

2)利用特异性引物(正向引物：SEQ ID No：6，反向引物：SEQ ID No：7)以大 肠杆菌K12(山东大学祁庆生教授惠赠)菌株基因组为模板，用Taq酶(从北京 鼎国生物技术有限责任公司购买)扩增出280bp左右的SD-lacZa-1片段(扩增 体系为：10×Taq Buffer 5μl，2mM dNTPs 5μl，10μM正向引物1μl，10μM反 向引物1μl，大肠杆菌K12基因组100ng，超纯水加到最后体系为50μl，最后加 Taq酶1U)，利用商业化的PCR回收试剂盒纯化后得到载体框架片段；

3)将回收纯化的SD-lacZa-1与pDNB-T以适当比例混合(摩尔比为5∶1)，用 T4 DNA连接酶，连接产物转化大肠杆菌DH5α(TAKARA公司购买)，涂布 LB+Amp+Cm+Xgal+IPTG平板，37℃培养过夜；

4)转化克隆在含有IPTG和Xgal的平板上长出102个克隆，所有克隆均呈现蓝 斑，证明所有片段均正向插入，且阳性率达到100％，挑取20个克隆进行PCR 验证结果均表明克隆为SD-lacZa-1正向插入，克隆的阳性率达到100％。

实例4：

一种无背景定向克隆PCR产物的载体在平末端连接克隆上的应用：

1)按照实例3中的方法制备pDNB-T载体；

2)用T4DNA聚合酶在含有dNTP的条件下补平pDNB-T的dT尾，形成pDNB-B；

3)利用特异性引物(正向引物：SEQ ID No：6，反向引物：SEQ ID No：7)以大 肠杆菌K12菌株基因组为模板，用高保真DNA聚合酶KOD-Plus-Neo(TOYOBO 公司购买)扩增出280bp左右的SD+lacZa-2片段(扩增体系为：10×PCR Buffer  for KOD-Plus-Neo 5μl，2mM dNTPs 5μl，25mM MgSO₄ 3μl，10μM正向引物 1μl，10μM反向引物1μl，大肠杆菌K12基因组100ng，超纯水加到最后体系 为50μl，最后加KOD-Plus-Neo 1U)，利用PCR回收试剂盒纯化后得到载体框 架片段；

4)将回收纯化的SD+lacZa-2与pDNB-B以适当比例混合(摩尔比为5∶1)，用 T4DNA连接酶，连接产物转化大肠杆菌DH5α(TAKARA公司购买)，涂布 LB+Amp+Cm+Xgal+IPTG平板，37℃培养过夜；

5)转化克隆在含有IPTG和Xgal的平板上长出480个克隆，所有克隆均呈现蓝 斑，证明所有片段均正向插入，且阳性率达到100％，挑取20个克隆进行PCR 验证结果均表明克隆为SD-lacZa-2正向插入，克隆的阳性率达到100％。

SEQUENCE LISTING

<110>  中国科学院武汉病毒研究所

<120>  一种可无背景定向克隆PCR产物的载体及其制备和应用

<130>  一种可无背景定向克隆PCR产物的载体及其制备和应用

<160>  7    

<170>  PatentIn version 3.1

 

<210>  1

<211>  813

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  1

aaactgcagc cattcctaag ctgggtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga     60

aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag    120

aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc    180

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca    240

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg    300

ttggcgggtg tcggggctgg cttaaggtac cttatattcc ccagaacatc aggttaatgg    360

cgtttttgat gtcattttcg cggtggctga gatcagccac ttcttccccg ataacggaga    420

ccggcacact ggccatatcg gtggtcatca tgcgccagct ttcatccccg atatgcacca    480

ccgggtaaag ttcacgggag actttatctg acagcagacg tgcactggcc agggggatca    540

ccatccgtcg cccgggcgtg tcaataatat cactctgtac atccacaaac agacgataac    600

ggctctctct tttataggtg taaaccttaa actgcatatg tatatctcct tcttaaagtt    660

aaacaaaatt atttgaattc tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc    720

tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc    780

cagtcgggaa ccattccaga tctggcatgc ttt                                 813

 

<210>  2

<211>  79

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  2

tttagatcta agcttgcgca tgcacagctg cagtcgacgg atccatatga attctccaca     60

caacatacga gccggaagc                                                  79

 

<210>  3

<211>  40

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  3

aaaggtacct taagccagcc ccgacacccg ccaacacccg                           40

 

<210>  4

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  4

gcgagatctg agaaaaaaat cactgg                                          26

 

<210>  5

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  5

attggtacct tacgccccgc cctgc                                           25

 

<210>  6

<211>  38

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  6

ggagaaggaga tatacatatg accatgatta cggattc                              38

 

<210>  7

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  7

ccttcagacg acagtatcgg cct                                             23